Бактериальные ДНК-полимеразы

Из всех ДНК-полимераз E. coli наиболее высокий внутриклеточный уровень (~ 400 молекул на клетку) имеет ДНК-полимераза I, кодируемая существенным геном polA. Она состоит из одной субъединицы длиной 928 остатков, которую можно разделить на три домена (N-концевую треть молекулы занимает (5'3') - экзонуклеазный домен, в центре расположен самый короткий (3'5') - экзонуклеазный домен, а самый большой полимеразный домен находится на С-конце. При ограниченном протеолизе ДНК-полимеразы I расщепление на границе между первыми доменами дает малый N-концевой 5'-нуклеазный фрагмент и большой С-концевой фрагмент, который называется кленовским фрагментом. Последний сохраняет 3'-нуклеазную и полимеразную активность и часто используется для синтеза ДНК in vitro.

(3'5') - экзонуклеазный домен, ответственный за корректорскую активность ДНК-полимеразы I, не является обязательным и отсутствует у бактерий из родов Thermus и Rickettsia. Остальные два домена жизненно важны для клеток и обеспечивают участие ДНК-полимеразы I в процессах репарации и удаления рибонуклеотидной части фрагментов Оказаки в отстающей нити. Поэтому делеция гена polA летальна для E. coli, а нелетальные мутации понижают в 10 раз скорость соединения фрагментов Оказаки и повещают чувствительность клеток к агентам, повреждающим ДНК.

14

Доменная структура ДНК-полимеразы I E. coli.

A - взаимное расположение доменов. I - 5'-нуклеазный домен, II - (3'5') - экзонуклеазный домен, III - ДНК-полимеразный домен. Стрелка соответствует кленовскому фрагменту ДНК-полимеразы I.

B - мотивы полимеразного домена, консервативные среди бактериальных ДНК-полимераз I.

Эти мотивы имеют следующие консенсусные последовательности: ₆₉₉hhhhDhhxEhx₇₁₂ (A), ₇₅₄RpxxKxxxhGhhY₇₆₆ (B) и ₈₇₆hhxhHDЕhxxЕ₈₈₈ (С) - , где h - гидрофобный остаток, х - произвольный остаток, р - преимущественно R (нумерация остатков ДНК-полимеразы I E. coli)

Полимеразные домены различных ДНК-полимераз I и ДНК-полимеразы фага Т7 очень похожи друг на друга и содержат 6 консервативных участков, среди которых три аналогичны консервативным мотивам А, В и С главного семейства В эукариотических ДНК-полимераз и играют наиболее важную роль во время синтеза ДНК. Мотивы А и С ДНК-полимеразы I E. coli содержат кислые остатки асп₇₀₅ и асп₈₈₂ соответственно, связывающие катионы Mg⁺ в каталитическом активном центре (см. рис.1.1В), а мотив В включает инвариантный положительно заряженный остаток (арг₇₅₈) и ароматический остаток (тир₇₆₆). Эти три мотива являются элементами полости, с которой связывается включающийся дНТФ в активном полимеразном центре.

Рис. Модель трехмерной структуры полимеразного домена ДНК-полимеразы I E. coli.

Указаны положения, в которых начинаются консервативные мотивы А, В и С

Рентгеноструктурный анализ кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I E. coli впервые обнаружил специфическую архитектуру полимеразного домена, который по форме напоминает кисть правой руки (рис.1.7) и состоит из пространственных доменов "ладони" (palm), "большого пальца" (thumb) и "пальцев" (fingers). Аналогичную трехмерную организацию имеют и все изученные экспериментально полимеразные домены других ДНК-полимераз и обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека. Можно предположить, что так же организованы и полимеразные домены большинства ДНК-полимераз. Наиболее консервативна топология домена ладони, состоящего из -слоя, фланкированного двумя -спиралями. В домене ладони расположены консервативные мотивы А и С. Домены большого пальца и пальцев у ДНК-полимеразы I E. coli образованы -спиралями, причем спираль О домена пальцев совпадает с мотивом В. У других ДНК-полимераз организация этих доменов гораздо менее консервативна. Хотя домен больших пальцев остается преимущественно -спиральным, но тонкие детали его топологии неодинаковы. Еще более велики различия доменов пальцев. В целом, для архитектуры полимеразного домена характерно существование внутренней полости для связывания матрицы-затравки ДНК и входящего дНТФ, основанием которой является домен ладони.

На примере бактериальной ДНК-полимеразы I мы рассмотрим последовательные изменения конформации этой полости во время полимеразного каталитического цикла. Эти рентгеноструктурные данные были получены для нескольких свободных бактериальных полимераз и их комплексов с ДНК в присутствии и в отсутствие дНТФ. Вероятно, такие же изменения происходят во время работы других ДНК-полимераз. "Рабочий цикл" состоит из 4 последовательных стадий:

1) связывания ДНК-полимеразы с матрицей-затравкой ДНК;

2) связывания с комплексом полимераза-ДНК подходящего дНТФ, комплементарного первому остатку матрицы;

3) нуклеофильной атаки, приводящей к образованию фосфодиэфирной связи;

4) освобождения пирофосфата. Первые две стадии протекают очень быстро, и общую скорость полимеризации лимитирует стадия 3 или предшествующее ей изменение конформации.

Первая стадия сопровождается конформационными изменениями домена большого пальца, который поворачивается в сторону домена ладони. Одновременно изменяется положение спиралей Н1 и Н2 на конце большого пальца, которые сближаются с днДНК. В результате из домена большого пальца и прилежащей части домена ладони образуется цилиндрический канал диаметром 30 Е, охватывающий дуплекс ДНК. В нем аминокислотные остатки ДНК-полимеразы контактируют с ДНК по малой канавке. Взаимодействия с ДНК полимеразой вызывают изменения конформации как в днДНК (изгиб на расстоянии 3 п. н. от праймерного конца), так и однонитевой затравке, первый нуклеотид которой поворачивается на угол >90^о, а следующие основания - на 180^о. Этот переход матричной нити в S-образную конфигурацию смещает первый матричный нуклеотид с оси дуплекса ДНК, на которой вместо него оказывается остаток тир₇₆₆ спирали О домена пальцев.

Второе изменение конформации происходит после связывания дНТФ и в основном затрагивает домен пальцев и смежную область домена ладони. Домен пальцев поворачивается в сторону 3'-конца затравки, а его О-спираль с мотивом В вращается на 40^о в сторону двух остатков асп каталитического центра. В результате сайт связывания дНТФ переходит из "открытой" формы в "закрытую". Первый остаток матрицы возвращается на ось днДНК, вытесняя с нее остаток Y766, сохраняющий стэкинг-взаимодействие с этим матричным нуклеотидом. В "закрытой" форме входящий дНТФ образует уотсон-криковскую пару с первым матричным основанием. В стабилизации этой пары участвуют также взаимодействие ароматических колец остатков фен и тир с мотиве В с азотистым основанием дНТФ и гидрофобные взаимодействия боковых цепей остатков или и глу с дезоксирибозой. Положительно заряженный остаток арг₇₅₈ мотива В взаимодействует с отрицательно заряженным трифосфатом дНТФ, а остатки асп₇₀₅ и асп₈₈₂ активного центра в домене ладони при участии двух катионов Mg²⁺ устанавливают правильную геометрию трифосфата дНТФ, необходимую для нуклеофильной атаки 3'-концом затравки (см. рис.1.1В). Таким образом, замкнутая структура белка, удерживающая в правильной конфигурации пару дНТФ-матричное основание, создается конформационными изменениями ДНК полимеразы в соответствии с моделью индуцированного соответствия.

После включения очередного нуклеотида в растущую цепь ДНК полимераза возвращается в "открытую" форму, транслоцируется к следующему положению матрицы и освобождает пирофосфат. В освобождении пирофосфата важную роль играет взаимодействие остатков арг и лиз в О-спирали с - и -фосфатными группами. Изменение положения этих основных остатков во время перехода в открытую форму способствует удалению пирофосфата из каталитического центра и предотвращает обратную реакцию пирофосфоролиза ДНК.

ДНК-полимераза II E. coli

ДНК-полимераза II (PolII), кодируемая геном polB (dinA), является единственной из ДНК-полимераз E. coli, относящимся к полимерзному семейству В, в которое входят преимущественно эукариотические ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза II состоит из N-концевого (3'5') - экзонуклеазного домена (остатки 1-278) и более длинного С-концевого полимеразного домена и не обладает 5'-экзонуклеазной активностью. Она имеет 6 областей гомологии с эукариотическими ДНК-полимеразами . Второй особенностью PolII является то, что ее ген контролируется белком-репрессором LexA и входит в SOS-регулон, индуцируемый повреждениями ДНК. Базальный уровень ДНК-полимеразы довольно высок (50 молекул на клетку) и повышается в 7 раз в УФ-облученных клетках E. coli, становясь сравнимым с уровнем ДНК-полимеразы I.

Хотя ДНК-полимераза II открыта в 1970-е годы и давно охарактеризована биохимически, ее физиологические функции не выяснены до конца. Делеция гена polB не является летальной. Фенотипы мутантов polB показали, что PolII может участвовать в репарации повреждений ДНК, индуцированных УФ-светом и окислительным стрессом, а также межнитевых сшивок ДНК и апуриновых сайтов. Получены также косвенные доказательства участия PolII в репликации половой F-эписомы и способности PolII при определенных условиях конкурировать с ДНК-полимеразой III в репликации хромосомы E. coli. Хотя ДНК-полимераза II в присутствии вспомогательных субъединиц ДНК-полимеразы III может вести с высокой процессивностью синтез ДНК in vitro, вряд ли PolII может полностью реплицировать бактериальную хромосому in vivo. Таким образом, ДНК-полимераза II не является основной репликазой, а участвует в основном в репаративных процессах, например, в повторном старте репликативных вилок, остановившихся на повреждениях ДНК (гл.00).

ДНК-полимераза III E. coli

Главной репликативной ДНК-полимеразой E. coli является многосубъединичный комплекс ДНК-полимеразы III (PolIII). Самая большая каталитическая -субъединица PolIII длиной 1160 остатков кодируется существенным геном dnaE и содержится в клетках в ограниченном количестве (10-20 копий на клетку).

Большую часть молекулы белка DnaE (рис.1-8) занимает полимеразный домен, относящийся к особому бактериальному семейству С ДНК-полимераз. Белок DnaE содержит на самом С-конце (остатки 1000-1073) короткий домен связывания с нуклеиновыми кислотами, имеющий укладку типа ОВ. Семейство белковых доменов ОВ включает домены связывания с антикодоном тРНК некоторых аминоацил-тРНК-синтетаз, домен геликазы RecG, участвующей в репарации ДНК, и домены связывающих онДНК белков SSB бактерий и RF-A эукариотов (см. 2.2).

N-концевая область DnaE (остатки 1-210) состоит из N - и С-доменов (остатки 1-70 и 80-210 соответственно), гомологичных доменам РНР семейства фосфоэстераз - ферментов, гидролизующих фосфоэфирные связи по механизму, зависящему от катионов металлов. Фосфоэстеразная (фосфатазная) активность DnaE потенциально могла бы участвовать в гидролизе пирофосфата - продукта реакции синтеза ДНК. Удаление пирофосфата должно препятствовать обратной реакции пирофосфоролиза ДНК и сдвигать равновесие реакции, катализируемой ДНК-полимеразами, в сторону полимеризации. Однако у большинства известных бактериальных ДНК-полимераз фосфоэстеразный активный центр доменов РНР разрушен заменами аминокислотных остатков, делециями или вставками. Поэтому домены РНР не обладают фосфатазной или 5'-нуклеазной активностью. Сохранение таких мотивов не только у бактериальных ДНК-полимераз III, но и у ДНК-полимераз эукариотов и археев позволило предположить, что они играют существенную роль. И действительно, делеция N-концевых 60 остатков белка DnaE существенно понижает активность PolIII. Высказано предположение, что древние каталитически неактивные фосфоэстеразные домены РНР могут связывать пирофосфат и аллостерически регулировать активность PolIII.

Рис.1.8 Домены больших субъединиц бактериальных ДНК-полимераз III. A - ДНК-полимеразы DnaE E. coli и Bac. subtilis, B - ДНК-полимераза PolC Bac. subtilis.1 и 2 - N - и С-концевая часть фосфоэстеразного домена, 3 - ДНК-полимеразный домен, 4 - С-концевой домен с укладкой РНР для связывания с ДНК. У ДНК-полимеразы PolC N-концевая часть фосфоэстеразного домена разорвана вставкой (3'5') - экзонуклеазного домена 5

-Субъединица ДНК-полимеразы E. coli не имеет ни 5'-экзонуклеазного, ни (3'5') - экзонуклеазного доменов. Тем не менее, PolIII проявляет высокую точность синтеза ДНК и обладает корректорской (3'5') - экзонуклеазной активностью. Она обусловлена другой, -субъединицей - белком длиной 243 остатка, который кодируется геном dnaQ и содержит 6 областей гомологии с (3'5') - экзонуклеазными доменами других ДНК-полимераз. Для экзонуклеазной активности существенны 3 первые области гомологии в N-концевой части белка DnaQ. Его N-концевой фрагмент длиной 186 остатков проявляет полную экзонуклеазную активность, но не взаимодействует с -субъединицей PolIII. Для такого связывания необходим С-концевой домен -субъединицы длиной 57 остатков. Физическая нековалентная ассоциация субъединиц и абсолютно необходима для корректорской функции всего комплекса ДНК-полимеразы III. Субъединицы и , вместе с самой маленькой субъединицей , кодируемой геном holE, образуют минимальный фермент, или сердцевину, ДНК-полимеразы III E. coli. В нем -субъединица взаимодействует с субъединицами и , причем во взаимодействии с участвует N-концевой домен . Биохимические функции субъединицы в минимальном ферменте PolIII пока не установлены.

Грамположительные бактерии с низким содержанием ГЦ в ДНК (например, сенная палочка Bacillus subtilis) имеют не одну, а две ДНК-полимеразы III семейства С. Одна из них наиболее гомологична -субъединице PolIII E. coli и названа DnaE. Она также не имеет (3'5') - экзонуклеазного домена. Однако в геноме Bac. subtilis не найден гомолог гена dnaQ E. coli. Пока не ясно, как обеспечивается корректорская функция этой ДНК-полимеразы. Возможно, для этого используется какая-то (3'5') - экзонуклеаза, не гомологичная белку DnaQ E. coli. Вторая репликативная ДНК-полимераза у Bac. subtilis, кодируемая геном polC, названа PolC. Белок PolC содержит гомологичный белку DnaQ (3'5') - экзонуклеазный домен, встроенный в N-мотив РНР (рис.1.8), и сам обладает корректорской экзонуклеазной активностью. Можно предположить, что общий предок бактериальных ДНК-полимераз семейства С, подобно ДНК-полимеразам семейства В, имел (3'5') - экзонуклеазный домен, ковалентно связанный с полимеразным доменом. Этот корректорский домен остался перманентно ассоциированным с полимеразным доменом у ДНК-полимераз PolC грамположительных бактерий и обособился в самостоятельную субъединицу DnaQ у ДНК-полимераз DnaE грамотрицательных бактерий.

Наиболее сложным ансамблем ДНК-полимеразы III E. coli, участвующим в репликации хромосомы, является холофермент PolIII, состоящий из 10 разных субъединиц (, , , , ', , , , и ), кодируемых 9 генами. Из клеток E. coli были выделены три разных полимеразных субкомплекса:

1) минимальный фермент ;

2) ансамбль III', содержащий два сердцевинных субкомплекса, прикрепленных к димеру субъединицы (₂₂₂₂);

3) субкомплекс III*, состоящий из 9 разных субъединиц (₂₂₂₂). Субкомплекс III* отличается от полного холофермента только отсутствием 4 субъединиц . Общая организация холофермента PolIII представлена на рис.1.9

Субкомплексы PolIII синтезируют ДНК с низкой скоростью (10-20 н. /сек) и степенью процессивности, равной 10-50. -Субъединица, кодируемая геном dnaN, является вспомогательным фактором (скользящим зажимом PolIII), обеспечивающим более высокую скорость синтеза (750 н. /сек) и процессивность. Включение -субъединицы в холофермент осуществляется погрузчиком скользящего зажима - -комплексом ₂₁'₁₁₁. Функции -субъединицы и -комплекса будут рассмотрены отдельно (см.1.4). Пока ограничимся только функциями субъединицы , играющей роль платформы для сборки и поддержания общей структуры холофермента PolIII.

Рис. Общая схема организации холофермента ДНК-полимеразы III E. Coli

Субъединицы и ("белки DnaX") кодируются одним и тем же геном dnaX и являются альтернативными продуктами трансляции его мРНК. Полноразмерным продуктом трансляции является субъединица длиной 643 аминокислотных остатка. Во внутренней области мРНК dnaX имеется сайт трансляционного сдвига рамки - "скользкая" последовательность из 6 смежных остатков A, за которой расположена стабильная шпилечная структура. На таком сайте рибосомы часто (с вероятностью 10-20%) проскальзывают во время трансляции на один кодон назад, в 5'-сторону и продолжают трансляцию в новой открытой рамке считывания - 1. В мРНК dnaX в этой альтернативной рамке они декодируют только один кодон GAG глутаминовой кислоты, а затем попадают на стоп-кодон UAG, на котором трансляция терминируется. Продуктом такого рибосомного сдвига рамки является белок длиной всего 431 остаток. За исключением С-концевого остатка глу, он идентичен N - концевым 2/3 субъединицы .

Указано положение скользкой последовательности AAAAAA и начала стабильной шпильки мРНК. *** - терминация трансляции на кодоне UGA в рамке считывания - 1

14

Рис. Доменная организация субъединиц (А) и (В) холофермента ДНК полимеразы III E. coli.

Указаны области субъединицы , участвующие в связывании субъединицы холофермента ДНК-полимеразы III и ДНК-геликазы репликативной вилки DnaB, а также область субъединицы для связывания комплексов ' и . RFC - участки гомологии с субъединицами эукариотического фактора RFC

Ограниченный протеолиз полноразмерного продукта гена dnaX позволил разбить его на 5 доменов (рис.1.11). Первые три домена являются общими для субъединиц и . N-концевая область 1 образует АТФазный домен, функции которого мы рассмотрим при анализе работы комплекса скользящего зажима (см.1.4). Общая центральная область 3 содержит участки взаимодействия, необходимые для образования димера субъединиц и для связывания с ним -субъединицы. С этой областью в белке ассоциируются остальные субъединицы комплекса погрузчика. Белки и прямо связываются с . В свою очередь субъединицы и образуют субкомплексы со стехиометрией 1: 1 с субъединицами ' и соответственно и служат мостиками между ' и и белком . Связывание субкомплекса повышает сродство к субкомплексу '.

Два последних домена (4 и 5) целиком имеются только у белка . С-концевой домен 5 длиной 147 остатков играет наиболее важную роль в образовании димерной ДНК-полимеразы III. В димере ₂ каждая из субъединиц связывает по одной субъединице сердцевины PolIII. Такое взаимодействие обеспечивает ассоциацию двух ДНК-полимераз, одна из которых участвует в синтезе ведущей, а вторая - в синтезе отстающей нити ДНК в реплисоме. Домен 4 состоит из короткой N-концевой части, имеющейся у белков и , и уникальной С-концевой части длиной 66 остатков, имеющейся только у белка . Именно с этой уникальной областью и связывается ДНК-геликаза репликативной вилки - белок DnaB (см.2.1). Во взаимодействии ДНК-полимеразы III с гексамерным белком DnaB участвуют обе субъединицы димера ₂. Это обеспечивает дополнительную связь между ДНК-полимеразами ведущей и отстающей нитей, важную для динамики репликативного комплекса.