Биохимия протеасом

2

Федеральное агентство по образованию

Пензенский государственный педагогический университет

имени В. Г. Белинского

Кафедра биохимии

Курсовая работа на тему:

Биохимия протеасом

ВЫПОЛНИЛА: студентка

группы БХ-31 Горбунова Н. А.

ПРОВЕРИЛ: Соловьев В. Б.

Пенза

2009

План

Введение

1. Структура и химический состав протеасомы

2. Механизм действия

3. Биологическая роль протеасомы

4. Болезни связанные с нарушением работа протесомных систем

Заключение

Список литературы

Введение

За последние десятилетия биохимические механизмы, лежащие в основе синтеза белков, изучены достаточно детально. По меньшей мере пять Нобелевских премий были присуждены за исследования по формированию и функционированию белков. Значительно меньше внимания уделялось проблеме деградации (распада) белков. В то же время в науке накапливались данные, что процесс деградации белков лежит в основе регуляции не только их количества, но и их функций.

Когда отлаженная система деградации белков (протеолиз) дает сбои, в организме начинаются необратимые изменения, и человек заболевает. Примерами таких заболеваний можно считать некоторые виды рака, кистозный фиброз (муковисцидоз), ряд аутоиммунных нарушений и врожденных патологий. В чем же заключается открытие нобелевских лауреатов, какой вклад оно вносит в современное понимание жизнедеятельности клетки и организма? На эти вопросы мы и попытаемся ответить. Как известно, в каждой клетке человеческого организма содержится около 100 тыс. различных белков. Одни из них существуют долго, жизнь других исчисляется минутами; все они связаны с протеканием разнообразных ферментативных и не ферментативных биохимических процессов. Выполнив свое назначение, белки должны быть уничтожены. Каким образом клетка распознает, а затем и уничтожает «выработанные» белки? Долгое время распад белков в клетке связывали с работой лизосом. Однако протеолиз в лизосомах - процесс неспецифический и связан у высших животных с деградацией лишь малой части (около 10%) белков, в основном чужеродных. В 80-х гг. прошлого века стало известно о существовании в клетках про- и эукариот протеасомы - специальной «фабрики» по разрушению белков. Подавление ее работы приводило к необратимым нарушениям белкового обмена.

1. Структура и химический состав протеасом

Известно, что в живой клетке содержатся множество разных белков. Одни из них существуют довольно долго, другие живут от нескольких минут до 2--3 ч. Последние синтезируются только в определенный момент жизни клетки, в ответ на некоторые внутренние и внешние импульсы. Когда потребность в таком белке отпадает, специальные факторы сигнализируют о том, что его синтез должен быть остановлен. Действуют они или на этапе считывания матричных РНК (мРНК) с ДНК (факторы транскрипции), или на стадии синтеза белка с уже имеющихся РНК-матриц. Однако, если некий белок существует, но в его функционировании клетка больше не нуждается, должен быть и механизм, обеспечивающий остановку его работы. Такой механизм давно и весьма детально исследован для белков-ферментов. Чтобы “вывести из строя” фермент, его активность обратимо подавляется (ингибируется) веществами белковой или небелковой природы. Однако клетка на протяжении своей жизни синтезирует и множество белков, не обладающих ферментативной активностью, но тем не менее “исполняющих” разнообразные роли. Такие белки не только прекращают свою работу в определенный момент, но и существуют очень недолго (потому и называются короткоживущими) по сравнению со временем жизни клетки.

Очевидно, что каким-то образом должны удаляться и “сделавшие свое дело” белки, иначе они переполнят клетку и разрушат ее. Может быть, она справляется с ними посредством хорошо изученного протеолиза (распада белков под действием специальных ферментов)? Но тогда неясно, почему не повреждаются при этом структурные компоненты клетки и еще нужные ей белки. Протеолиз в лизосомах -- процесс неспецифический, в этих образованных мембраной “мешочках” с набором ферментов гидролаз молекулы белков расщепляются до аминокислот, идущих затем в обменные процессы клетки (здесь же гидролизуются нуклеиновые кислоты и полисахариды).

У высших эукариот лизосомы разрушают только белки, связанные с мембранами, а также чужеродные, захваченные во время эндоцитоза (например, вирусные или бактериальные).

К началу 80-х стало ясно, что эффективная регуляция не только количества, но и функции многих белков зависит и от процессов, связанных с деградацией. В это же время в клетке был обнаружен высокомолекулярный белковый комплекс, который работал в определенных условиях как несколько протеолитических ферментов . Однако, что очень важно, свою разрушающую активность комплекс проявлял только в явно нефизиологических условиях под действием изменяющих его структуру веществ. Он был найден в клетках как самых примитивных, так и высших эвкариот, причем и в ядре, и в цитоплазме.

Это свидетельствовало об абсолютной необходимости комплекса для нормальной жизнедеятельности клетки. Его начали интенсивно изучать во многих лабораториях мира, и даже возникло множество названий, из которых сейчас чаще всего используется то, что дали К. Танака и А. Голдберг, -- протеасома, т.е. частица (сома) с протеолитической функцией. Надо сказать, что протеасомой названы две частицы разной сложности строения. Они отличаются также молекулярной массой и коэффициентом седиментации (его выражают в единицах Сведберга и обозначают буквой S при числе).

В 90-х годах выяснилось, что первоначально выделенный комплекс с молекулярной массой около 700 кДа и коэффициентом седиментации 20S в качестве протеолитического ядра входит в состав еще более сложной частицы. Первую стали называть 20S протеасомой, вторую -- 26S протеасомой.

Затем обе частицы были выделены в очищенном виде, проведен рентгеноструктурный анализ 20S протеасомы, а методами электронной микроскопии и компьютерной томографии получены “портреты” и этой, и другой частицы. Судя по рентгеноструктурным данным, 20S протеасома представляет собой полый цилиндр длиной 15--17 нм и диаметром 11--12 нм, образованный четырьмя лежащими друг на друге кольцами. Каждое из них состоит из семи белковых субъединиц (молекулярной массой 20--35 кДа), причем периферические кольца сформированы субъединицами a-типа, а два центральных -- b-типа.

Канал внутри цилиндра, расширяясь, образует три камеры: большую центральную и две меньшие, по краям. В центральной камере и осуществляется протеолиз. Роль a- и b-колец в работе протеасомы различна. Так, субъединицы a-кольца за счет своих гидрофобных участков закрывают отверстие в центральный канал и препятствуют случайному проникновению белков в протеолитическую камеру. Кроме того, эти же субъединицы отвечают за присоединение других высокомолекулярных комплексов, которые регулируют работу 20S протеасомы.

Компьютерная томография двух форм протеасомы .

Как возникает столь непростая конструкция? Сначала автокаталитически образуется семичленное кольцо из a-субъединиц. Затем во взаимодействие с ним вступают три b-субъединицы, одна из которых несет так называемый лидерный пептид, работающий как шаперон (этот полипептид-помощник “следит” за правильностью укладки белковой молекулы). Три первых b-субъединицы определяют посадку остальных, и в результате образуется 13S комплекс из двух разноименных колец. После димеризации 13S комплекса возникает 16S предшественник из четырех колец, а “зрелая” 20S протеасома -- после автокаталитического отщепления лидерного пептида и высвобождения N-концевого треонина, играющего важнейшую роль в формировании каталитических центров.

Центральная камера -- это место, где происходит протеолиз. Именно там, на внутренней поверхности, располагаются каталитические центры -- три основных и два дополнительных. Один из основных катализирует протеолиз по типу химотрипсина, другой -- подобно трипсину, третий работает по принципу каспазы. Эти основные области локализованы на трех разных субъединицах каждого b-кольца, там же находятся и дополнительные. Структура активного центра b-субъединиц необычна: в качестве основного структурного элемента, проводящего катализ, в нем присутствует N-концевой треонин.

Отверстие, ведущее в центральный канал и образованное a-субъединицами 20S протеасомы, по размеру сопоставимо с a-спиралью белка, а кроме того оно закрыто их гидрофобными N-концевыми участками. Это и не позволяет цитоплазматическим белкам проникать к месту возможного разрушения. Поэтому 20S протеасома, выделенная в условиях, сохраняющих ее целостность, гидролизует только короткие полипептиды в реакции, которая не требует АТФ как источника энергии.Главная забота 20S протеасомы -- расщепление не пептидов, а белков. Как же они проникают в каталитические области, если вход закрыт?

Все выяснилось: если использовать агенты, способные влиять на структуру 20S протеасомы, протеолитическая активность увеличивается, так как отверстие в a-кольце, ведущее в центральный канал, расширяется (об этом свидетельствуют последние рентгеноструктурные данные). В эксперименте такое расширение происходит в нефизиологических условиях, под влиянием низкомолекулярных веществ, а в клетке роль “открывалок” выполняют макромолекулярные регуляторы (активаторы) весьма сложного строения.

Пока их известно только два -- РА700 и РА28 (аббревиатура англ. Protein Activator). На протеолитическую активность 20S протеасомы они влияют по-разному.

Сборка 20S протеасомы.

Схематическое строение 26S протеасомы и протеолитических камер.

Благодаря первому регулятору (РА700) она участвует в деградации основной массы клеточных белков. Формирующие его 17--18 субъединиц гетерогенны по молекулярной массе, аминокислотной последовательности и третичной структуре. В составе этого комплекса можно выделить два структурных элемента, тоже отнюдь непростых. В англоязычной литературе их называют base- и lid-complexes, что по-русски можно передать как нижний и верхний комплексы. Так вот, нижний (базовый, опорный) присоединяется к a-кольцу протеолитического ядра и открывает белковым субстратам доступ в каталитическую камеру.

Этот элемент регулятора состоит из девяти субъединиц, причем шесть -- это ферменты, гидролизующие АТФ, т.е. они поставляют энергию, необходимую на ряде этапов деградации белков. Верхний элемент построен из восьми субъединиц, отвечающих за распознавание и подготовку белковых субстратов к расщеплению, за взаимодействие с некоторыми другими клеточными белками.

Регулятор РА700 присоединяется к обоим концам протеолитического ядра-цилиндра (эта реакция также нуждается в энергии, ее источником служит АТФ) и образует зеркально симметричную структуру, похожую на гантели. Каталитическое ядро (т.е. 20S протеасома), связанное с двумя регуляторами РА700, и есть 26S протеасома, ее молекулярная масса составляет более 2.5 МДа. Этот комплекс обозначают и как РА700-20S-РА700.

Другой регулятор, РА28, тоже состоящий из нескольких субъединиц, подобно РА700, способен присоединяться к концам протеолитического ядра-цилиндра с образованием частиц РА28-20S-РА28. За счет этого канал в a-кольце ядра открывается, но гидролиз белков не идет, расщепляются только короткие полипептиды.

Заметим, что с 20S протеасомой могут связаться и оба регулятора сразу, тогда возникает гибридная форма РА700-20S-РА28. Как будут распределены разные формы и в каком количестве понадобятся клетке, зависит от ее молекулярных потребностей в определенное время ее жизни и в конкретных обстоятельствах. Об этом мы еще расскажем, а сейчас вернемся к 26S протеасоме, вернее, к ее субстратам -- белкам.

Итак, молекулярная машина собрана и готова работать -- разрушать отработавшие белки, чтобы клетка не только не заполнилась ими до отказа, но и использовала белковые осколки для своих целей.

2. Механизм действия

У млекопитающих до 90% клеточных белков (не только всех короткоживущих, но и большинства долгоживущих) подвергается гидролизу в полости протеасомы. Однако, прежде чем начнется этот процесс, она должна распознать объект протеолиза по какому-то признаку, ярлыку. Оказалось, маркировкой занимается специальная система ферментов (ее называют системой убиквитинирования). Маркером же служит цепочка не менее чем из четырех молекул белка убиквитина, состоящего из 76 аминокислотных остатков. Как образование цепочки через остаток лизина-48 в каждой молекуле, так и присоединение ее к белку-субстрату как раз и обслуживается системой ферментов.

Эта система, включающая три типа ферментов (Е1, Е2 и Е3), высоко специфична и избирательна за счет того, что построена по принципу иерархического усложнения. Фермент Е1 (в клетке он только один) активирует молекулу убиквитина и передает ее одному из ферментов семейства Е2 (их называют конъюгирующими). Затем в каскад реакций вступает третий участник -- представитель семейства Е3, лигаз, “сшивающих” ферментов. Он принимает убиквитин от Е2, соединяется с белком-субстратом и ковалентно пришивает к нему цепочку убиквитина.

Если Е1 не имеет разновидностей, то семейство Е2 насчитывает 13 членов в клетке дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а млекопитающих -- гораздо больше. В семействе Е3 сейчас известно около 100 разных лигаз, они-то и определяют в конечном счете высокую специфичность всей протеолитической системы. А вообще каждый фермент и того, и другого семейства участвует в определенном клеточном процессе. Маркировка белка-субстрата (мишени) цепочкой убиквитина завершилась. Теперь ее узнает и связывается с ней одна или более субъединиц регулятора РА700.

Этот процесс, как и последующее разворачивание субстрата, нуждается в энергии, которую поставляют, видимо, АТФазы базового (нижнего) элемента в структуре того же регулятора. Развернутая, линейная молекула белка протягивается через регулятор, играющий роль рта протеасомы, и через открытое отверстие в a-кольце проникает в протеолитическую камеру.

Здесь белок расщепляется на полипептиды длиной от 5 до 24 аминокислотных остатков, которые высвобождаются из протеасомы и в цитоплазме могут подвергнуться гидролизу до аминокислот протеазами (например, эндопептидазами). Ненужная больше маркировочная цепочка ликвидируется: изопептидазы разрывают ее на мономеры. Описывая каскад реакций по маркировке субстрата, мы, чтобы не разбивать ход событий, намеренно кое-что опустили. Не сказали, почему цепочка убиквитина пришивается именно к тому белку, чья судьба предрешена.

Оказывается, он уже несет признаки смерти -- специфические сигналы, которые включают процесс деградации. Ими могут быть участки внутри белковой молекулы или на ее N-конце. Видимо, в определенных условиях они становятся доступными для узнавания ферментной системой, ответственной за маркировку. К основным первичным и вторичным сигналам для присоединения убиквитина могут быть отнесены следующие:

конформация N-терминальной области пептида, в частности наличие «дестабилизирующей» N-концевой или другой свободной -аминогруппы («N-концевое правило») или специфически расположенный лизин субстрата;

определенные короткие мотивы в последовательности аминокислотных остатков (а не трехмерная структура целой молекулы белка);

нарушения вторичной структуры белка (неправильное свертывание) полипептидной цепи;

повреждение боковых цепей остатков аминокислот, в том числе их окисление (например окисление остатков метионина);

избыточное гликозилирование белков и пептидов.

Некоторые N-концевые аминокислотные остатки (у эвкариот, особенно Арг, Лиз, Лей, Фен, Асп) играют большую роль в определении жизни многих короткоживущих белков (в среднем они существуют от нескольких минут до трех часов), а также частично разрушенных или с измененной третичной структурой. На зависимость скорости деградации от природы N-концевых аминокислот (правило N-конца) первым обратил внимание наш бывший соотечественник А.Варшавский, он же ввел понятие “короткоживущие белки”. В ряде случаев дестабилизирующие аминокислоты присоединяются к N-концу долгоживущих белков специфическими ферментами, после чего такие белки быстро разрушаются протеасомой.

Имеются основания полагать, что убиквитин-зависимые протеиназы принимают участие в процессах деградации белков и пептидов с аномальной структурой, что является определяющим фактором адаптации клетки к изменяющимся условиям. Кроме того известно что, деградация коротко-живущих регуляторных белков через убиквитин-протеасомный путь играет важную роль в основополагающих процессах клетки. К таким белкам, например, относятся циклины, циклин-зависимые киназы и их ингибитры, супрессоры опухолей, онкобелки, активаторы транскрипции и их ингибиторы и многие другие. Весьма детально изучена деградация циклинов - регуляторных белков, которые синтезируются и затем быстро разрушаются на различных фазах клеточного цикла, контролируя тем самым прогрессию этого процесса.



Различные формы протеасомы и ее активаторов.

Схема протеасомной деградации белков. Вверху -- образование убиквитиновой цепочки; внизу -- гидролиз субстрата протеасомой до пептидов и свободного убиквитина.

Цепочка убиквитина способна присоединяться к белку-мишени и по сигналам, возникающим за счет некоторых вторичных модификаций (например, фосфорилирования) или соединения со вспомогательными белками.

В общих чертах мы рассмотрели всю схему действия протеасомы, систему маркировки белка, который будет ею разрушен до полипептидов. За счет этого протеасома регулирует время жизни важнейших белков, удаляет из нее чужеродные и аномальные, поставляет образовавшиеся в результате гидролиза полипептиды в качестве антигенов, способных сообщать иммунной системе о неполадках в клетке. Таким образом, внутриклеточный протеолиз -- это не механический процесс деградации белков, а один из основных факторов, которые регулируют жизнедеятельность клетки.

3. Биологическая роль протеасомы

Протеасомы - это субклеточные органеллы, которые можно обнаружить в цитозоле, ядре, эндоплазматической сети и лизосомах клеток эукариот.

Функции протеасом следующие:

· Протеолиз несобранных белков.

· Протеолиз поврежденных или развернутых белков.

· Продукция пептидов, которые узнаются иммунной системой.

· Регуляция длительности существования (полужизни) в клетке регуляторных белков например тех, которые контролируют клеточный цикл.

Более 80% белков клетки процессируются в протеасомах. Протеасомы являются активными участниками множества процессов внутри клетки ,оказывая большое влияние на организм. Из разнообразных процессов, в которых участвует протеасома (табл.), рассмотрим лишь некоторые.



Регуляция клеточного цикла. Как известно, клеточный цикл состоит из нескольких фаз, а их последовательная смена регулируется белками циклинами. Поскольку на каждой фазе действует собственный регулятор, жизнь его должна быть короткой. Это и обеспечивает 26S протеасома.

Оказалось, что одни циклины в качестве метки для узнавания содержат участки, обогащенные пролином, глутаминовой кислотой, серином и треонином, а ряд других -- консервативный фрагмент из девяти аминокислот, который обычно располагается на расстоянии около 40 аминокислотных остатков от N-конца. Узнанный по той или иной метке регуляторный белок сшивается, как уже было сказано, с убиквитиновой цепочкой своим собственным ферментом из семейства Е3 и разрушается 26S протеасомой. Известно, что сбой в ее работе вызовет остановку клеточного цикла на той или иной фазе.

Злокачественное перерождение клетки. В нормальной здоровой клетке белки, регулирующие скорость транскрипции, во многих случаях определяют ее дальнейшую судьбу -- станет ли работать и делиться с запрограммированной для нее скоростью, пойдет ли по пути неконтролируемого злокачественного роста, будет ли разрушена как представляющая опасность. Поэтому такие регуляторные белки в зависимости от обстоятельств могут быть или онкобелками, или же, наоборот, онкосупрессорами. Пример подобных превращений -- белок р53, уровнем которого поддерживается в здоровой клетке соотношение между процессами роста и апоптоза. Но все меняется, например, при заражении человека вирусом папилломы: вирусный белок E6 находит белок р53 и сигнализирует строго определенному ферменту из семейства Е3 о необходимости присоединить к р53 убиквитиновую цепочку. Фермент выполняет свою функцию, и р53 становится субстратом для протеасомной деградации. В результате его ускоренного разрушения клетка идет по пути злокачественного перерождения.

Транскрипция. Под действием 26S протеасомы расщепляются белковые молекулы. Однако выяснилось, что протеолизу может подвергаться даже отдельная субъединица в сложном белковом комплексе. Представить себе механизм взаимодействия с ним 26S частицы довольно трудно. Тем не менее частичный протеолиз осуществляется в процессе двухступенчатой активации ядерного фактора (его обозначают NF-kB), который контролирует транскрипцию. Сначала в результате гидролиза протеасомой образуется из своего предшественника субъединица p50 этого фактора. Затем она, еще одна субъединица -- р65 -- и белок-ингибитор IkB объединяются в неактивный комплекс. Транскрипция становится возможной после деградации 26S протеасомой ингибитора IkB, перед этим фосфорилированного в двух местах.

Иммунная система. Участие протеасомы в иммунном ответе клетки -- один из наиболее активно изучаемых аспектов работы 26S частицы. Она, гидролизуя аномальные или чужеродные белки до полипептидов, поставляет некоторые из них (обычно длиной от восьми до 11 аминокислот) в качестве антигенов . Такие полипептиды соединяются в цитозоле с определенным транспортным белком и переносятся в эндоплазматический ретикулум, где взаимодействуют с молекулами белков класса I главного комплекса гистосовместимости и выносятся на поверхность клетки. Вновь появившиеся антигены иммунная система обнаруживает с помощью цитотоксических T-лимфоцитов и разрушает клетки, в которых продуцируются вирусные или другие необычные для них белки.

Чтобы эффективнее защищать организм от опасных для него клеток с синтезирующимися в них аномальными белками, в каталитическом ядре протеасомы три конституционные субъединицы могут быть заменены на их изоформы, или иммунные субъединицы. В культуре клеток млекопитающих такая замена происходит под действием интерферона -- мощного иммуномодулятора. В лимфоидных органах (селезенке, тимусе, лимфатических узлах) изоформы синтезируются постоянно, причем их количественное соотношение с конституционными субъединицами зависит и от типа ткани, и от стадии дифференцировки органа. В результате подобной модификации количество образуемых протеасомой полипептидов -- потенциальных антигенов -- возрастает в несколько раз.

Образование иммуногенных пептидов за счет расщепления вирусного белка протеасомой и их вынос на поверхность клетки в качестве антигенов. Весь путь пептидов показан цветом. Клетка с такими антигенами на поверхности узнается цитотоксическими лимфоцитами и разрушается ими. ГКГС1 -- главный комплекс гистосовместимости, молекулы класса 1.

Но это не единственный способ, посредством которого активизируется работа протеасомы в качестве генератора антигенных полипептидов.

Существуют три формы протеасомы (в зависимости от того, с каким регулятором связано ее ядро): РА700-20S-РА700, т.е. 26S форма, РА28-20S-РА28 и гибридная РА700-20S-РА28. Предполагают, что вторая форма способна гидролизовать длинные пептиды -- первоначальный продукт расщепления белков 26S протеасомой -- до коротких. Именно они и выносятся на поверхность клетки в качестве антигенов. Что касается гибридной формы, то один ее регулятор (РА700), видимо, узнает белок, несущий убиквитиновую цепочку, а второй (РА28) заставляет каталитическое ядро гидролизовать белковую молекулу до более коротких иммуногенных пептидов. К настоящему времени установлено, что содержание и внутриклеточное распределение форм протеасомы связано с действием g-интерферона и что в цитоплазме одновременно с уменьшением количества 26S протеасомы накапливается гибридная форма.

Репарация ДНК. Поддержание целостности генетического материала -- ДНК -- вомногом зависит от репарации, осуществляемой специальными ферментами и репаративными факторами. Каким образом внутриклеточный протеолиз влияет на этот процесс, пока неясно, но, несомненно, связь между ними существует. Известны уже некоторые участники -- белки, подвергающиеся деградации протеасомой, и появляются все новые подтверждения ее роли как регулятора репарации ДНК. Нельзя исключить, что и субъединицы одной из репаративных ДНК-полимераз (сейчас обнаружено шесть подобных ферментов) разрушаются под действием протеасомы. Роль этих полимераз возрастает в эмбриональном развитии животных, когда организму наряду с активной репликацией ДНК жизненно необходимо точное и своевременное исправление возникающих повреждений генетического материала.

Термозащита. При нагревании, как известно, белки утрачивают нормальную конфигурацию и перестают выполнять свои функции. Чтобы защитить клетку от столь пагубных последствий, в ней синтезируются белки теплового шока, или шапероны. Они исправляют нарушенную высокой температурой форму белковых цепей. В каком качестве участвует в этом процессе протеасома, пока не совсем ясно. Однако установлено, что, если подавить ее активность, в клетке накапливаются поврежденные белки, но в то же время стимулируется синтез мРНК шаперонов. Повышается также и уровень трегалозы (молекулы-термозащитницы) и термостабильность клеток в целом. Следовательно, полагают, ингибиторы протеасомы могут найти применение в медицине в качестве терапевтических средств при шоковых воздействиях высокими температурами.

Апоптоз. Запрограммированная клеточная смерть -- один из важнейших защитных процессов, который обеспечивает контроль за количеством клеток и постоянством состава тканей в организме. Таким способом разрушаются и опасные для него клетки: зараженные вирусами, раковые, с нарушенной ДНК. Механизмы апоптоза очень консервативны, одинаковы у низших эукариот и млекопитающих и представляют собой сложную систему последовательных молекулярных событий, которые в конечном счете приводят к энзиматической фрагментации хромосомной ДНК и смерти клетки.

И хотя в апоптозе работают свои специфические протеазы (каспазы), исследователи обнаружили, что процесс связан и с протеасомной деградацией белков.

При изучении роли протеасомной деградации в различных клеточных процессах весьма часто использовались ингибиторы активности протеасомы. Они легко проникают в клетку и избирательно подавляют данный путь протеолиза .

Эту отнюдь не простую связь изучают в основном с помощью ингибиторов активности протеасомы, и интенсивнее всего в исследованиях онкогенеза. Оказалось, что, снижая уровень активности упомянутого уже ядерного фактора транскрипции (NF-kB), такие ингибиторы могут запускать апоптоз трансформированных клеток, предотвращать ангиогенез (разрастание кровеносных капилляров в раковой ткани) и метастазирование in vivo. Это результат того, что снижение каталитической активности протеасомы приводит к накоплению ингибиторов роста клетки и проапоптозных белков. Не разрушенные ингибированной протеасомой короткоживущие белки, такие как р53 и р27, тоже способны запустить в клетке каскад биохимических и морфологических событий, ведущих к апоптозу. Однако ингибиторы протеасомы могут и предотвращать его, например в первичных клеточных культурах, если он вызван какими-то другими стимулами.

Как видно из приведенных примеров, ингибиторы протеасомной деградациислужат молекулярным инструментом, с помощью которого удается раскрыть связь между клеточной смертью и работой протеасомы. Но не менее важно и другое: если к апоптозу злокачественных клеток приводят ингибиторы, возможно, они могут послужить медицине как противораковые средства.

4. Болезни связанные с нарушением работы протеасомных систем

Деградация белков протеасомой -- процесс с тонкой настройкой, поэтому сбои в нем, нарушающие равновесие между пролиферацией и апоптозом, служат причиной разных болезней как врожденных, так и приобретенных. Условно их можно разделить на две группы:

· заболевания, обусловленные тем, что деградационная система не работает, это результат стабилизации субстратов, быстро разрушаемых в норме.

· заболевания, которые возникают из-за усиления функции деграционной системы, это результат аномально быстрого распада белков-мишеней.

Клеточный белок р53 при заражении онкогенным штаммом вируса папилломы человека соединяется с вирусным онкобелком Е6 и становится субстратом для ускоренной деградации протеасомой. В результате лишенная защиты клетка -- мишень вирусной атаки -- превращается в раковую. Действительно, при некоторых формах карциномы уровень клеточного р53 бывает резко снижен. Предполагают, что таким способом вирус может неконтролируемо размножаться в клетке, и она становится злокачественной. Агрессивные формы рака прямой кишки и молочной железы исследователи тоже связывают с работой протеасомной системы, хотя механизм образования трансформированных клеток здесь другой.

Видимо, некоторые врожденные заболевания человека обусловлены генетическими изменениями или в белках-субстратах, или в ферментах, отвечающих за сшивку с убиквитином. Фиброкистоз, например (его признаки -- хроническая закупорка и инфекция дыхательных путей, нарушение пищеварения), связан с мутацией, приводящей к преждевременному гидролизу протеасомой мембранного белка, который регулирует транспорт ионов хлора через мембрану эпителиальных клеток. При синдроме Ангельмана (задержка умственного развития) обнаружены делеция части Х-хромосомы и поврежденные молекулы фермента из семейства Е3. Редкая наследственная форма гипертензии, или синдром Лиддла, обусловлена делецией в генах субъединиц белка, который формирует натриевые каналы в клетках эпителия. В итоге меняется скорость гидролиза субъединиц протеасомой и, как следствие, -- баланс между ионами калия и натрия (т.е. нарушается солевой гомеостаз).

Целый ряд известных аутоиммунных заболеваний может быть вызван неправильным разрезанием белка протеасомой. Она ведь гидролизует и собственные нормальные клеточные белки, и чужеродные. Но из образующихся пептидов только чужие становятся антигенами, именно по ним цитотоксические лимфоциты узнают зараженную клетку и уничтожают ее. Свои же пептиды не вызывают Т-клеточного ответа. Однако, если по какой-либо причине протеасома неверно расщепляет субстрат, то и из собственных белков могут возникать нетипичные пептиды, которые распознаются Т-лимфоцитами как чужеродные. И тогда клетки организма, ничем не зараженные, становятся мишенью для атаки. По-видимому, с протеасомной системой связаны многие иммунные заболевания и воспалительные реакции, но конкретные механизмы их возникновения отнюдь не одинаковы.

Интересно, что вирусы могут уйти из-под контроля иммунной системы, причем разными способами. Вирус гепатита В, например, достигает этого за счет взаимодействия собственного белка Х с субъединицами 20S протеасомы и регулятора РА28. В такой комбинации протеолиз подавляется и белок Х остается целым. А раз нет пептидов-антигенов, иммунная система не воспринимает зараженную клетку. Цитомегаловирус человека не предохраняет свои белки от гидролиза, а способствует разрушению белковых молекул главного комплекса гистосовместимости, которые отвечают за транспорт: пептиды-антигены не попадают на поверхность зараженной клетки, и та выживает. Другие вирусные белки взаимодействуют с протеасомными АТФазами, увеличивая скорость гидролиза внутриклеточных белков и приводя к усиленному размножению вируса.

При многих нейродегенеративных заболеваниях (в их числе болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.) выявлены сенильные бляшки, различные тела включения и дегенеративные волокна, обогащенные убиквитином. Однако лишь на этом основании трудно понять, какова роль протеасомной системы в развитии данных патологий. Правда, в одном случае она проявляется нагляднее. В нейронах есть белок пресенилин-2 (PS2), который пронизывает мембрану и участвует в транспорте предшественников амилоидов и последующем их превращении в амилоид в -42. Для нормальной работы PS2 от него отщепляется С-концевой фрагмент и разрушается протеасомой. Если подавить ее работу ингибиторами, фрагмент будет накапливаться, к такому же результату приводят мутации в гене белка PS2. А они обнаружены в большинстве случаев раннего проявления семейной формы болезни Альцгеймера. Таким образом, в ее патогенезе может играть роль накопление С-концевого фрагмента, вызванное мутациями в гене или действием ингибиторов протеасомы.

Установлено, что в дистрофии скелетных мышц, обусловленной голоданием, сепсисом и денервацией, виноват усиленный гидролиз мышечных белков протеасомой. Но активирующие ее внеклеточные стимулы и сигнальные пути пока не ясны. Предполагают, что накопление окисленных белков при старении связано с нарушениями протеасомной деградации. И это не лишено основания.

Заключение

Протеасома - это мультисубъединичные и мультикаталитические протеиназные комплексы эукариотических клеток (Multicatalytic Proteinase Complex, MPC). Термин «протеасома» был предложен К. Танака и А. Голдбергом и отражает как протеолитическую (протеаза) функцию комплекса, так и его природу как дискретной частицы - сомы. В протеасомах разрушается до 90% всех клеточных коротко живущих белков (с регуляторными функциями) и 60-70% долго живущих белков Функции протеасом:

· «Чистка» белков цитоплазмы и нуклеоплазмы, то есть нормальное обновление видов клеточных белковых популяций.

· Каждый белок характеризуется временем полураспада - T_1/2 («полужизни») - временем, при котором 50% белковых молекул данного вида распадается (steady turnover)

· в протеасомах разрушаются метаболические ферменты, гемоглобин, структурные белки, существующие от нескольких дней до нескольких недель

· в протеасомах разрушаются регуляторные белки, например, регулирующие репликацию ДНК, которые нужны клетке только на короткое определенное время (в S-фазе). Затем они обновляются.

Клетки млекопитающих и человека содержат несколько форм и субтипов протеасом. Наиболее изученными формами являются 26S- и 20S-протеасомы 26S- протеасомы состоят из 20S-субчастицы - протеолитического «ядра» - и фланкирующих ее 19S-субчастиц. Они гидролизуют убиквитинированные белки в АТФ-зависимой реакции. 20S-протеасомы, помимо того, что являются протеолитическим «ядром» 26S-протеасом, способны, как самостоятельные частицы, гидролизовать некоторые белки без их предварительного убиквитинирования независимо от АТФ. Каждая из этих форм образована четырьмя субтипами, различающимися сочетанием конститутивных и иммунных протеолитических субъединиц. Конститутивные 26S-протеасомы участвуют в регуляции клеточных процессов, таких как репликация и репарация ДНК, транскрипция, передача сигналов, клеточный цикл, апоптоз, поскольку гидролизуют белки, осуществляющие эти процессы, строго контролируемым способом. Иммунные 26S-протеасомы необходимы для развития иммунного ответа. Функции всех субтипов 20S-протеасом связаны, главным образом, с уничтожением поврежденных белков. Из это следует что биологическая роль протеасом в клеточном метаболизме велика. Прошло 20 лет с открытия специфического внутриклеточного протеолиза. За это время в мире сложилось несколько научных центров по изучению протеасомы, но остается еще много не изученного в структуре, механизме действия и химическом составе протеасом.

Список литературы

1) Цимоха А. С., Миттенберг А. Г Цитология //Специфичность изменений в протеасомах клеток K562 при апоптозе, индуцированном диэтил-малеатом.М. 2006. 48 (2) : 133--144.

2) Токтарова М. В., Куличкова В. А., Миттенберг А. Г., Кожухарова И.М. Цитология // Дифференциальная регуляция эндорибонуклеазной активности 26S протеасом и б-РНП частиц при действии индукторов апоптоза на клетки линии K562: участие б-РНП частиц и протеасом в контроле над стабильностью РНК при программированной клеточной гибели.-М.2004. 46 (3) : 283--290.

3) Абрамова Е. Б., Карпов В. Л. «Протеасома: разрушение во имя созидания» // Природа.2003. № 7. С36-45

4) Яровая Г. А. Лабораторная медицина// «Биорегулирующие функции и патогенетическая роль протеолиза. Физиологическая роль и биохимические механизмы протеолитической деградации белков.»// М. 2003 г. № 6.

5) Капранов А.В., Курятова А.В., Преображенская О.И., Карпов В.Л. Мол. биология. 2001 г. №35. С.356--364.

6) Букеева А. О., Медведев А. Е. «Убиквитин - протеинлигаза Паркин: роль в развитии болезни Паркинсона»// Биохимия. 2006 г.том 71.№8.С1050-1061.

7) Маркосян К. А., Курганов Б. И. «Фолдинг, неправильный Фолдинг и агрегация белков. Образование телец включения и агресома.»// Биохимия.2004 г.том 69. №9.С1196-1212.

8) Кривошеев А. В., Усанов С. А. «Реконструкция митохондриальных цитохром Р450 - зависимых стероидгидроксилаз в фосфолипидных мембранах. Исследование топологии цитохрома Р450sce с помощью органического протеолиза.»//Биохимия.1997 г.том 62. №10.С 1243-1254.

9) Кольман Я., Рем К.- Г. Наглядная биохимия Мир. 2000. 469с.