Производство ферментов

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

Пензенский государственный педагогический университет

им. В.Г. Белинского

Естественно-географический факультет

Кафедра биохимии

КУРСОВАЯ РАБОТА

Производство ферментов

Студент ___________________

Пашковский С.А

Руководитель ______________

Соловьев В.Б.

Пенза.2009

Оглавление

Введение.

1. Классификация ферментов.

2. Глубинный метод производства ферментов.

3. Производство ферментов при поверхностном культивировании продуцентов.

4. Иммобилизация ферментов.

5. Классификация носителей для ферментов.

6. Методы иммобилизации ферментов.

7. Оборудование для производства ферментов.

8. Применение иммобилизованных ферментов.

9. Рынок ферментов и ферментных препаратов.

Литература

Введение

Органические отходы, как правило, имеют вид макромолекул, размеры которых иногда больше размеров бактериальной клетки. Для использования бактериями этих веществ, они должны подвергнуться расщеплению, либо гидролизу. Однако если вещество является трудно растворимым, процесс расщепления (гидролиза) может быть длительным. Ускорение процесса достигается с помощью ферментов, синтезируемых клетками микроорганизмов, и выделяемых во внешнюю среду.

Название ферменты происходит от латинского «fermentum» - закваска. Ферменты представляют собой сложные белковые молекулы и являются «биологическими катализаторами». «Биологический» говорит о том, что они являются продуктом или производным какого-либо живого организма. Слово «катализатор» означает, что вещество, обладает способностью увеличивать скорость химической реакции, при этом само оно в результате реакции не изменяется. Следовательно, после завершения реакции фермент способен сразу же вступать в новую.

Ферменты характеризуются субстратной специфичностью, то есть взаимодействуют только с одним веществом, и специфичностью действия - катализируют одно из возможных превращений, которым может подвергаться это вещество. Иными словами, фермент является своеобразным «ключом», способным открыть определенный «замок». В качестве «замка» выступают крупные органические молекулы, содержащиеся в сточных водах, которые расщепляются до веществ, необходимых микроорганизмам.

Ферменты ускоряют химические реакции, действуя в десятки, а иногда и сотни тысяч раз быстрее, чем неорганические катализаторы.

Многие вещества, используемые живыми организмами в качестве источников энергии, способны окисляться только при очень высокой температуре. При нормальных условиях эти реакции либо не идут, либо протекают с очень низкой скоростью. Небольшой пример: химическое окисление азота аммиака (содержащегося в больших количествах в сточных водах и имеющего резкий неприятный запах) до свободного азота протекает при температуре 600-700 °С; ферментативное - при температуре окружающей среды. К другой особенности, отличающей ферменты от химических катализаторов, можно отнести способность регулировать скорость протекания реакции в зависимости от концентрации субстрата в окружающей среде (чем выше содержание вещества, тем быстрее происходит его разложение). Все это делает фементы незаменимым сырьем для практически любого вида производства, от пишивой до текстильной.

1. Классификация ферментов

Ферменты как биокатализаторы обладают рядом уникальных свойств, например, таких как высокая каталитическая активность и избирательность действия. В ряде случаев ферменты обладают абсолютной специфичностью, катализируя превращение только одного вещества. Для каждого фермента существует свой оптимум рН, при котором его каталитическое действие максимально. При резком изменении рН ферменты инактивируются из-за необратимой денатурации. Ускорение реакции при повышении температуры также лимитировано определенными пределами, поскольку уже при температуре 40-50оС многие ферменты денатурируют. Эти свойства ферментов приходится учитывать при разработке технологии нового препарата.

Поскольку ферменты - вещества белковой природы, в смеси с другими белками их количество определить практически невозможно. Наличие фермента в препарате может быть установлено лишь по протеканию той реакции, которую катализирует фермент. При этом количественную оценку содержания фермента можно дать, определив либо количество образовавшихся продуктов реакции, либо количество израсходовавшегося субстрата. За единицу активности фермента принимают то его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в 1 минуту при заданных стандартных условиях - стандартная единица активности.

По решению Международного биохимического союза активность решено определять при t = 30оС по начальной скорости реакции, когда концентрация насыщения фермента и временная зависимость близка к кинетике реакции нулевого порядка. Остальные параметры реакции индивидуальны для каждого фермента. Активность ферментного препарата выражается в микромолях субстрата, прореагировавшего под действием 1 мл ферментного раствора или 1 грамма препарата в оптимальных условиях за 1 минуту. Если ферментный препарат не содержит балласта, то его активность выражается в тех же стандартных единицах на 1 мг фермента. Если же есть балласт, то активность считается на 1 мг белка в ферментном препарате. Активность выпускаемого препарата - важнейший нормируемый показатель качества.

Основную часть ферментов, получаемых промышленным способом, составляют гидролазы. К ним относятся, в первую очередь амилолитические ферменты: б-амилаза, в-амилаза, глюкоамилаза. Их основная функция - гидролиз крахмала и гликогена. Крахмал при гидролизе расщепляется на декстрины, а затем до глюкозы. Эти ферменты применяются в спиртовой промышленности, хлебопечении.

Протеолитические ферменты образуют класс пептидгидролаз. Их действие заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках и пептидах. Важная их особенность - селективный характер действия на пептидные связи в белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с ароматическими аминокислотами, трипсин - на связь между аргинином и лизином. В промышленности протеолитические ферменты классифицируют по способности проявлять активность в определенной области рН:

рН 1.5 - 3.7 - кислые протеазы;

рН 6.5 - 7.5 - протеазы;

pH > 8.0 - щелочные протеазы.

Протеазы находят широчайшее применение в разных отраслях промышленности:

мясная - для смягчения мяса;

кожевенная - смягчение шкур;

кинопроизводство - растворение желатинового слоя при регенерации пленок;

парфюмерная - добавки в зубную пасту, кремы, лосьоны;

производство моющих средств - добавки для удаления загрязнений белковой природы;

медицина - при лечении воспалительных процессов, тромбозов и т.д.

Пектолитические ферменты уменьшают молекулярную массу и снижают вязкость пектиновых веществ. Пектиназы делятся на две группы - гидролазы и трансэлиминазы. Гидралазы отщепляют метильные остатки или разрывают гликозидные связи. Трансэлиминазы ускоряют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей. Применяются в текстильной промышленности (вымачивание льна перед переработкой), в виноделии - осветление вин, а также при консервировании фруктовых соков.

Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется в деполимеризации молекул целлюлозы. Обычно используются в виде комплекса, доводящего гидролиз целлюлозы до глюкозы (в гидролизной промышленности). В медицинской промышленности их используют для выделения стероидов из растений, в пищевой - для улучшения качества растительных масел, в сельском хозяйстве - как добавки в комбикорма для жвачных животных.

Существует ряд факторов, влияющих на биосинтез ферментов. В первую очередь, к ним относится генетический. Состав и количество синтезируемых ферментов наследственно детерминированы. Применяя мутагены можно изменить генетические свойства микроорганизмов и получить штаммы с ценными для промышленности свойствами. К мутагенным факторам относятся ионизирующее и неионизирующее излучения, изотопы, антибиотики, другие химические соединения, преобразующие наследственные элементы клетки. Несмотря на определяющую роль генетического фактора в биосинтезе ферментов, производительность биотехнологических процессов зависит и от состава питательной среды. При этом важно не только наличие источников основных питательных веществ, но и веществ, играющих роль индукторов или репрессоров биосинтеза данного конкретного фермента или их групп. Механизм этого явления еще не вполне изучен, но сам факт должен учитываться при выборе технологии.

Рассмотрим несколько примеров. Фермент липаза почти не синтезируется грибом Aspergillus awamori на среде без индуктора, добавление жира кашалота усиливает биосинтез фермента в сотни раз. При добавлении же в среду крахмала и при полном исключении минерального фосфора интенсивно синтезируется фосфатаза. Не только наличие индуктора способно увеличивать выход фермента. Важную роль играет состав питательной среды и условия культивирования. При разработке процесса биосинтеза a-амилазы культурой Aspergillus oryzae замена сахарозы (как источника углерода) на крахмал увеличила активность фермента в 3 раза, добавление солодового экстракта (из проросших семян злаковых) ещё в 10 раз, а повышение концентрации основных элементов питательной среды на 50% - ещё в 2 раза.

Для интенсификации процесса роста и синтеза ферментов добавляют различные факторы роста, например, аминокислоты, пуриновые основания и их производные, РНК и продукты её гидролиза. В качестве источника углерода используют крахмал, кукурузный экстракт, соевую муку, гидролизаты биомассы дрожжей. Микроорганизмы могут утилизировать и минеральные источники азота. В состав питательных сред входят и ионы MG, Mn, Zn, Fe, Cu и др. металлов. Механизм действия большинства из них неизвестен. Некоторые входят в состав фермента. Ионы Ca повышают устойчивость a-амилазы, ионы Fe и Mg активизируют и стабилизируют протеолитические ферменты.

Оптимальный состав питательной среды для каждого продуцента может быть определен двумя способами: эмпирический и построение математической модели с использованием компьютера. Последний, естественно, предпочтительнее. По характеру культивирования все технологические процессы производства ферментных препаратов делятся на две большие группы: глубинный и поверхностный методы.

2. Глубинный метод производства ферментов

В этом случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной среде. Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается автоматизации и механизации. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата перед его выделением.

При глубинном культивировании продуцентов ферментов выделяют, как и в любом биотехнологическом процессе, 5 этапов.

1. Приготовление питательных сред зависит от состава компонентов.

Некоторые предварительно измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость для приготовления среды в определенной последовательности. Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования. До - потому что содержит частицы пыли органической и неорганической природы, после - так как несет клетки продуцента.

2. Получение засевного материала.

Для засева питательной среды материал готовят также глубинным методом. Вид его зависит от продуцента: для грибов это мицелиальная вегетативная масса, для бактерий - молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования. Получение посевного материала состоит в увеличении массы продуцента в 3-4 стадии. Объем посевного материала зависит от физиологических особенностей продуцента. Если продуцент размножается только вегетативно, он резко возрастает (до 5-20%). Если же происходит обильное спороношение - сокращается до 1%.

3. Производственное культивирование.

Биосинтез ферментов в глубинной культуре протекает в течение 2-4 суток при непрерывной подаче воздуха и перемешивании. Высокая концентрация питательных веществ на первых этапах могут тормозить рост биомассы продуцента, поэтому часто свежая среда или некоторые её компоненты вводятся в ферментер на стадии активного роста. Температурный оптимум находится в интервале 22-32оС. В современных технологических процессах ведется непрерывное автоматическое определение содержания в среде углеводов, количества образовавшихся метаболитов и концентрации клеток. Данные поступают в компьютер, который определяет стратегию коррекции процесса и автоматически регулирует его. Этим достигается максимальная производительность и наилучшее качество продуктов.

4. Выделение.

В мицелии трёхсуточной культуры обычно остается не более 15% ферментов. Остальные выделяются в окружающую клетки жидкую среду. В этом случае препараты ферментов выделяют из фильтратов после отделения биомассы.

5. Получение товарной формы.

3. Производство ферментов при поверхностном культивировании продуцентов

При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.

Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях, но среду и кюветы необходимо простерилизовать. Перед каждой новой загрузкой также необходима стерилизация оборудования. Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды (при осахаривании крахмала 5 кг поверхностной культуры заменяют 100 кг культуральной жидкости), поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму.

Посевной материал может быть трёх видов:

- культура, выросшая на твердой питательной среде;

- споровый материал;

- мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.

В три этапа получают и посевную культуру. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1 - 1.5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап - аналогично, но в колбах, третий - в сосудах с 500 г среды. Основу питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую структуру среды. Для повышения активности ферментов к отрубям можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром при помешивании (температура - 105-140 С, время 60-90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36-48 часов. Рост делится на три периода, примерно равных по времени. Сначала происходит набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28о С), затем рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло) и образование конидий. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55-70%).

Выросшая в неподвижном слое при поверхностном культивировании культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Массу размельчают до гранул 5-5 мм. Культуру высушивают до 10-12% влажности при температурах не выше 40оС, не долее 30 минут. Иногда препарат применяют прямо в неочищенном виде - в кожевенной и спиртовой промышленности. В пищевой и особенно медицинской промышленности используются ферменты только высокой степени очистки.

Схема очистки сводится к следующему:

- освобождение от нерастворимых веществ;

- освобождение от сопутствующих растворимых веществ;

- фракционирование (как правило, хроматографическими методами).

Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности. Стандартизация ферментного препарата - доводка активности фермента до стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др. Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов.

4. Иммобилизация ферментов

Общая характеристика иммобилизованных ферментов

В современной биотехнологии одно из видных мест принадлежит ферментам. Ферменты и ферментные системы широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве, химическом анализе и т.д.

Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за трудностей в отделении их от реагентов и продуктов реакции. Решить эти проблемы помогает создание иммобилизованных ферментов. Начало этому методу было положено в 1916 году, когда Дж.Нельсон и Е.Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность. Сам термин "иммобилизованные ферменты узаконен в 1971 году, и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве.

Сущность иммобилизации ферментов -- прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель (в капсулу и т. п.). При этом допускается прикрепление фермента только за счет функциональных групп, не входящих в активный центр фермента и не участвующих в образовании фермент-субстратного комплекса. Носитель фермента или матрица может иметь вид зернистого материала, волокнистой структуры, пластинчатой поверхности, пленок или тканей, полых волокон, трубочек, капсул и т. д. Имеет значение размер частиц носителя. Важно иметь большую поверхность, поэтому рекомендуются небольшие частицы диаметром 0,1--0,2 мм. Носитель фермента может быть как природное вещество, так и синтетический полимер. Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками:

1. Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.

2. Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта.

3. Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.

4. Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру

5. Классификация носителей для ферментов

Для получения иммобилизованных ферментов используется ограниченное число как органических, так и неорганических носителей. К носителям предъявляются следующие требования (Дж.Порат, 1974):

высокая химическая и биологическая стойкость;

высокая химическая прочность;

достаточная проницаемость для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность;

возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран);

легкая активация;

высокая гидрофильность;

невысокая стоимость.

Классификация носителей схематично представлена на рисунке

Классификация носителей для иммобилизованных ферментов

Следует отметить, что органические носители (как низко-, так и высокомолекулярные) могут быть природного или синтетического происхождения. Природные полимерные органические носители делят в соответствии с их биохимической классификацией на 3 группы: полисахаридные, белковые и липидные. Синтетические полимеры также можно разделить на группы в связи с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые, полиамидные, полиэфирные.

Для иммобилизации ферментов наиболее широко используются природные полисахариды и синтетические носители полиметильного типа, остальные применяются значительно реже. Большое значение природных полимеров в качестве носителей для иммобилизации объясняется их доступностью и наличием реакционно-способных функциональных групп, легко вступающих в химические реакции. Характерной особенностью этой группы носителей также является их высокая гидрофильность. Недостаток природных полимеров - неустойчивость к воздействию микроорганизмов и довольно высокая стоимость. Наиболее часто для иммобилизации используются такие полисахариды, как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Целлюлоза гидрофильна, имеет много гидроксильных групп, что позволяет модифицировать её, замещая эти группы. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированную целлюлозу довольно легко превратить в различные ионообменные производные, такие как ДЭАЭ-целлюлоза, КМЦ и т.д.

Широко распространены носители на основе декстрана, выпускаемые под названием "сефадексы". При высушивании они легко сжимаются, в водном растворе сильно набухают. В этих носителях размер пор в геле регулируется степенью сшитости. К группе декстранов относят и крахмал. Химически модифицированный крахмал сшивается агентами, такими как формальдегид. Таким способом был получен губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизу. Водорастворимые препараты на основе декстрана часто применяются как носители лекарственных средств в медицине.

Хорошим носителем считается агар. Его свойства улучшаются после химической сшивки, например, диэпоксидными соединениями. Такой агар становится устойчивым к нагреванию, прочен, легко модифицируется.

Белки в качестве носителей обладают рядом достоинств: вместительны, способны к биодеградации, могут применяться в качестве тонкой (толщиной 80 мкм) мембраны. Иммобилизацию ферментов на белковых носителях можно проводить как в отсутствие, так и в присутствии сшивающих агентов. Белки используются и в фундаментальных биологических исследованиях, и в медицине. К недостаткам белков в качестве носителей относят их высокую иммуногенность (за исключением коллагена и фибрина). Наиболее для иммобилизации используются структурные (кератин, фибрин, коллаген), двигательные (миозин) и транспортные (альбумин) белки.

Синтетические полимерные носители применяются для ковалентной и сорбционной иммобилизации ферментов, для получения гелей, микрокапсул. Полимеры на основе стирола применяются сорбционной иммобилизации. Они могут иметь макропористую, изопористую структуру, а также гетеропористую структуру. Для получения полимерных гидрофильных носителей широко используется акриламид - производное акриловой кислоты.

Широкое распространение получил метод включения ферментов и клеток в полиакриламидный гель, имеющий жесткую пространственную сетчатую структуру. Полиакриламидный гель устойчив к химическим воздействиям. Очень интересную группу представляют полиамидные носители. Это группы различных гетероцепных полимеров с повторяющейся амидной группой -С(О)-NH-. Например, полимеры на основе N-винилпирролидона используются для получения иммобилизованных ферментов, способных медленно распадаться в организме. Кроме того, они биологически инертны, что особенно важно при использовании в медицинских целях. Существенным недостатком большинства полимерных носителей является их способность накапливаться в организме. В этом отношении предпочтение отдается природным полимерам, которые гидролизуются ферментами. Поэтому в состав лекарственных препаратов часто входит декстран, а из синтетических носителей - полимеры на основе N-винилпирролидона. В настоящее время ведутся эксперименты по созданию синтетических полимеров, расщепляющихся с образованием нетоксичных продуктов обмена.

6. Методы иммобилизации ферментов

Существует два основных метода иммобилизации ферментов: физический и химический.

Физическая иммобилизация ферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:

- адсорбция на нерастворимых носителях;

- включение в поры геля;

- пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);

- включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.

Способы иммобилизации ферментов: а - адсорбция на нерастворимых носителях, б - включение в поры геля, в - отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны, г - использование двухфазной реакционной среды

Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из существующих способов иммобилизации ферментов, начало ей было положено еще в 1916 г. Этот способ достаточно прост и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшегося белка иммобилизованный фермент готов к использованию. Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Вклад каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и функциональных групп на поверхности молекулы фермента. Взаимодействия с носителем могут оказаться настолько сильными, что сорбция биокатализатора может сопровождаться разрушением его структуры. Например, при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах цитодекса клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф поверхности частиц носителя. Преимуществом метода адсорбционной иммобилизации является доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в роли носителей. Им также можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость. Важным фактор - простота применяемых методик. При адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента, так как связывание белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое. К сожалению, прочность связывания фермента с носителем не всегда достаточно высока, что ограничивает применение метода. К недостаткам адсорбционной иммобилизации следует отнести отсутствие общих рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий иммобилизации конкретного фермента.

Некоторых из перечисленных затруднений можно избежать при иммобилизации ферментов путем включения в гели. Суть этого метода иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в окружающий раствор, т.е. находится в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой фермента и окружающими ее полимерными цепями. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится значительная часть всего объема геля. Например, широко применяемые гели полимеров акриловой кислоты в зависимости от концентрации полимера и его природы содержат от 50 до 90% воды.

Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще.

Общий принцип иммобилизации ферментов с использованием мембран заключается в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой перегородкой. Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но непреодолима для крупных молекул фермента. Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой. Водный раствор фермента можно включать внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (микрокапсулирование). При двойном эмульгировании получается водная эмульсия из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие капли водного раствора фермента. Через некоторое время растворитель затвердевает, образуя сферические полимерные частицы с иммобилизованным в них ферментом. Если вместо водонерастворимого отвердевающего полимера используются жидкие углеводороды с высокой молекулярной массой, метод называется иммобилизацией путем включения в жидкие мембраны. К модификациям метода иммобилизации ферментов с использованием полупроницаемых оболочек относятся также включение в волокна (при этом вместо капель, содержащих ферменты, получаются нити) и включение в липосомы. Применение систем мембранного типа позволяет получать иммобилизованные препараты с высоким содержанием фермента. Метод, как и предыдущий, достаточно универсален, т.е. применим как ферментам, так и к клеткам, а также их фрагментам. Благодаря высокому отношению поверхности к объему и малой толщине мембраны удается избежать значительных диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций. Основной недостаток мембранных систем - невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов.

При иммобилизации ферментов с использование систем двухфазного типа ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы достигается благодаря его способности растворяться только в одной из фаз. Субстрат и продукт ферментативного превращения распределяются между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, которые невозможны при применении жестких носителей с ограниченным размером пор.

Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем. Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Химическая иммобилизация ферментов является искусством, уровень которого определяется, в первую очередь, умением экспериментатора. Основная задача экспериментатора заключается в формировании новых ковалентных связей в молекуле фермента при использовании его функциональных групп, несущественных для проявления его каталитической активности. При химической модификации фермента его активный центр желательно защищать. При сопоставлении различных приемов иммобилизации химические методы для крупномасштабных биотехнологических процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности и дороговизны. В промышленных процессах обычно используются те или иные методы физической иммобилизации.

7. Оборудование для производства ферментов

Вибрационная установка винтового типа непрерывного действия.

Вибрационная установка винтового типа непрерывного действия производительностью 3,5 т/сутки.

Состоит из рамы, бункера для отрубей, стерилизатора, вибростерилизатора и четырех последовательно соединенных герметизированных вертикальных вибрационных конвейеров лоткового типа. Собственно растильной частью установки являются первые три конвейера, составляющие соответственно первую, вторую и третью зоны роста. Четвертый конвейер предназначен для сушки культуры.

Каждый виброконвейер снабжен индивидуальным приводом с дебалансовыми вибраторами, трубопроводами для подачи среды соответственно на второй, третий и четвертый конвейеры.Стерильная засеянная питательная среда из вибростерилизатора поступает в приемный лоток первого виброконвейера и под влиянием виброимпульсов, сообщаемых желобу от вибропривода, перемещается снизу вверх. Из верхнего лотка первого виброконвейера среда по трубе поступает в нижний приемный лоток второго виброконвейера. Конструктивно второй виброконвейер отличается от первого только тем, что лотки его снабжены водяной рубашкой для отвода теплоты, выделяемой в период активного роста культуры. Для отвода продуктов жизнедеятельности микроорганизмов во второй виброконвейер подается кондиционированный воздух.

Из верхнего лотка второго виброконвейера среда поступает по трубе в нижний приемный лоток третьего виброконвейера, устройство которого аналогично первому. Скорость движения среды по лоткам виброконвейеров составляет 2...3 мм/с, а диаметр и число витков всех виброконвейеров рассчитаны так, чтобы среда находилась в непрерывном движении в течение всего процесса роста.Из верхнего лотка третьего виброконвейера выращенная культура гриба по трубе поступает в нижний приемный лоток четвертого конвейера на сушку. Устройство этого виброконвейера идентично второму, но в рубашку лотков подают воду температурой 70 °С и дополнительно подводится воздух температурой 70...80 °С. Выращенная и высушенная культура гриба выгружается, а воздух после бактериальной очистки удаляется. Стерильный кондиционированный воздух, необходимый для аэрации в количестве 500... 1800 м3 на 1 т культуры, подается кондиционером.



Ферментаторы с механическим перемешиванием барботажного типа

Ферментаторы с механическим перемешиванием барботажного типа широко применяются для стерильных процессов выращивания микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ.

Ферментатор такого типа представляет собой вертикальный аппарат цилиндрической формы, изготовленный из стали Х18Н10Т или биметалла с эллиптическими крышкой и днищем. Отношение высоты к диаметру равно 2,6 : 1. На крышке аппарата расположен привод перемешивающего устройства, состоящий из электродвигателя, редуктора, муфты, подшипника и сальника. Здесь же установлены штуцеры для загрузки питательной среды и посевного материала, подачи и вывода воздуха, смотровые окна, люки для погружения моющей механической головки; предохранительный клапан.Для выгрузки культуры в днище аппарата предусмотрен спускной штуцер. Внутри корпуса проходит вал с закрепленными на нем перемешивающими устройствами, состоящими из закрытых турбин. Барботер соединен с трубой для подвода воздуха и выполнен в виде разборного ромба из перфорированных труб. В верхней его части расположены в шахматном порядке 2000...3000 отверстий. Вал и перемешивающие устройства с муфтами приводятся во вращение от мотор-редуктора.Ферментатор оборудован рубашкой, состоящей из 6...8 ярусов-секций. Каждая секция состоит из 8 навитых опоясывающих каналов, выполненных из уголкового профиля. площадь поверхности охлаждения рубашки 60 м2, внутренняя поверхность которой состоит из змеевиков диаметром 600 мм и общей высотой 2,4 м.Ферментатор рассчитан для работы под избыточным давлением 0,25 МПа и стерилизации при 130... 140 °С, а также для работы под разрежением. В процессе выращивания микроорганизмов давление внутри ферментатора в пределах 50 кПа; расход стерильного воздуха до 1 м3/мин. Высота столба жидкости в аппарате 5...6 м при высоте аппарата более 8 м. Для обеспечения стерильности процесса предусмотрены торцевые уплотнения вала перемешивающего устройства с паровой защитой. Торцевые уплотнения рассчитаны для работы при давлении до 0,28 МПа и остаточном давлении не ниже 2,7 кПа, температуре 30... 250 °С и частоте вращения вала до 500 мин-1. С помощью торцевых уплотнений удается практически полностью предотвратить утечку среды или попадание воздуха в полость аппарата в месте вывода вала. Торцевые уплотнения, соприкасающиеся с рабочей средой, изготовляются из стали Х18Н10Т и Х17Н13М2Т, а также из титана ВТ-10. Длительность безотказной работы торцевого уплотнения не менее 2000 ч при ресурсе работы 8000 ч. Допустимое радиальное биение вала в зоне торцевого уплотнения не более 0,25 мм, угловое биение вала не более 0,25°.

Наибольшее распространение получили эрлифтные дрожже-растильные аппараты с внутренним циркуляционным контуром. Данные конструкции ферментаторов не имеют механических средств пеногашения. Пена гасится под тяжестью столба жидкости при ее циркуляции. Воздух в аппарат проходит по центральной трубе в кювету, где из подаваемого сусла и жидкости, содержащейся в нижней части аппарата, образуется газожидкостная смесь, которая движется по внутреннему диффузору. Часть воздуха отделяется от пены и выходит в атмосферу через отверстие в крышке аппарата, а другая часть вместе с пеной опускается по кольцевому зазору между диффузором и стенкой.При движении вниз пена гасится. Кратность циркуляции достигает 1,5...2 объема рабочей жидкости в минуту. Промышленные аппараты имеют высоту 12... 15 м. Пена поднимается до высоты 10... 12 м. Охлаждение ферментатора производится орошением наружной стенки и подачей воды в рубашку диффузора. Расход воздуха составляет 20 м3 на 1 кг сухих дрожжей.

Цилиндрический эрлифтный ферментатор

Цилиндрический эрлифтный ферментатор предназначен для непрерывного выращивания дрожжей на сусле, которое является отходом гидролизно-дрожжевого производства. Он представляет собой стальной сварной корпус с днищем в виде усеченного конуса и конической крышкой с центральным отверстием. Внутри аппарата установлены четыре диффузора, которые создают четыре самостоятельно циркулирующих потока. Через коллектор в центральные трубы каждого диффузора, на конце которых имеются конус и кювета, подается сжатый воздух.На крышке аппарата установлен распределительный бачок, куда через штуцера поступают бражка, сусло, засевные дрожжи и аммиачная вода. Все компоненты смешиваются и образуют, питательную смесь, которая свободным потоком по трубам диаметром 100 мм поступает вниз, в кюветы аэрирующего устройства.Питательная смесь, переливаясь через край кюветы, смешивается с воздухом, выходящим через щели под кюветой. Образовавшаяся воздушно-жидкостная эмульсия поднимается вверх по диффузору к отбойнику, откуда, разрушаясь, стекает вниз. Для наружного охлаждения стенок аппарата установлен ороситель в виде коллектора.

8. Применение иммобилизованных ферментов

Особенно ощутимый вклад иммобилизованные ферменты внесли в тонкий органический синтез, в анализ, в медицину, в процессы конверсии энергии, в пищевую и фармацевтическую промышленности. Для синтетической органической химии важно то, что в двухфазных реакционных средах фермент сохраняет каталитическую активность даже при исключительно малом содержании воды, поэтому равновесие катализируемой реакции (выход продукта) экспериментатор может регулировать в широких пределах, подбирая нужный органический растворитель. Иммобилизованные ферменты дали толчок к созданию принципиально новых методов "безреагентного" непрерывного анализа многокомпонентных систем органических (в ряде случаев и неорганических) соединений. В будущем важную роль в контроле окружающей среды и в клинической диагностике должны сыграть такие методы, как биолюминесцентный анализ и иммуноферментный анализ. В медицине иммобилизованные ферменты открыли путь к созданию лекарственных препаратов пролонгированного действия со сниженной токсичностью и аллергенностью. Иммобилизационные подходы способствуют решению проблемы направленного транспорта лекарств в организме. Проблемы биоконверсии массы и энергии в настоящее время пытаются решить микробиологическим путем. Тем не менее иммобилизованные ферменты вносят ощутимый вклад в осуществление фотолиза воды и в биоэлектрокатализ. Заслуживает внимание и использование иммобилизованных ферментов в процессах переработки лигноцеллюлозного сырья.

Иммобилизованные ферменты могут использоваться и как усилители слабых сигналов. На активный центр иммобилизованного фермента можно подействовать через носитель, подвергая последний ультразвуковой обработке, механическим нагрузкам или фотохимическим превращениям. Это позволяет регулировать каталитическую активность системы фермент - носитель под действием механических, ультразвуковых и световых сигналов. На этой основе были созданы механо- и звукочувствительные датчики и открыт путь к бессеребряной фотографии. Промышленные процессы с применением иммобилизованных ферментов внедрены прежде всего в пищевую и фармацевтическую промышленность. В пищевой промышленности с участием иммобилизованных ферментов идут процессы получения глюкозо-фруктовых сиропов, глюкозы, яблочной и аспарагиновой кислоты, оптически активных L- аминокислот, диетического безлактозного молока, сахаров из молочной сыворотки и др. В медицине иммобилизованные ферменты используются также как лекарственные препараты, особенно в тех случаях, когда необходимо локальное воздействие. Кроме того, биокатализаторы широко используются в различных аппаратах для перфузионной очистки различных биологических жидкостей. Возможности и перспективы использования в медицине ферментов в иммобилизованном состоянии гораздо шире, чем достигнутые на сегодняшний день, именно на этом пути медицину ждет создание новых высокоэффективных методов лечения.

9. Рынок ферментов и ферментных препаратов

Объем отечественного рынка ферментов, по данным Минпромнауки, составляет около 40 млн долларов, при этом на долю российских производителей приходится 30%. Однако подобное соотношение импортной и отечественной продукции характерно не для всех областей использования ферментов. Основными потребителями отечественных ферментов и ферментных препаратов являются спиртовая промышленность и кормопроизводство.Ферменты представляют собой органические вещества, производимые живыми клетками, они способны инициировать и регулировать специфические химические реакции снаружи или внутри живых клеток, при этом в самих ферментах не происходит какого-либо изменения их химической структуры.

Взаимообусловленные факторы, разнонаправленные тенденции

Развитие рынка ферментов зависит от двух взаимосвязанных факторов -- возможности и экономической целесообразности их применения и возможности их промышленного производства. Слабое использование этих препаратов в недавнем прошлом в различных отраслях пищевой промышленности (как, впрочем, и в других отраслях) объяснялось, с одной стороны, отсутствием способов промышленного производства самих ферментов по экономически целесообразным ценам, а с другой -- отсутствием способов их применения в отраслях-потребителях. Однако совершенствование производства ферментных препаратов и технологий их применения в различных отраслях промышленности способствовало активизации их использования.

При этом появление интереса в отраслях-потребителях к какому-либо новому ферменту побуждает производителей разрабатывать и предлагать рынку его пробные образцы. Если новый фермент не находит спроса по предлагаемым ценам, проект на время откладывается. Это означает, что, скорее всего, будет совершенствоваться технология производства данного фермента, чтобы она стала коммерчески выгодной. Однако возможна ситуация, когда меняется конъюнктура рынка, т. е. вырастают цены на химические препараты, которые применяются в технологиях отраслей-потребителей. В таком случае могут быть востребованы данные ферменты по первоначальной цене или по цене, близкой в первоначальной. Следует отметить, что со временем совершенствование технологий производства ферментов приводит к снижению цен на них. Так, мировые цены на альфа-амилазу и глюкоамилазу за последние 10 лет снизились в два раза, при той же или даже большей эффективности самих ферментов.

Существует несколько направлений снижения себестоимости производства ферментов. Одно из них -- техническое усовершенствование процесса получения хорошо известного продукта, разработка более экономичных процессов, зачастую на основе новых модификаций бактерий. Работа в этом направлении позволяет снижать затраты на производство ферментов и, соответственно, цены. Наглядным примером может служить развитие промышленного производства липаз. Они стали востребованы масложировой промышленностью, когда цены на них на мировом рынке снизились до приемлемого для потребителей уровня.

Другое направление -- поиск новых ферментов с интересными свойствами, способных более эффективно выполнять аналогичные задачи. Для этого специалисты ведут поиск новых бактерий в различных регионах мира, из которых впоследствии выбирают самые эффективные продуценты, подходящие для коммерческого использования.

Аналитики отмечают, что динамика стоимости производства химических препаратов, которые производятся из не возобновляемого сырья, и динамика стоимости производства ферментных препаратов за последние годы имеют противоположные тенденции, первая -- увеличивается, вторая -- снижается. Это позволяет все шире использовать биотехнологические процессы во многих отраслях. Немаловажную роль в развитии рынка ферментов играет и тот факт, что во многих развитых странах существенно возрос интерес к экологически чистым продуктам. Это подтверждается тем, что темпы роста производства таких продуктов питания (около 25% в год) значительно опережают общий рост производства продуктов питания. Так, объемы их производства вышли на уровень 25 млрд долларов. По оценке зарубежных специалистов, к 2020 году этот объем увеличится на порядок. В настоящее время в странах Евросоюза, в США и Японии уже существуют национальные системы стандартов по экологически чистым продуктам питания. В этих программах доминирующую роль играют ферменты и ферментные препараты, которые являются натуральными биологическими препаратами и позволяют исключить применение различных химических и гормональных препаратов. Помимо этого, использование ферментов в производстве продуктов питания практически всегда снижает нагрузку на экологическую обстановку вокруг предприятия. Эти природные организмы либо являются биоразлагаемыми, либо их присутствие не оказывает негативного воздействия на окружающую среду.

На рубеже 90-х годов прошлого века на отечественный рынок пришли зарубежные компании -- производители ферментов. Время активного развития российской пищевой промышленности, увеличения потребления в производстве пищевых продуктов различных ингредиентов и широкого проникновения зарубежных производителей пищевых ингредиентов на наш рынок совпало с кризисом отечественной микробиологической науки и промышленности.

Литература

1. Ленинджер А. Биохимия: пер с англ. - М.: Мир,

2. Филлипович В.Б. Основы биохимии. - М.: Высшая школа

3. Микробные ферменты и биотехнология (Под ред. В.М. Фогарти). / Пер. с англ

4. Enzymes in Industry: Production and Applications; изд.2

Материалы интернет ресурсов

1. http://www.agro-mash.ru

2. http://www.bionick.ru

3. http://www.prodindustry.ru

4. http://www.ferment.ru/