Объектом исследования послужили почвы, характерные для Астраханской области.

Проба 1 - почва лесная (дубовый лес), отобранная на севере Астраханской области. Данная почва не подвергается антропогенному воздействию человека; относится к алльвеально лугово-болотным глинистым, суглинистым почвам;

Проба 2 - почва Бэровских бугров, была отобрана в районе аэропорта. Данная почва не подвергается прямому антропогенному воздействию, но находится вблизи объектов, используемых человеком (аэропорт, дачи). Относится к бурым почвам.

Отбор проб проводился осенью, в безосадочный день, утром. Первоначальное визуальное описание отобранной почвы проводилось непосредственно после отбора.

Проба 1 обладает следующими свойствами: увлажненная, с большим количеством органики, легкая, без крупных комочков, темно-коричневого цвета.

Проба 2 серо-бурого цвета, с малым количеством органики, рассыпчатая, слабо увлажненная.

2.2.1 Методы отбора проб

Отбор проб проводится с учетом вертикальной структуры, неоднородности покрова почвы, рельефа и климата местности, а также с учетом особенностей загрязняющих веществ или организмов.

Отбор проб проводится на пробных площадках, закладываемых так, чтобы исключить искажение результатов анализов под влиянием окружающей среды. При необходимости получения сравнительных результатов пробы незагрязненных и загрязненных почв отбирают в идентичных естественных условиях.

При исследовании загрязнений почв сельскохозяйственных угодий патогенными организмами и вирусами пробы отбирают с пахотного горизонта с глубины от 0 до 5 см и от 5 до 20 см (ГОСТ17.4.3.01-83 - Общие требования к отбору проб).

В зависимости от цели исследования определяется размер пробной площадки.

При мощности горизонта или слоя свыше 40 см отбирают раздельно не менее 2 проб с различной глубины.

Масса объединенной пробы должна быть не менее 1 кг.

Отобранные пробы необходимо пронумеровать и зарегистрировать в журнале, указав следующие данные: порядковый номер и место взятия пробы, рельеф местности, тип почвы, целевое назначение территории, вид загрязнения, дату отбора.

Пробы должны иметь этикетку с указанием места и даты отбора пробы, номера почвенного разреза, почвенной разности, горизонта и глубины взятия пробы, фамилии исследователя.

Приготовление разведений.

Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или 0,85%- ном растворе NaCl (физрастворе). В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.

Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды - это 1-е разведение, 10-1. Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из не полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем той же пипеткой отбирают 1 мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку - получают 2-е разведение (10-2). Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата (Методические указания по количественному учету микроорганизмов, 2004).

Поверхностный посев.

Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную, чаще всего агаризованную, питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15-20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным шпателем на поверхности среды. После посева чашки Петри посещают в термостат крышками вниз (Методические указания по количественному учету микроорганизмов, 2004).

Питательные среды:

Для выделения и учета аммонийокисляющих бактерий (Й фаза нитрификации) используют среду Сориано и Укорера следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 - 0,5; KH2PO4 - 0,2; CaCl2*2H2O - 0,04; MgSO4*7H2O - 0,04; цитрат железа - 0,0005; раствор микроэлементов - 10 мл; 0,05%-ный раствор фенолового красного - 1 мл; агар - 15; вода дистиллированная. Раствор микроэлементов (мг/л): трилон Б - 500; FeSO4*7H2O - 200; ZnSO4*7H2O - 10; CuCl2*2H2O - 1; MnCl2*4H2O - 3; H3BO3 - 30; CoCl2*6H2O - 20; NiCl2*6H2O - 2; Na2MoO4*2H2O - 3; вода дистиллированная; рН среды 7,5-7,8.

Нитрифицирующие бактерии ЙЙ фазы выделяют на среде Ватсона и Уотербери следующего состава (г): NaNO2 - 0,07; MgSO4*7H2O - 0,1; CaCl2*6H2O - 0,006; K2HPO4 - 0,02; раствор микроэлементов - 1 мл; агар - 15; водопроводная вода - 700 мл; дистиллированная вода - 300 мл; рН среды после стерилизации - 7,5. Стерилизуют при 1 атм.

Для учета гетеротрофных нитрификаторов разведения почвенной суспензии высевают в чашках Петри на среду следующего состава (г/л): сухой питательный агар - 3,5; агар - 13,5; (NH4)2SO4 - 0,05; вода дистиллированная; рН 7,0-7,2. Посевы инкубируют при комнатной температуре в течение 5-10 дней (Бабьева, Зенова, 1989).

2.2.6 Изучение биологических свойств бактерий

Изучение культуральных свойств.

При анализе колоний на твердой питательной среды учитывается:

1. форма, размеры колоний

2. поверхность колонии, ее профиль и край

3. блеск, прозрачность и цвет колони

4. структура и консистенция колонии.

Рост колоний в жидкой среде более однообразен и сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка. Характеризуя рост, отмечают: степень помутнения (слабая, умеренная или сильная); особенности пленки (тонкая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая), а при образовании осадка - указывают плотность, рыхлость, слизистость или хлопьевидность его. Иногда рост в жидкой среде сопровождается появлением запаха, выделением газов, пигментацией. В любом случае, как при росте на плотной, так и в жидкой среде, отмечают возраст описываемой культуры, состав среды и температурный режим культивирования (Нетрусов, 2005).

Изучение морфологических свойств бактерий.

Техника окраски по Граму.

Приготавливают мазки, высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1 мин феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового). Затем краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на него на 1 мин раствор Люголя (до полного почернения мазка). Препарат, не промывая водой, обрабатывают 96%-ным спиртом в течение 15-20 с. Промыв водой, препарат окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1 мин. После этой обработки грамположительные микроорганизмы приобретают темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные окрашиваются лишь в цвет дополнительной окраски (фуксина).

Результаты окраски по Граму зависят от возраста культуры: в старых культурах мертвые клетки всегда окрашиваются грамотрицательно. Поэтому лучше использовать молодые односуточные культуры (Теппер, 1987).

Морфологическими признаками бактерий служат:

1. форма клеток (шаровидные, палочковидные и извитые); у палочковидных отмечают форму концов клеток (вогнутые, загругленные или усеченные); клетки могут быть одиночные, соединенные попарно, в цепочки или в виде пакетов;

2. размеры клеток в микрометрах (мкм) (поперечное сечение, длина палочки, диаметр шаровидных форм);

3. способность к спорообразованию и расположение в клетках спор (бациллярное, клостридиальное и плектридиальное);

4. наличие капсул и клеточных включений;

5. способность к движению и тип жгутикования (один жгутик - монотрих, пучок жгутиков на одном конце - лофотрих, пучки жгутиков на обоих концах клеток - амфитрих, по всей поверхности клетки - перитрих);

6. окраска по Граму и кислотоустойчивость (Желдакова, 2003).

Измерение объектов.

Измерять клетки микроорганизмов (в мкм) можно на фиксированных и живых препаратах с помощью шкалы окулярного микрометра - окулярной линейки. У кокков определяют диаметр клеток, у бактерий другой формы - длину и ширину.

Окулярная линейка - круглая стеклянная пластинка, посредине которой нанесена шкала делений (50 или 100 делений) общей длиной 5 мм. Вставляют окулярную линейку шкалой вверх на диафрагму окуляра, предварительно вывинтив линзу окуляра. Затем ставят препарат и определяют, скольким делениям линейки соответствует длина и ширина клетки. Измеряют не менее 10-20 клеток.

Чтобы рассчитать истинные размеры клеток, определяют цену деления окулярной линейки с помощью объектного микрометра. Последний представляет собой металлическую пластинку в форме предметного стекла с отверстием в центре; в отверстие помещено стекло с линейкой (шкала из 100 делений). Общая длина шкалы объектного микрометра - 1 мм, величина одного деления - 10 мкм (0,01 мм).

Для определения цены деления окулярной линейки объектный микрометр помещают вместо препарата на столик микроскопа и фокусируют изображение линейки при малом увеличении. Затем линейку перемещают в центр поля и меняют объектив на тот, при котором измеряли клетки. Передвигая столик микроскопа и поворачивая окуляр, устанавливают объектный и окулярный микрометры так, чтобы их шкалы были параллельны и одна перекрывала другую. Определение цены деления окулярного микрометра проводят по принципу нониуса, т. е. совмещают одну из черт шкалы окулярного микрометра с чертой объектного микрометра и находят следующее совмещение. Допустим, в двух делениях объектного микрометра (20 мкм) умещается пять делений окулярного микрометра, тогда одно деление окулярного микрометра при данном увеличении равняется 4 мкм (20:5). Зная, скольким делениям окулярной линейки соответствует длина и ширина изучаемых клеток, умножают цену деления окулярного микрометра на эти числа.

Полученные значения цены делений окулярной линейки справедливы только для данной системы окуляр - объектив (Теппер, 1987).

Изучение физиолого-биохимических свойств.

При изучении физиолого-биохимических признаков микроорганизмов исследуют: отношение их к источникам углерода и азота; продукты жизнедеятельности, накапливающиеся в среде (кислоты, спирты, газы); отношение к кислороду, щелочам и другим факторам внешней среды.

Среди биохимических свойств культуры особенно важно определение ее ферментативной активности.

Используемые для идентификации тесты весьма разнообразны, некоторые из них необходимы для идентификации многих групп бактерий, в других случаях их постановки не требуется. Постановка биохимических тестов требует особенной тщательности и внимания при приготовлении используемых сред, постоянного контроля за чистотой выделенной и идентифицируемой культуры, повторения (независимого) каждого теста не менее 2-х раз, использования при постановке тестов культур с заведомо положительной и заведомо отрицательной реакцией. Учет результатов при постановке физиолого-биохимических тестов проводится в течение 24-96 часов (Теппер, 1987).

Идентификацию микроорганизма облегчает проведение экспериментальных исследований, позволяющих изучить особые физиологические свойства, присущие микроорганизму.

Для обнаружения возбудителей Й фазы нитрификации проводят реакцию на аммоний с реактивом Несслера, а на азотистую кислоту - реактивом Грисса. При изучении возбудителей ЙЙ фазы нитрификации проводят пробу на азотистую кислоту реактивом Грисса и в случае отсутствия азотистой кислоты на азотную кислоту с дифениламином. При изучении гетеротрофных нитрификаторов проводят пробу на образование нитритов. Для этого на отдельные бактериальные колонии на агаре наносят по капле реактива Грисса. Покраснение указывает на образование нитритов из аммония, введенного в состав среды (Бабьева, Зенова, 1989).

· Реакция на нитриты с реактивом Грисса основана на образовании в кислой среде в присутствии нитритов и ароматических аминов (сульфофеноловой кислоты и б- нафтиламина) азосоединения, окрашенного в красно-розовый цвет. Для проведения реакции к капле реактива Грисса добавляют каплю культуральной жидкости. Появление красного окрашивания свидетельствует о присутствии нитритов. Параллельно проводят реакции со стерильной средой.

· Реакция на нитраты с дифениламином. На фарфоровую пластинку наносят каплю концентрированной серной кислоты, помещают в нее несколько кристаллов дифениламина и после его растворения добавляют каплю исследуемой жидкости. При наличии ионов NO3- жидкость окрашивается в темно-синий цвет. Следует иметь в виду, что азотистая кислота также дает с дифениламином синее окрашивание, поэтому пробу на нитраты можно проводить только при отсутствии в среде нитритов.

· Накопление аммиака в культуральной жидкости устанавливают при помощи реактива Несслера. Реакция капельная. На фарфоровые пластинки с лунками или в чашки помещают каплю культуральной жидкости, затем - каплю реактива. При большом количестве аммиака образуется коричневый или буроватый осадок, при небольшом - появляется оранжевая или желтая окраска (Теппер, 1987).

Глава 3. Результаты исследований

Й. Была осуществлена постановка модельных систем с целью изучения влияния различных загрязняющих веществ на процесс нитрификации в почве - по 4 модельные системы для каждой пробы почвы (Бэровские бугры, с.Садовое). Из данных четырех систем первая содержала собственно отобранную почву без ЗВ и выступала в качестве контроля; вторая модельная система была загрязнена серой в количестве 1 ПДК; третья - ПАВ в количестве 5 ПДК (смесь АПАВ и КПАВ в соотношении 1:1); четвертая - нефтью в количестве, равном 1 ПДК.

Из модельных систем производился высев на плотные питательные среды в чашки Петри для определения количества нитрифицирующих микроорганизмов первой, второй фаз, а также гетеротрофных нитрификаторов. Высев проводился из первых трех разведений спустя 6 часов, сутки, 3 суток, неделю, 2 недели, 3 недели после постановки модельных систем. На каждой среде производился подсчет колоний, описание культуральных и морфологических признаков. На среде для гетеротрофной нитрификации также производился анализ образования нитритов из аммония путем нанесения на бактериальные колонии капли реактива Грисса.

На среде Сориано и Уокера нитрифицирующие бактерии образуют слизистые желтоватые колонии, круглые или неправильной формы, плоские или выпуклые, гладкие. На среде Ватсона и Уотербери - слизистые желтоватые, бежевые, иногда белые, круглые, плоские или выпуклые, гладкие. Подсчитывалось среднее количество колоний. Отмечались лишь количество тех колоний, которые соответствовали культурально и морфологически нитрифицирующим микроорганизмам (табл. 3).

Таблица 3.

Рост на плотных питательных средах нитрифицирующих микроорганизмов первой и второй фаз, выделенных из модельных систем.

«-» - рост нитрифицирующих микроорганизмов не обнаружен

Как видно, процесс нитрификации более активно протекает в почвах Бэровских бугров. Это может быть связано с большим количеством органических веществ, содержащихся в лесной почве с. Садового и подавляющих нитрифицирующих активность почвы. Процесс нитрификации подавляется под воздействием всех трех ЗВ.

Под воздействием серы процесс нитрификации подавляется в среднем на 3-7 сутки. Это может быть связано с тем, что идет образование сульфатов и других серосодержащих соединений, ингибирующих деятельность нитрифицирующей микрофлоры в результате закисления. Сходные данные были получены Стефенсоном при изучении процесса нитрификации.

ПАВ полностью подавляют рост нитрифицирующих бактерий на вторые-четвертые сутки. Предположительно, это связано с действием ПАВ на бактериальные мембраны, вызывающее их частичную деструкцию и нарушающее процессы поступления веществ в клетки микроорганизмов. Аналогичные исследования проводились Орловым, который также указывал на подавления процесса нитрификации под воздействием ПАВ в данных концентрациях.

Нефтяное загрязнение по-разному сказывается на различных почвах. В бурых почвах Бэровских бугров рост нитрифицирующих микроорганизмов полностью подавляется через 5-7 часов после загрязнения и в течение 21 дня восстановление нитрифицирующей активности почвы не наблюдается. В лесных почвах с.Садового подавление процесса нитрификации также наблюдается через 6-24 ч, но в среднем на 14-21 день наблюдается восстановление первоначальной активности. Это может быть связано с наличием в данной почве большого количества органики и сапротрофных микроорганизмов, усваивающих ее. Поэтому внесенные нефтяные углеводороды ко 2-3 недели частично разлагаются почвенной микрофлорой, и к данному моменту большинство наиболее токсичных легких фракций испаряется. Также в связи с частичной деструкцией нефтяных углеводородов может усиливаться аэрация почв в сравнении с первыми днями после внесения загрязнителя. Полученные данные подтверждаются исследованиями Марфениной, Звягинцева, Исмаилова и др.

Также исследовался процесс гетеротрофной нитрификации в данных почвах. Высев на плотные питательные среды проводился из трех первых разведений. Отмечались лишь те колонии микроорганизмов, которые давали качественную реакцию с реактивом Грисса. Данные колонии обладали следующими признаками: небольшие (диаметр до 1 см), белые, слизистые, круглые, гладкие, плоские. Морфологические признаки обнаруженных микроорганизмов отличались от таковых у типичных представителей нитрифицирующих микроорганизмов: Г «+», прямые и изогнутые палочки, а также споровые формы с бациллярным, центральным расположением спор.

Таблица 4.

Рост на среде для гетеротрофной нитрификации микроорганизмов, выделенных из почв с. Садового и Бэровских бугров.

В почвах через неделю после загрязнения серой наблюдается развитие процесса гетеротрофной нитрификации. Это явление можно объяснить тем, что в кислых почвах процесс автотрофной нитрификации подавляется, а окисление аммиака и нитрита осуществляется гетеротрофными микроорганизмами. В почвах с. Садового аналогичное явление наблюдается также через неделю после нефтяного загрязнения. Как утверждает Заврзин, это связано с тем, что в данный период начинается активное разложение углеводородов нефти, а микроорганизмы, осуществляющие окисление органических веществ параллельно образуют нитриты.

Таким образом, сера полностью угнетает рост нитрифицирующих микроорганизмов первой и второй фаз на 3-7 сутки и с этого периода наблюдается развитие гетеротрофных нитрификаторов. Нефть ингибирует процесс нитрификации в среднем через 6-24 часа, но приблизительно через 3 недели наблюдается восстановление нитрифицирующей активности в лесной почве. ПАВ полностью подавляют процесс нитрификации на 2-4 сутки, и восстановление первоначальной активности в течении 3-х недель не наблюдается.

II. Была осуществлена постановка накопительных культур для определения способности к адаптации нитрифицирующих микроорганизмов к различным токсичным веществам - по 8 накопительных культур для каждой пробы почвы (Бэровские бугры, с.Садовое): четыре накопительные культуры для первой фазы нитрификации и четыре - для второй. В каждую накопительную культуру было внесено по 1 г почвы и определенное ЗВ:

№1 - контрольная накопительная культура без ЗВ;

№2 - накопительная культура, содержащая серу в количестве 1 ПДК;

№3 - накопительная культура с ПАВ в количестве, равном 5 ПДК (использовалась смесь АПАВ и КПАВ в соотношении 1:1);

№4 - накопительная культура с нефтью в количестве 1 ПДК.

Анализировалось изменение культуральных признаков в накопительных культурах по следующим признакам: изменение цвета и помутнение среды, появление пленки или взвешенных частиц в культуре. Рост нитрифицирующих микроорганизмов сопровождается позеленением или пожелтением среды, образованием белой или светло-бежевой непрозрачной пленки, слизистых взвешенных частиц. В накопительных культурах для возбудителей первой фазы нитрификации устанавливали образование аммония и азотистой кислоты; для второй фазы проводили пробу на азотистую кислоту, в случае ее отсутствия - на азотную кислоту. Также проводилось микроскопирование и отмечались накопительные культуры, в которых были обнаружены бактерии, морфологические признаки которых соответствовали нитрифицирующим микроорганизмам соответствующих фаз.

В таблицах 6 и 7 отражены основные изменения культуральных признаков в накопительных культурах для первой и второй фаз нитрификации для почв с. Садового и Бэровских бугров.

Далее из накопительных культур производился высев на плотные питательные среды для определения численности нитрификаторов Й и ЙЙ фаз.

Таблица 5.

Культуральные признаки в накопительных культурах для первой фазы нитрификации для почв с. Садового и Бэровских бугров.

1- изменение цвета

2- помутнение

3- образование взвешенных частиц

4- образование пленки

5- реакция с реактивом Несслера

6- реакция с реактивом Грисса

7- морфологические признаки

«+» - наличие признака

«-» - отсутствие признака

«±» - признак слабо выражен

Таблица 6.

Культуральные признаки в накопительных культурах для второй фазы нитрификации для почв с.Садового и Бэровских бугров.

1 - изменение цвета

2 - помутнение

3 - образование взвешенных частиц

4 - образование пленки

5 - реакция с реактивом Грисса

6 - реакция с дифениламином

7 - морфологические признаки

«+» - наличие признака

«-» - отсутствие признака

«±» - признак слабо выражен

Рост нитрифицирующих микроорганизмов обнаружен в контрольных накопительных культурах, о чем свидетельствует изменение культуральных признаков почти по всем показателям. Кроме контрольных, нитрифицирующие бактерии как первой, так и второй фаз обнаруживаются в первых 2-3 высевах из накопительных культур, загрязненных серой. В культурах, содержащих нефть и ПАВ, микроорганизмы, осуществляющие процесс нитрификации не обнаруживаются. Изменение культуральных признаков усиливается в течение времени всего эксперимента.

Из накопительных культур производился высев на плотные питательные среды в чашки Петри для определения количества нитрифицирующих микроорганизмов. Использовались среда Сориано и Уокера и среда Ватсона и Уотербери. Первый высев производился через сутки после обнаружения роста нитрифицирующих микроорганизмов в контрольной накопительной культуре, т.е. спустя 13 суток для первой и спустя 16 суток для второй фазы. Последующие высевы проводились соответственно через 3, 7, 14, 21 день.