Чернобыль 20 лет спустя

Чернобыль 20 лет спустя

В апреле 1986 г. взорвался реактор Чернобыльской атомной электростанции (ЧАЭС), при этом произошел мощный выброс радиоактивных веществ, что привело к загрязнению значительных по площади территорий и массовому облучению людей. В истории человечества это, к сожалению, не единственная подобного рода катастрофа и, как ни печально, видимо, не последняя. И уж коли это случилось, важно выявить и проанализировать все негативные последствия чернобыльской трагедии для современного и будущих поколений.

Тридцатикилометровая зона отчуждения ЧАЭС - уникальный полигон для таких исследований, ведь на ограниченной территории резко изменился целый комплекс экологических факторов, и на фоне этих изменений воспроизводятся представители множества таксономических групп живых организмов, в том числе высшие млекопитающие.

Вокруг Чернобыля сложилось немало легенд. Еще совсем недавно горячо обсуждали появление в зоне отчуждения всевозможных монстров. Речь шла о чудовищных мутациях, ускорении эволюции. Но все это - по слухам. Какие же генетические изменения можно реально связать с Чернобылем?

Куда делись мутанты? Вся радиобиология выросла из работ Г.А.Надсона, С.Г.Филиппова, Г.Меллера, Л.Стадлера и Н.В.Тимофеева-Ресовского, которые изучали мутации у дрожжей, дрозофилы и других многоклеточных организмов, возникшие под воздействием ионизирующего излучения. Эти работы положили начало новой дисциплине - радиационной генетике. Благодаря многочисленным исследованиям последних десятилетий теперь уже известно, что элементарные частицы (г-кванты, электроны, протоны и нейтроны), попадая в ядро клетки, вызывают ионизацию молекул воды, что приводит к нарушению химической структуры ДНК и возникновению дополнительных, индуцированных радиацией мутаций. Сделаны даже строго обоснованные расчеты, определяющие соотношение между дозой воздействия и количеством мутаций. В лабораторных условиях при высоких дозах облучения появление мутаций и мутантных организмов удается уловить, и частота их появления, в общем, соответствует теоретически ожидаемому эффекту.

Мутации в соматических клетках не делают организм мутантным, но они могут повышать риск развития онкологических заболеваний. Если же мутации происходят в половых клетках, должна повышаться частота рождения мутантов в следующем поколении. Тем не менее до сих пор не удавалось выявить мутации в кодирующих участках ДНК или доказать, что под воздействием радиации повысилась частота онкологических заболеваний (кроме рака щитовидной железы) у потомков людей, переживших аварию на ЧАЭС. Не удалось это также американским и японским ученым, проводившим многолетние генетические исследования после взрывов атомных бомб в Хиросиме и Нагасаки. В чем же дело?

Как известно, даже при отсутствии в окружающей среде мутагенов генетические нарушения (спонтанные мутации) возникают в организме постоянно, но только малая их часть сохраняется дольше двух-трех клеточных делений. Состояние генома контролируют сложные, комплексные механизмы, обеспечивающие защиту от возникающих ошибок, повреждений генетического материала. Восстановление (репарация) структуры ДНК - обязательное условие существования всех биологических объектов, от простейших одноклеточных до высокоорганизованных многоклеточных [1]. Мутации, которым все же удается уклониться от систем контроля генетического постоянства, события редкие; реальную опасность представляют как раз те, что могут сохраняться в ряду клеточных поколений.

Предполагается, что в гаплоидном геноме одной клетки в среднем находится около 100 тыс. потенциальных (пурин/пиримидиновых) сайтов мутирования[2]. Получается, что один такой сайт приходится на 3*10⁴ нуклеотидов в среднем по геному, или на 3*10? нуклеотидных последовательностей структурных генов, кодирующих синтез белков. В то же время в структурных генах человека, по современным данным, частота спонтанных мутаций (нуклеотидных замещений, вставок-делеций и более комплексных изменений), которые могут оставаться нерепарированными, составляет 5*10^-11 на одно основание за клеточный цикл [3]. Видно, что потенциальные генетические дефекты реализуются в мутации по структурным генам много реже, чем возникают. Чтобы найти одну мутацию по определенному гену, надо исследовать как минимум 100 тыс. детей. По-видимому, с этим и связаны “неудачи” ученых, работавших в Японии: даже если после взрывов частота изменилась, то обнаружить это можно, изучив не десятки тысяч, как это было сделано, а сотни тысяч детей. Иной путь - поиск новых экспериментальных подходов к изучению генетических последствий радиации.

В 80-х годах прошлого столетия в клетках эвкариот была открыта некодирующая (сателлитная) ДНК, которая не транскрибируется. Она часто встречается в области центромеры и является частью гетерохроматина. Состоит сателлитная ДНК из коротких последовательностей, повторяющихся в тандемном порядке. В зависимости от величины повторов различают микро- и минисателлиты. Мутации в них (изменение числа повторов) происходят с неимоверной частотой, более чем в тысячу раз большей, чем для структурных генов. Микро- и минисателлиты были предложены в качестве потенциальных маркеров для исследования генетических эффектов ионизирующих излучений на уровне ДНК.

Десять лет назад были опубликованы первые результаты экспериментов, выявившие двукратное повышение частоты мутаций по минисателлитным локусам у детей, родители которых участвовали в ликвидации аварии на ЧАЭС, в сравнении с потомками необлученных родителей [4]. Впоследствии были получены новые свидетельства повышения частоты мутаций у детей ликвидаторов, но в качестве праймера в этот раз использовался 19-21 олигонуклеотид, представленный ди- или тринуклеотидным микросателлитным повтором [5]. Кроме того, были получены данные об увеличении мутаций по микросателлитным локусам у птиц, обитающих в зоне отчуждения ЧАЭС [6].

Естественно, эта проблема заслуживает особого внимания и изучения. Однако пока мини- и микросателлитные тандемные повторы остаются недостаточно исследованной частью генома высших организмов как в отношении их внутренней гетерогенности, скоростей эволюции, факторов, влияющих на их изменчивость, так и в отношении фенотипических проявлений мутирования. Иными словами, результаты этих исследований пока не позволяют прогнозировать последствия произошедших изменений для здоровья будущих поколений. Но уже сейчас ясно, что радиация все же привела к генетическим изменениям среди потомков облученных родителей, и этот процесс, видимо, затронул не только сателлитную ДНК. Возможно, проблема в том, что после взрыва реактора или атомной бомбы популяции живых организмов имеют дело с долговременными (хроническими) низкодозовыми воздействиями, которые трудно смоделировать в лабораторных условиях.

После чернобыльской катастрофы явно повысилась частота встречаемости соматических клеток с хромосомными поломками и у животных, и у людей в разных регионах (в 1987 г. это было зарегистрировано даже у жителей Дании). Правда, до сих пор неясно, связано ли это с тем, что они чаще возникают, или с тем, что защитные системы организма медленнее их устраняют. Судя по всему, всевозможные системы отбора очень эффективно борются и с мутациями, которые появляются в половых клетках, именно поэтому их так трудно зафиксировать.

Ученые из Института молекулярной биологии и генетики Национальной академии наук Украины, С.С.Малюта и А.И.Соломко, выявили повышенную смертность у лабораторных мышей, подвергшихся ионизирующему облучению в зоне отчуждения ЧАЭС, на самой ранней стадии развития эмбриона - до его имплантации в матку. Создалось впечатление, что если все же имплантация удалась, то дальше должна родиться нормальная мышь. В результате искусственного культивирования ранних эмбрионов, полученных от облученных мышей, установлено, что у некоторых из них запаздывают стадии дробления яйца. Хорошо известно, что клеточное деление может задерживаться из-за повреждений генетического материала. По-видимому, в этом кроются причины гибели зародышей, несущих мутации, на ранней стадии развития.

Таким образом, на вопрос о том, куда делись мутанты, видимо, можно ответить следующим образом - мутанты не родились, и произошло это скорее всего потому, что либо не формируются гаметы из поврежденных премейотических клеток, либо несущие их эмбрионы элиминируются на ранних стадиях дробления или оказываются неспособны к имплантации.

Не все гены хороши для новых условий существуют данные, свидетельствующие об увеличении ранней (до года) смертности детей в европейских странах после 1986 г. [7]. Возможно, что произошло это вследствие чернобыльской аварии, но тогда хотелось бы знать, какие же должны быть уровни радионуклидного загрязнения, чтобы в популяции млекопитающих (в данном случае человека) возросла смертность новорожденных и, соответственно, каковы должны быть поглощаемые живыми объектами дозы облучения, чтобы изменилась генетическая структура этой популяции в поколениях?

Оказывается, это довольно непростой вопрос. Главным образом потому, что на нашей планете есть множество регионов, где уровень естественного ионизирующего излучения в десятки, а то и в сотни раз выше среднемирового. Например, годовая доза облучения жителей провинции Рамзар в Иране составляет примерно 260 м^Зв (для сравнения - в среднем в мире она не превышает 3.5 м^Зв в год). Тем не менее там не выявлено ни повышенной смертности, ни появления детей с врожденными дефектами развития. В то же время установлено, что клетки крови жителей Рамзара обладают удивительной устойчивостью к радиоактивному излучению. Так, экспериментальное облучение клеток их периферической крови в дозе 1.5 Гр приводило к существенно меньшему возникновению клеток с цитогенетическими аномалиями по сравнению с клетками крови жителей областей с низким естественным радиоактивным фоном [8].

К настоящему времени в литературе появились и другие данные, которые свидетельствуют о том, что у жителей разных районов с повышенным радиоактивным фоном из поколения в поколение идет селекция на увеличение в популяциях доли радиорезистентных людей [9-13].

Замечу, что среди 116 тыс. отселенных из чернобыльской зоны только около 5% людей получили дозу облучения больше 100 мЗв в год, и именно эта доза (почти в три раза меньшая, чем в Рамзаре) считается тем пределом, после которого начинаются отчетливые увеличения частот онкологических заболеваний [14].

Таким образом, реальную опасность представляет не сама полученная доза ионизирующего излучения, а ее “новизна” для данной популяции, вида или видовых сообществ. Очевидно, что для жителей Рамзара увеличение годовой дозы на 3.5 м^Зв вряд ли будет приводить к каким-либо последствиям для здоровья, но для большинства европейских популяций, не встречавшихся в ряду поколений с дозами выше 1 м^Зв в год, такое изменение может привести к уходу из генофонда радиочувствительных особей и, соответственно, к изменению генетической структуры популяций.

В нашем отделе был выполнен сравнительный анализ частот встречаемости различных хромосомных поломок в клетках крови подростков 14-15 лет, получивших дозы ионизирующего излучения около 30 м^Зв. Оказалось, что у них статистически достоверно чаще встречаются клетки со стабильными хромосомными аномалиями, такими как транслокации, инверсии, инсерции. Полученные данные свидетельствуют о том, что в крови детей накапливаются клоны клеток, несущие перечисленные типы аномалий, которые, как известно, могут существенно осложнять формирование у них половых клеток (прохождение мейоза). Вполне вероятно, что у детей, получивших дозы ионизирующего излучения в эмбриональном периоде, будут возникать проблемы с репродукцией [15]. Однако реально оценить это можно будет только лет через двадцать, поскольку дети, родившиеся после чернобыльской катастрофы, только сейчас начинают вступать в репродуктивный период. Тогда же можно будет говорить и о том, как отразились события в Чернобыле на смертности и рождаемости людей в европейских странах.

Понимая, что отбор наверняка существует и на стадии мейоза во время образования гамет, мы обнаружили явление, выходящее за рамки простой выбраковки клеток с генетическими дефектами. Оказалось, что различные варианты (аллели) некоторых генов передаются потомкам с разной вероятностью.

Помимо людей, пострадавших от радиоактивного облучения, объектами исследований были разные линии лабораторных мышей, а также три вида полевок, отловленных в зоне отчуждения ЧАЭС, и крупный рогатый скот.

Поколения крупного рогатого скота. Основой экспериментального стада в хозяйстве “Новошепеличи” стали три коровы и бык, обнаруженные в 1987 г. в четырех километрах от реактора. Быка назвали Ураном, коров - Альфа, Бета и Гамма. Животные воспроизводились в условиях радионуклидного загрязнения около 200 Ки/км². Кроме того, специально с исследовательскими целями в 1990-1992 гг. сюда завезли еще 13 коров из относительно чистых районов. Этих коров мы рассматривали как нулевое - родительское поколение, от которых было получено пять следующих поколений, родившихся в условиях повышенного (примерно в 100 раз) уровня ионизирующего излучения.

Экспериментальное стадо насчитывало более двух сотен животных. Часть родительского поколения уже умерла, в 2002 г. умер и бык Уран, сохранявший репродуктивную функцию вплоть до 17 лет. За время существования этого стада Альфа, Бета и Гамма приносили в среднем по 0.9 теленка в год, а вот коровы первого поколения, появившиеся на свет в условиях повышенного радиационного фона, рожали почти в два раза реже. Создалось впечатление, что если коровы попадали в загрязненную зону после рождения, это почти не сказывалось на их репродуктивной функции, но вот если в этих условиях проходило внутриутробное развитие животных, и, в частности, закладка яйцеклеток у самок, то их плодовитость существенно снижалась.

Кроме того, в поколениях животных, родившихся в зоне, мы отчетливо наблюдали нарушение правильной сегрегации (1:1) при передаче аллелей от родителей к потомкам, что свидетельствует об отборе на уровне гамет. Мы обнаружили достоверные отклонения от него для четырех генов: трансферрина, церулоплазмина, рецептора к витамину D и пуриннуклеозидфосфорилазы. Что касается двух первых, кодирующих белки транспорта железа и меди, то здесь наследовались в основном аллели с наименьшей подвижностью в электрическом поле (т.е. с наименьшим электрическим зарядом и, предположительно, более стабильные), а для рецептора к витамину Д преимущество получал альтернативный вариант гена. У пуриннуклеозидфосфорилазы обычно наследовался вариант с высокой активностью. Наблюдалось также преимущественное рождение гетерозигот, что подтверждает действие радиации как селективного фактора.

В исследованиях достаточно отчетливо фиксировалась элиминация особей, для которых было характерно носительство генотипов, типичных для высокоспециализированной родительской голштинской породы. Благодаря тому, что животные экспериментального хозяйства всех поколений были доступны для анализа, легко можно было увидеть, какие варианты генов чаще всего не передаются потомкам, т.е. уходят из генофонда. Так, например, в первом поколении, родившемся в Чернобыле от быка Урана, потомки наследовали от коров чаще всего только один вариант гена трансферрина из трех возможных, D2. Причем этот вариант обычно типичен не для голштинов, а для более примитивных, но более устойчивых к неблагоприятным условиям воспроизводства пород, например таких, как древний серый украинский скот [16-18].

Процессы, благодаря которым “уходят” из популяции некоторые гены, хорошо видны при анализе количества рожденных телят в год на одну корову в экспериментальном стаде и количества погибших телят в возрасте до трех месяцев после рождения. Вероятно, в отличия генетической структуры потомства от родительского поколения существенный вклад вносит и высокая стерильность коров, родившихся в зоне отчуждения ЧАЭС.

Лабораторные линии мышей. На мышах трех разных лабораторных линий было обнаружено, что каждая из них характеризуется своим спонтанным мутационным спектром в клетках костного мозга, и только некоторые его характеристики меняются в связи с возрастом и сезоном исследования. Так, для линии мышей C57BL/6 типично нарастание хромосомных потерь (анеуплоидии) с возрастом и летом по сравнению с зимой. Для линии СС57W/Mv такие изменения преимущественно наблюдались по внутрихромосомным дефектам (хромосомным аберрациям); для линии BALB/c по доле полиплоидных клеток. Причем в условиях повышенного уровня ионизирующего излучения примерно в 100 раз (около 0.4 Гр в год) в виварии рядом с ЧАЭС наблюдалось повышение частот встречаемости у каждой линии только тех аномалий, спонтанная нестабильность которых обнаруживалась в контрольных условиях [19]. Например, у линии C57BL/6 увеличивалась частота анеуплоидных клеток, у линии СС57W/Mv - метафаз с хромосомными аберрациями. В данном случае повышение ионизирующего излучения не приводило к появлению новых характеристик в мутационных спектрах у мышей, а только усиливало проявление спонтанной нестабильности по отдельным, линейноспецифичным характеристикам таких спектров.

Следует отметить, что для мышей характерна отчетливая связь мутационных эффектов повышенного уровня ионизирующего излучения с возрастом. Так, у мышей линии CC57W/Mv “старые” животные в контрольных условиях отличались от “юных” более высокой частотой встречаемости различных цитогенетических аномалий, в частности одноядерных лейкоцитов с микроядрами. В то же время у “старых” мышей экспериментальной (чернобыльской) группы, подвергавшихся в течение жизни действию повышенного уровня ионизирующего излучения, частота таких аномалий оказалась меньше не только по отношению к своему возрастному контролю, но и по сравнению с “юными” чернобыльскими мышами [20].

Сходные данные были получены и другими авторами, показавшими, что стимуляция клеточного деления при высоких дозах ионизирующего облучения приводит к ускорению элиминации клеток с генетическими дефектами [21].

Полевки из зоны отчуждения ЧАЭС. У всех видов полевок, отловленных в местах с повышенным уровнем радионуклидного загрязнения (Янов - около 200 Ки/км2; Чистогаловка - около 500 Ки/км²; “Рыжий лес” - около 1000 Ки/км2), в клетках костного мозга накапливались именно те цитогенетические аномалии, повышенная изменчивость которых видоспецифична для мутационных спектров полевок из относительно чистых местообитаний. У рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) - метафазы с робертсоновскими межхромосомными слияниями, у обыкновенной полевки (Microtus arvalis) - анеуплоидия. Как и в случае с лабораторными мышами, облучение не вызывало появление качественно новых характеристик мутационных спектров, а только усиливало проявление тех, повышенная нестабильность которых наблюдалась у животных из чистых зон [22].

Более того, оказалось, что со временем, несмотря на сохранение высокого уровня радиоактивного загрязнения в местах отлова грызунов, у полевок разных видов постепенно уменьшалось количество животных с высокой частотой мутантных клеток в костном мозге. Похоже, в новых условиях размножались преимущественно особи, наиболее устойчивые к повреждающему действию ионизирующего излучения, - шел интенсивный отбор. Важно подчеркнуть, что такое уменьшение, свидетельствующее о постепенном накоплении радиорезистентных особей, у рыжей полевки отчетливо наблюдается только у животных, отловленных в “Рыжем лесу” с самым высоким уровнем радионуклидного загрязнения. Получается, что скорость отбора на радиорезистентность тем выше, чем выше уровень загрязнения. Однако даже в “Рыжем лесу” отбор устойчивых к радиоактивности особей произошел лишь к 26-му поколению полевок, которые размножаются дважды в год, т.е. спустя 13 лет после аварии. Учитывая репродуктивные особенности человека, нетрудно посчитать, что для появления людей с повышенной устойчивостью к ионизирующему излучению, как, например, в популяциях местности Рамзар в Иране, необходимо, чтобы прошло примерно 600 лет.

К чему ведет отбор? В стаде крупного рогатого скота, воспроизводящемся в экспериментальном хозяйстве “Новошепеличи”, генетическая структура все сильнее отклоняется от типичной для высокоспециализированной молочной породы в сторону менее специализированных пород. Видимо, преимущество для воспроизводства получают особи, наиболее устойчивые к генотоксическим воздействиям ионизирующего излучения. Интересно, однако, другое: не только ионизирующее излучение, но и другие неблагоприятные факторы приводят к постепенному накоплению в группах крупного рогатого скота одних и тех же аллелей. Обнаружено, например, сходство между коровами, которые рождаются в условиях Чернобыля, и теми, которые появились на свет в новом регионе разведения - после перемещения группы крупного рогатого скота серой украинской породы из Херсонской области в Сибирь.

Создается впечатление, что в новых экологических условиях интенсивность естественного отбора растет. Мутантные особи при этом не возникают или не выживают, поскольку практически любая мутация плохо совмещается с тем сочетанием (коадаптивным комплексом) генов, которое возникло благодаря длительному предшествующему отбору. Кроме того, новые условия способствуют воспроизводству особей, гетерозиготных по целому ряду генетических локусов.

В общем, популяционно-генетическая адаптация идет не путем возникновения и накопления новых, мутантных, вариантов генов, а за счет поиска подходящих для новых условий адаптивных комбинаций, состоящих из старых (ранее присутствующих в популяции) генов. Исследования генетических процессов у различных видов в зоне отчуждения ЧАЭС как раз и позволяют вычленить у них ту часть генофонда, которая ответственна за выживание в условиях повышенного давления естественного отбора.

Спустя два десятилетия после аварии в Чернобыле на основании всего вышесказанного можно сделать несколько неутешительных выводов:

- главная проблема для популяций разных видов (в том числе и человека), оказавшихся на загрязненной радиацией территории, заключается не в абсолютной величине полученных доз облучения, а в их новизне;

- главные популяционные последствия - не увеличение количества мутантных организмов, а обеднение генофонда: из воспроизводства уходят гены, связанные с повышенной чувствительностью организмов к новым для популяции условиям (в данном случае - повышению радиации). По-видимому, выживают особи с наименее специализированными генотипами;

- реальные генетические последствия чернобыльской катастрофы для популяций человека европейских стран будут известны еще очень нескоро, поскольку только сейчас дети, родившиеся после 1986 г., вступают в репродуктивный период.