Реплікація дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК)

Реплікація дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК)

Введення

Здатність кліток підтримувати високу впорядкованість своєї організації залежить від генетичної інформації, яка зберігається у формі дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК). ДНК - це речовина, з якої полягають гени. Розмноження живих організмів, передача спадкових властивостей з покоління в покоління і розвиток багатоклітинного організму із заплідненої яйцеклітини можливі тому, що ДНК здатна до самовідтворенню. Сам процес самовідтворення ДНК називається реплікацією. Іноді використовують також назва-синонім - редуплікація.

Матричний синтез ДНК

Як відомо, генетична інформація записана в ланцюзі ДНК у вигляді послідовності нуклеотідних залишків що містять одна з чотирьох гетероциклічних підстав: аденін (A), гуанін (G), цитозін (C) і тімін (T).

Запропонована Дж. Уотсоном і Ф. Кріком в 1953 році модель будови ДНК у формі регулярної подвійної спіралі відразу же дозволила зрозуміти принцип подвоєння ДНК. Інформаційний зміст обох ланцюгів ДНК ідентичний, оскільки кожна з них містить послідовність нуклеотідов, строго відповідну послідовності іншого ланцюга. Це відповідність досягається завдяки наявності водневих зв'язків між направленими назустріч один одному підставами двох ланцюгів - попарно G і C або A і T. Описуючи цю властивість подвійної спіралі, молекулярні біологи говорять, що ланцюги ДНК комплементарни за рахунок утворення уотсон-кріковських пар GPC і APT. Оскільки два ланцюги мають протилежну спрямованість, їх називають антипаралельними. Легко уявити, що подвоєння ДНК відбувається унаслідок того, що ланцюги розходяться, а потім кожен ланцюг служить матрицею, на якій збирається комплементарна їй новий ланцюг Днк‚ в результаті утворюються дві дочірні двуспіральниє молекули, ідентичні по будові батьківської ДНК. Кожна з них складається з одного ланцюга початкової батьківської молекули ДНК і одній знов синтезованому ланцюгу. Такий механізм реплікації ДНК, при якому від одного покоління до іншого передається одна з двох ланцюгів, складових батьківську молекулу ДНК, отримав назву напівконсервативного і був експериментально доведений в 1958 році М. Мезельсоном і Ф. Сталь. Крім того, для синтезу ДНК характерні антипаралельність і уніполярность. Кожен ланцюг ДНК має певну орієнтацію. Один кінець несе гідроксильну групу (ВІН), приєднану до 3'-углероду в цукрі дезоксирібозе, на іншому кінці ланцюга знаходиться залишок фосфорної кислоти в 5'-положении цукру. Дві комплементарні ланцюги в молекулі ДНК орієнтовані в протилежних напрямах - антіпараллельно (при паралельній орієнтації напроти 3'-конца одного ланцюга знаходився б 3'-конец інший). Ферменти, що синтезують нові нитки ДНК, звана ДНК-полімеразамі, може пересуватися уздовж матричних ланцюгів лише в одному напрямі - від їх 3'-концов до 5'-концам. При цьому синтез комплементарних ниток завжди ведеться в 5' - 3' напрямі, тобто уніполярний. Тому в процесі реплікації одночасний синтез нових ланцюгів йде антіпараллельно. ДНК-полімерази може давати "задній хід", тобто рухатися у напрямі 3' - 5'. Якщо останнє додане при синтезі нуклеотідноє ланка виявилася некомплементарною нуклеотіду матричного ланцюга, воно буде заміщено комплементарним нуклеотідом. Відщепивши "неправильний" нуклеотід, ДНК-полімераза продовжує синтез в 5' - 3' напрямі. Така здібність до виправлення помилок отримала назву коректорської функції ферменту (див. нижчий).

ДНК-полімерази

У 1957 році А. Корнберг виявив у кишкової палички фермент, що каталізує процес полімеризації ДНК з нуклеотідов. Фермент був названий ДНК-полімеразой. Потім ДНК-полімерази виявила і в інших організмах. Було показано, що субстратами всіх цих ферментів служать дезоксирібонуклеозідтріфосфати (днтф), що полімеризуються на одноцепочечной ДНК-матриці. ДНК-полімерази послідовно нарощує одноцепочечную ланцюг ДНК, крок за кроком приєднуючи до неї наступні ланки в напрямі від 5-' до 3'-концу, причому вибір чергового днтф диктується матрицею. Приєднання кожного нового нуклеотідного залишку до 3'-концу ланцюга, що росте, супроводжується гідролізом багатою енергією зв'язку між першим і другим фосфатними залишками в ДНТФ і відщеплюванні пірофосфата, що робить реакцію в цілому енергетично вигідною.

У клітках зазвичай присутньо декілька типів ДНК-полімераз, що виконує різні функції і що мають різна будова: вони можуть бути побудовані з різної кількості білкових ланцюгів (суб'едініц). Проте всі вони працюють на будь-яких послідовностях нуклеотідов матриці; завдання цих ферментів - створення точної копії кожної матриці.

Точність синтезу ДНК і механізм корекції

Генетичний матеріал живих організмів має величезні розміри і репліцируєтся з високою точністю. У середньому в процесі відтворення генома ссавця, що складається з ДНК завдовжки 3 млрд пар нуклеотідов виникає не більше трьох помилок. При цьому ДНК синтезується надзвичайно швидко (швидкість її полімеризації коливається в межах від 500 нуклеотідов/с у бактерій до 50 нуклеотідов/с у ссавців). Висока точність реплікації, разом з її високою швидкістю, забезпечується наявністю спеціальних механізмів, що здійснюють корекцію, тобто що знімають помилки. Суть механізму корекції полягає в тому, що ДНК-полімерази двічі перевіряють відповідність кожного нуклеотіда матриці: один раз перед включенням його до складу ланцюга, що росте, другого раз перед включенням наступного нуклеотіда. Черговий фосфодіефірная зв'язок синтезується лише в тому разі якщо останній (3'-концевой) нуклеотід ланцюга ДНК, що росте, утворив правильну уотсон-кріковськую пару з відповідним нуклеотідом матриці. Якщо ж на попередній стадії реакції відбулося помилкове спаровування підстав, то подальша полімеризація зупиняється до тих пір, поки помилка не буде виправлена. Для цього фермент переміщається у зворотному напрямі і вирізує останню додану ланку, після чого його місце може зайняти правильний нуклеотід попередник. Іншими словами, багато (але не все) ДНК-полімерази володіють крім 5'-3'-синтетической активності, ще і 3'-гидролизующей активністю, яка забезпечує видалення помилково спарених з матрицею нуклеотідов.

Основні принципи реплікації

Основні правила, відповідно до яких відбувається реплікація, були з'ясовані в дослідах з бактеріями проте вони справедливі також і для вищих організмів. Ініціація ланцюгів ДНК ДНК-полімерази не можуть починати синтез ДНК на матриці, а здатні тільки додавати нові дезоксирібонуклеотідниє ланки до 3'-концу вже наявного полінуклеотідной ланцюга. Такий заздалегідь освічений ланцюг до якої додаються нуклеотіди, називають приманкою. Коротку РНК-затравку синтезує з рібонуклеозідтріфосфатов фермент, що не володіє активністю, що коректує, і званий ДНК-ПРАЙМАЗОЙ (англ. primer приманка). Праймазная активність може належати або окремому ферменту, або одній з суб'едініц ДНК-полімерази. Приманка, синтезована цим неточним ферментом, що не уміє виправляти помилки відрізняється від решти новосинтезірованной ланцюга ДНК, оскільки складається з рібонуклеотідов і далі може бути видалена.

Розмір рібонуклеотідной приманки невеликий (менше 20 нуклеотідов) порівняно з розміром ланцюга ДНК утворюваною ДНК-полімеразой. Що виконала свою функцію РНК-затравка віддаляється спеціальним ферментом, а утворений при цьому пролом закладається ДНК-полімеразой, що використовує як приманку 3'-ОН-конец сусіднього фрагмента Оказаки (див. нижчий). Видалення крайніх Рнк-праймеров, комплементарних 3'-концам обох ланцюгів лінійної материнської молекули ДНК, приводить до того, що дочірні ланцюги виявляються коротшими на 10 - 20 нуклеотідов (у різних видів розмір РНК-затравок різний). У цьому полягає "проблема недореплікациі кінців лінійних молекул". У разі реплікації кільцевої бактерійної ДНК цієї проблеми не існує, оскільки перші по часу утворення РНК-затравки віддаляються ферментом, який одночасно заповнює пролом, що утворюється шляхом нарощування 3'-ОН-конца ланцюга ДНК, направленої в "хвіст" праймеру, що видаляється, що росте. Проблема недореплікациі 3'-концов лінійних молекул ДНК вирішується еукаріотічеськимі клітками за допомогою спеціального ферменту - теломерази.

Робота теломерази

У 1985 році теломераза була виявлена у равнореснічной інфузорії Tetrahymena thermophila, а згодом - у дріжджах, рослинах і тваринах, зокрема в яєчниках людини і імморталізованних (безсмертних) лініях ракових кліток Hela. Теломераза є ДНК-полімеразой, що добудовує 3'-концы лінійних молекул ДНК хромосом короткими (6 - 8 нуклеотідов) послідовностями, що повторюються (у хребетних TTAGGG). Згідно номенклатурі цей фермент називають ДНК-УКЛЕОТІДІЛЕКЗОТРАНСФЕРАЗОЙ або теломерной термінальною трансферазой.

Крім білкової частини теломераза містить РНК, що грає роль матриці для нарощування ДНК повторами. Довжина теломеразной РНК коливається від 150 нуклеотідов у простих до 1400 нуклеотідов у дріжджів, у людини - 450 нуклеотідов. Сам факт наявності в молекулі РНК послідовності, по якій йде матричний синтез шматка ДНК дозволяє віднести теломеразу до своєрідної зворотної транськріптазе, тобто ферменту, здатному вести синтез ДНК по матриці РНК.

Через те що після кожної реплікації дочірні ланцюги ДНК виявляються коротшими материнських на розмір першого Рнк-праймера (10 - 20 нуклеотідов), утворюються виступаючі однонітевиє 3'-концы материнських ланцюгів. Вони-то і пізнаються теломеразой, яка послідовно нарощує материнські ланцюги (у людини на сотні повторів) використовуючи їх 3'-ОН-концы як приманки, а РНК, що входить до складу ферменту, як матриця. Довгі одноцепочечниє кінці, що утворюються, служать матрицями для синтезу дочірніх ланцюгів по традиційному реплікатівному механізму.

Поступове укорочення ДНК-хромосоми під час реплікації є одній з теорій "старіння" клітинних колоній. Ще в 1971 році вітчизняний учений А. М. Оловников в своїй теорії маргинотомії (лат. marginalis краєвий; tome перетин) припустив, що це явище лежить в основі обмеженого потенціалу подвоєння, спостережуваного у нормальних соматичних кліток, що ростуть в культурі in vitro, так званого "ліміту Хейфліка". Американський вчений Леонард Хейфлік на початку 60-х років показав, що якщо для культивування узяти клітки новонароджених дітей, то вони можуть пройти 80 - 90 ділень, тоді як соматичні клітини від 70-річних діляться тільки 20 - 30 раз. Обмеження на число клітинних ділень і називають лімітом Хейфліка. Розплітання подвійної спіралі ДНК Оскільки синтез ДНК відбувається на одноцепочечной матриці, йому повинно передувати обов'язкове розділення (хоч би на якийсь час) двох ланцюгів ДНК. Дослідження, проведені на початку 60-х років на репліцирующихся хромосомах, виявили особливу, чітко обмежену область реплікації, що переміщається уздовж батьківської спіралі ДНК і що характеризується місцевою розбіжністю два її ланцюгів. Ця активна область із-за своєї Y-образной форми була названа вилкою реплікації. Саме у ній ДНК-полімерази синтезують дочірні молекули ДНК. З допомогою електронній мікроскопії репліцирующейся ДНК вдалося встановити, що область, яка вже репліцирована, має вид очка усередині нерепліцировавшейся ДНК. Важливо відзначити, що очко реплікації утворюється тільки в тих місцях молекули, де знаходяться специфічні нуклеотідниє послідовності. Ці послідовності, що отримали назву крапок почала реплікації, складаються приблизно з 300 нуклеотідов. У залежності від того, в одному або в двох напрямах відбувається реплікація (а це залежить від природи організму) очко містить одну або дві вилки реплікацій. Послідовний рух вилки реплікації приводить до розширенню очка.

Подвійна спіраль ДНК вельми стабільна; для того, щоб вона розкрилася, необхідні особливі білки. Спеціальні ферменти ДНК-ХЕЛІКАЗИ швидко рухаються по одиночному ланцюгу ДНК, використовуючи для переміщення енергію гідролізу АТФ. Зустрічаючи на шляху ділянку подвійної спіралі, вони розривають водневі зв'язки між підставами розділяють ланцюги і просувають вилку реплікації. Услід за цим з одиночними ланцюгами ДНК зв'язуються білки, що дестабілізують спіраль, які не дозволяють одиночним ланцюгам ДНК зімкнутися. При цьому вони не закривають підстав ДНК, залишаючи їх доступними для спаровування.

Не слід забувати, що комплементарні ланцюги ДНК закручені один навколо одного в спіраль. Отже, для того щоб вилка реплікації могла просуватися вперед, ще не подвоєна частина ДНК винна була б дуже швидко обертатися. Ця топологічна проблема вирішується шляхом освіти в спіралі свого роду "шарнірів" що дозволяють ланцюгам ДНК розкрутитися. Білки, що належать до особливого класу, звані ДНК-ТОПОЇЗОМЕРАЗАМІ вносять до ланцюга ДНК одно- або двухцепочечниє розриви, що дозволяють ланцюгам ДНК розділитися, а потім закладають ці розриви. Топоїзомерази беруть участь також в розчіпленні зачеплених двухцепочечних кілець, що утворюються при реплікації кільцевої двунітевих ДНК. За допомогою цих важливих ферментів подвійна спіраль ДНК в клітці може приймати "недокрученную" форму з меншим числом витків; у такій ДНК легше відбувається розбіжність двох ланцюгів ДНК у вилці реплікації.

Переривистий синтез ДНК

Легко уявити, що реплікація відбувається шляхом безперервного зростання нуклеотіда за нуклеотідом обидві нових ланцюгів у міру переміщення вилки реплікації; при цьому, оскільки два ланцюги в спіралі ДНК антіпараллельни один з дочірніх ланцюгів винен був би рости у напрямі 5' - 3', а інша - у напрямі 3' - 5'. У дійсності ж виявилось, що дочірні ланцюги ростуть тільки у напрямі 5' - 3', тобто завжди подовжується 3'-кінець приманки, а матриця прочитується ДНК-полімеразой у напрямі 3' - 5'. Це твердження може показатися несумісним з рухом вилки реплікації в одному напрямі, одночасним, що супроводжується прочитуванням двох антипаралельних ниток. Розгадка секрету полягає в тому, що синтез ДНК відбувається безперервно тільки на одному з матричних ланцюгів. На другому матричному ланцюзі ДНК синтезується порівняно короткими фрагментами (завдовжки від 100 до 1000 нуклеотідов), названими фрагментами Оказаки в честь їх ученого, що виявив. Знов освічений ланцюг, що синтезується безперервно, називається такою, що веде, а інша збирана з фрагментів Оказаки, - що відстає. Синтез кожного з цих фрагментів починається з РНК-затравки. Через деякий час РНК-затравки віддаляються, проломи забудовуються ДНК-полімеразой, а фрагменти зшиваються в один безперервний ланцюг ДНК спеціальним ферментом.

Кооперативна дія білків вилки реплікації

До цих пір ми говорили про участь окремих білків в реплікації так, немов вони працюють незалежно друг від друга. Тим часом велика частина цих білків об'єднана в крупний комплекс, який швидко рухається уздовж ДНК і погоджено здійснює процес реплікації з високою точністю. Цей комплекс порівнюють з крихітною "швейною машиною": "деталями" його служать окремі білки, а джерелом енергії - реакція гідролізу нуклеозідтріфос фатів. Спіраль розплітається ДНК-ХЕЛІКАЗОЙ; цьому процесу допомагають ДНК-ТОПОЇЗОМЕРАЗА ДНК, що розкручує ланцюги, і безліч молекул дестабілізуючого білка, що зв'язуються з обома одіночнимі ланцюгами ДНК. В області вилки на провідному і відстаючому ланцюзі діють дві ДНК-полімерази. На провідному ланцюзі ДНК-полімераза працює безперервно, а на тій, що відстає фермент час від часу перериває і знов відновлює свою роботу, використовуючи короткі РНК-затравки, ДНК-ПРАЙМАЗОЙ, що синтезуються. Молекула ДНК-ПРАЙМАЗИ безпосередньо пов'язана з ДНК-ХЕЛІКАЗОЙ, утворюючи структуру, звану праймосомой. Праймосома рухається в напрямі розкриття вилки реплікації і по ходу руху синтезує РНК-затравку для фрагментів Оказаки. У цьому ж напрямі рухається ДНК-полімераза провідного ланцюга і, хоча це важко представити, ДНК-полімераза тієї, що відстає ланцюги. Для цього, як вважають, остання накладає ланцюг ДНК, яка служить їй матрицею, саму на себе, що і забезпечує розворот ДНК-полімерази відстаючого ланцюга на 1800. Узгоджений рух двох ДНК-полімераз забезпечує координовану реплікацію обох ниток. У вилці реплікації одночасно працюють біля двадцяти різних білків (з яких ми назвали тільки частину), здійснюючи складний, високовпорядкований і енергоємний процес.

Узгодженість процесів реплікації ДНК і клітинного ділення

Еукаріотічеськая клітка перед кожним діленням повинна синтезувати копії всіх своїх хромосом. Реплікація ДНК еукаріотічеськой хромосоми здійснюється за допомогою розділення хромосоми на безліч окремих репліконов. Такі реплікони активуються не все одночасно, але клітинному діленню повинна передувати обов'язкова одноразова реплікація кожного з них. З сказаного ясно, що по хромосомі еукаріот в кожен момент часу може рухатися незалежно один від одного безліч вилок реплікацій. Зупинка просування вилки відбувається тільки при зіткненні з іншою вилкою, рухомою в протилежному напрямі, або по досягненні кінця хромосоми. В результаті вся ДНК хромосоми в короткий термін виявляється репліцированной. Після збірки на молекулі ДНК хромосомних білків кожна пара хромосом в процесі мітоза впорядковано розділяється по дочернім кліткам. Виводи Процес реплікації ДНК узгоджений з клітинним діленням і вимагає сумісної дії багатьох білків. У нім беруть участь: · ДНК-ХЕЛІКАЗА і дестабілізуючі білки; вони розплітають подвійну спіраль батьківської ДНК і формують вилку реплікації; · ДНК-полімерази, яка каталізує синтез полінуклеотідной ланцюга ДНК у напрямі 3' - 5', копіюючи в вилці реплікації матрицю з високим ступенем точності. Оскільки два ланцюги подвійної спіралі ДНК антіпараллельни, у напрямі 5' - 3' безперервно синтезується лише один з двох ланцюгів (ведуча); інша ланцюг (що відстає) синтезується у вигляді коротких фрагментів Оказаки. ДНК-полімераза здібна до виправлення власних помилок, але не може самостійно почати синтез нового ланцюга; · ДНК-ПРАЙМАЗА, що каталізує короткі молекули РНК-затравки. Згодом фрагменти РНК віддаляються, їх замінює ДНК;· теломераза, що закінчує побудову недореплікацированних 3'-концов лінійних молекул ДНК; · ДНК-ТОПОЇЗОМЕРАЗИ, що допомагають вирішити проблеми кручення і спутування спіралі ДНК; · ініциаторниє білки, що зв'язуються в крапці почала реплікації і сприяючі утворенню нового очка реплікації з однією або двома вилками. У кожній з вилок услід за ініциаторнимі білками до розплетеною ДНК приєднується білковий комплекс, що складається з ДНК-ХЕЛІКАЗИ і ДНК-ПРАЙМАЗИ (праймосома). До праймосоме додаються інші білки, і виникає "машина реплікації", яка і здійснює синтез ДНК.

Бібліографічний список

1. Фаворова О. О. Сохраненіє ДНК у ряді популяцій: реплікація ДНК |// Соросівський освітній журнал 1996.

2. Димшиц Г. М. Проблема реплікації кінців лінійних молекул і теломераза // Соросівський освітній журнал, 2000.