Вплив фізіологічних факторів на ріст бактерії Е. coli штаму MC-4100

Реферат

На тему:Вплив фізіологічних та хімічних факторів на ріст бактерій E. coli штаму МС 4100

Зміст

Вступ

Огляд літератури

Escherichia coli

Загальні положення теорії оксидативного стресу

Алоксан

Матеріали і методи дослідження

Умови культивування E. coli

Вивчення впливу різних рівнів кисню на ріст E. coli

Вивчення впливу різних концентрацій алоксану на ріст E. coli

Вивчення впливу різного часу дії алоксану на ріст E. coli

Результати та обговорення

Висновки

Література

ВСТУП.

Існування будь-якої біологічної системи забезпечується реалізацією певної сукупності взаємозв'язаних процесів, результатом яких є матеріал для побудови тіла та енергія для забезпечення його функціонування. Перебіг цих процесів залежить як від функціонального стану організму, так і від наявності чи відсутності певних, необхідних для існування, елементів у навколишньому середовищі.

Кисень, як головний життєдайний елемент, є необхідною та невід'ємною складовою життєдіяльності організмів .Він приймає участь у реакціях обміну речовин та енергії, є субстратом для багатьох ферментів, які метаболізують різноманітні біологічні речовини.

Поряд з цим ряд біохімічних процесів, в яких він приймає участь, супроводжується появою так званих активованих форм кисню ( АФК) (супероксид - аніону , гідроксил-радикалу , а також пероксиду водню Н2О2 ) [ 8,9 ]. Є також певні хімічні речовини (наприклад, алоксан), за допомогою яких можна штучно підвищувати вміст АФК в живих об'єктах.

Актуальність даної роботи полягає в тому, що алоксан є відомим потужнім діабетогенним фактором, цитотоксична дія якого може реалізовуватись через посилення генерації АФК [ 1 ].

Активовані форми кисню - це високоактивні хімічні агенти, здатні сполучатися з будь-якими іншими молекулами. Подібні неконтрольовані перетворення можуть спричинити серйозну шкоду клітинним мембранам, молекулам білків, ліпідів та нуклеїнових кислот. Впливу АФК піддаються практично всі клітинні комплекси і компоненти [ 8 ]. На сьогоднішній день є відомості про те, що значна кількість патологічних станів в організмі супроводжується посиленням вільнорадикальних перетворень, накопиченням АФК і продуктів їх взаємодії з клітинними структурами. Цей факт доведено для хвороб серцево-судинної системи.

Наукова новизна полягає у використанні в якості модельного об'єкту нативних бактеріальних клітин.

Метою роботи було вивчення впливу різних факторів на ріст бактерій E. coli штаму МС 4100.

Завдання були:

- оцінити реакцію бактеріальних клітин E. сoli штаму МС 4100 на вплив різних концентрацій алоксану;

- дослідити часову динаміку впливу алоксану на бактеріальні клітини цього штаму;

- провести порівняльні дослідження впливу різних рівнів кисню в середовищі культивування на ріст E. coli.

Огляд літератури.

Escherichia coli.

Кишкова паличка відноситься до ентеробактерій. Ентеробактерії - це представники родини Enterobacteriacеаe. Мікроорганізми , що відносяться до цієї родини, багаточисельні і різноманітні за своїми біологічними властивостями. Їх номенклатура неодноразово піддавалась змінам і доповненням. Найбільш вживаними спочатку були класифікації Кауфмана ( 1963-1966), а пізніше - Юінга (1967 - 1972). В 1974 році було прийнято номенклатуру ентеробактерій, викладену у 8 - му виданні “ Определитель бактерий Берджи”, де головними критеріями для поділу бактерій на таксони були морфологія, фізіологія і біохімічні властивості та генетичний аналіз [ 11 ]. Для диференціації найбільш древніх категорій деяких бактерій використані особливі ознаки, такі як відношення до бактеріофагів та коліцинів, серологічні особливості тощо. У відповідності з класифікацією по Берджі родина ентеробактерій поділена на групи ( триби ), роди та види. Роди об'єднані в групи на основі гомології нуклеотидного складу ДНК.

Родина ентеробактерій включає 12 груп : Escherichia, Edwardisiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratіa, Proteus, Erwіnіa, Yersinia.

Група бактерій Escherichia об'єднує в собі лактозопозитивні і лактозонегативні різновидності мікроорганізмів. Серед них є велика кількість різновидностей, які відмінні між собою ферментативними, серологічними властивостями, рухливістю, патогенністю і т. п.

Природним місцем перебування ешеріхій є вміст товстого кишківника людей, тварин, більшості птахів, риб. Вони з випорожненнями потрапляють у зовнішнє середовище, де легко пристосовуються до нових умов.

Ешеріхії були відкриті німецьким педіатром Т. Ешеріхом в 1885 році. Він виділив їх із калу хворої на діарею дитини. Ешеріхії викликають кишкові інфекції та парентеральні форми ешеріхіозів.

Перша міжнародна класифікація ешеріхій прийнята на 5 - му Міжнародному конгресі мікробіологів в 1951 році. Рід Escherichia був поділений на 2 види : Escherichia coli ( E. coli ) та Escherichia fruendi. Потім було запропоновано в складі роду Escherichia розглядати тільки один вид - E. coli . Вид E. coli поділяють на серологічні типи на основі відмінностей їх антигенної структури.

Ешеріхії - це дрібні і середніх розмірів рухомі і нерухомі, грам-негативні, неспороносні, нерідко з капсулою палички, які добре ростуть на звичайних твердих і рідких поживних середовищах. За морфологічними, ферментативними і культуральними властивостями патогенні і непатогенні різновидності ешеріхій не відрізняються один від одного.

Ентеротоксичність пов'язана з двома токсинами : стабільний токсин ( ST ) і лабільний токсин ( LT ) ( по відношенню до температурного фактору ).

E. coli є показником санітарного стану об'єктів навколишнього середовища : води, харчових продуктів. Одні штами постійно живуть в кишківнику людини, інші - тільки частково або під час хвороби. E. coli - це представник нормальної мікрофлори кишківника. В процесі життєдіяльності вона виробляє ферменти, що сприяють травленню, синтезує деякі вітаміни ( наприклад вітаміни групи “ В “ ). Крім того, E. coli проявляє антагоністичну дію по відношенню до таких патогенних мікроорганізмів, як збудники дизентерії, черевного тифу, токсиноінфекції. Відсутність кишкової палички в товстому кишківнику призводить до дисбактеріозу, при цьому порушується нормальний склад мікрофлори кишківника. При низькій стійкості організму E. coli може проникати в інші органи і тканини та стати причиною важких патологічних процесів. Таким чином, E. Coli - типовий умовно-патогенний мікроорганізм.

Розміри E. coli - 0,5 - 3,0 х 0,5 - 0,8 мкм. Кишкова паличка - факультативний анаероб. Для неї властива значна ферментативна активність. Бактерії розщеплюють : лактозу, глюкозу, маніт, мальтозу, сахарозу та інші вуглеводи і спирти з утворенням кислоти та газу.

Основним структурним компонентом клітинної стінки бактерій є глікопептид муреїн, що побудований із залишків N - ацетилглюкозаміну та N - ацетилмурамової кислоти.

Ешеріхії розрізняють по антигенній структурі мікробної клітини. Є 3 типи антигенів ешеріхій : О - антиген ( соматичний ), К - антиген ( капсульний ), Н - антиген ( джгутиковий ). Термостабільний О - антиген є ліпополісахариднопротеїновим комплексом і розміщений в клітинній стінці бактерій. К - антигени ешеріхій різні : А, В, L, М. Н - антиген є тільки у рухомих штамів.

E. coli стійка до факторів навколишнього середовища. При 55 єС вона гине на протязі однієї години, при 60 єС - за 15 хвилин. В ґрунті і воді зберігається протягом 2 - 3 місяців.

Основні положення теорії оксидативного стресу.

Кисень є необхідним для більшості живих організмів за винятком невеликої кількості анаеробних бактерій.

У аеробних організмів ( наприклад, ссавців ) кисень бере участь в таких процесах, як метаболізм амінів, простагландинів, пуринів, стероїдів амінокислот та ін. [ 8 ]. Але найголовнішим процесом, в якому бере участь кисень, є процес утворення макроергічних зв'язків у молекулі АТФ в ході окисного фосфорилювання. Окисне фосфорилювання проходить у всіх без винятку аеробних організмів. В еукаріот цей процес проходить в мітохондріях, а в прокаріот - на плазматичній мембрані. Окисне фосфорилювання відбувається при проходженні електронів, відшеплених від різних субстратів, через електронно - транспортний ланцюг ( ЕТЛ ). Схема ЕТЛ у E. coli виглядає так :

цитохром В558 цит d О2

субстрат НАД · H + Н+ ФАД КоQ Н 2О

цитохром В556 цит о О2

Зі схеми видно, що у E. coli є два термінальні цитохроми. Вони каталізують чотирьохелектронне відновлення молекули кисню до води за таким рівнянням :

О2 + 4 Н+ + е- 2 Н 2О

При проходженні через ЕТЛ деякі електрони можуть виходити з нього і вступати в реакції, що призводять до утворення активованих форм кисню ( АФК ) [ 8 ]. АФК - це кисневмісні сполуки, що є значно більш хімічно активними, ніж молекула кисню О2. АФК є побічними продуктами метаболізму кисню. Утворення АФК відбувається при одноелектронному відновленні молекули кисню, продуктом якого є супероксид - аніон О2- . Супероксид - аніон утворюється за такою схемою :

О2 + е- О2-.

може утворюватися на рівні КоQ. Хімічна активність є невисокою порівняно з іншими АФК. може дисмутуватись до пероксиду водню Н2О2 , що також відноситься до АФК. Та найбільш активною АФК є гідроксил - радикал О. О утворюється в реакції Габера - Вайса. Реакція йде у кілька стадій. Один із варіантів реакції Габера - Вайса є реакція Фентона. Схеми реакції Габера - Вайса та реакції Фентона такі :

+ Н 2О2 О2 + О + О ( реакція Габера - Вайса)

Fe2+ + Н 2О2 Fe3+ + ОН· + ОН- ( реакція Фентона ) [ 8 ].

Пошкодження, ініційоні АФК, локалізуються в місцях знаходження іонів перехідних металів, в першу чергу заліза і міді. АФК атакують практично всі клітинні компоненти. Їх взаємодія з білками призводить до модифікації амінокислот - окислення сульфгідрильних груп цистеїну, імідазольних груп гістидину, кільцевих структур фенілаланіну, триптофану, тирозину. АФК взаємодіють з ДНК, викликаючи розриви полінуклеотидного ланцюга і модифікацію вуглеводної та азотистої частин, що може бути причиною точкових мутацій. Найбільш чутливими до АФК є поліненасичені жирні кислоти. Це часто є причиною виникнення ланцюгових реакцій в мембранах з утворенням перекисів ліпідів ( ліпід - ООН ).

Коли генерація вільнорадикальних форм кисню зростає більше, ніж потужність антиоксидантних систем, то виникає оксидативний стрес. В результаті відбувається підвищення інтенсивності утворення продуктів вільнорадикальної модифікації клітинних компонентів. Розрізняють два види оксидативного стресу : ендогенний і екзогенний. Ендогенний стрес полягає в тому, що в нормі в організмах, які живуть в аеробних умовах завжди утворюється якась невелика кількість АФК. У E. coli швидкість утворення АФК може коливатись в залежності від фази розвитку, в якій вона знаходиться, але стаціонарна концентрація підтримується на одному рівні за рахунок відповідної активності ферментів, що беруть участь у знешкодженні АФК. Екзогенний стрес принципово не відрізняється від ендогенного по механізму дії. Добавлені ззовні речовини включаються в окисно - відновні реакції, викликаючи генерацію , а екзогенний пероксид водню, будучи неполярною молекулою, вільно проникає всередину клітини.

В клітині є різні системи захисту від дії АФК. Вони умовно поділяються на 3 групи :

1) системи попередження утворення АФК;

2) системи переривання вільнорадикального ланцюга і знешкодження радикалів антиоксидантними ферментами;

3) системи виправлення пошкоджень ( репарація ).

Запобігти пошкодженню клітинних структур вільними радикалами можуть не тільки ферменти, а й деякі відносно низькомолекулярні сполуки, такі як вітаміни А та Е, убіхінон, катехоламіни, відновлений глутатіон та інші. Важливим компонентом захисту від дії АФК, попереджуючим вільнорадикальні процеси, є хелатування іонів перехідних металів спеціалізованими і неспеціалізованими білками, наприклад ферритином, трансферрином, альбумінами.

До ферментів, що приймають участь у захисті від вільних радикалів, відносяться :

супероксиддисмутаза ( СОД ), яка катаболізує супероксид - аніон;

каталаза та глутатіонпероксидаза, які деградують пероксид водню та гідроперкиси відповідно.

Вторинними ферментами антиоксидантного захисту є ферменти, функціонально пов'язані з глутатіоном. Глутатіон - S - трансферази каталізують кон'югацію відновленого глутатіону з нуклеофільними ксенобіотиками чи клітинними компонентами, пошкодженими АФК.

НАДФ - залежна глутатіонредуктаза відновлює окислений глутатіон за рахунок окислення НАДФ, який в свою чергу відновлюється глюкозо - 6 - фосфатдегідрогеназою. Реакції, що каталізуються СОД, каталазою, глутатіонпероксидазою та глутатіонредуктазою, виглядають так :

СОД

Н 2О2 + О2

каталаза

2Н 2О2 Н 2О + О2

глутатіонпероксидаза

2GSH + ROOH GSSG + ROH + H2O

глутатіонредуктаза

GSSG + НАДФ · Н + Н+ 2GSH + НАДФ+

В клітинах E. coli є три типи СОД :

Мn-вмісна СОД, що кодується геном sodА, її активність чутлива до зовнішнього оксидативного стресу;

Fе - СОД, що є конститутивною формою і синтезується як в аеробних, так і в анаеробних умовах;

· Си, Zn - СОД, що локалізується переважно у периплазмі.

Функціонування СОД підвищує рівень пероксиду водню, що спричиняє утворення гідроксильного радикалу в присутності супероксид - аніону чи іонів перехідних металів. Пероксид водню дисмутується під дією каталази до води і молекулярного кисню. У E. coli є два типи каталази - НР І і НР ІІ.

НР І є біфункціональним ферментом - каталазою - пероксидазою, що містить 2 групи протогему ІХ, які зв'язані з тетрамером з ідентичних субодиниць з молекулярною масою 80 кДа.

НР ІІ є монофункціональною каталазою з шістьома ізомерами гему d, що асоційовані з гексамерною структурою із субодиниць з молекулярною масою 84,2 кДа.

Важливою структурно - функціональною формою організації генетичної інформації, що забезпечує синтез ферментів, що утворюють антиоксидантний захист, є регулони SохRS та OxyR. Білок SохRS є сенсором супероксид - аніону і відповідає за активацію регулону SохRS . Активація цього регулону є каскадною. Білок Sох R є продуктом гену sox R. Активована форма білка SохR зв'язується з ДНК в специфічній ділянці і активує ген soxR , що призводить до підвищення рівня білка SохR. Білок SохR активує відповідні гени, що є відповідальними за відповідь E. coli на збільшення утворення супероксид - аніону [ 5 ]. SохR містить негемінове залізо і існує у формі димера. В кожному мономері є [ 2 Fе - 2S] - кластер, що відповідальний за регуляцію активності усього білка як транскрипційного фактора. До регулону SохRS входять гени, що кодують синтез таких ферментів як Мn - СОД, глюкозо - 6 - фосфатдегідрогеназа, фумараза С, аконітаза А, НАДФ · Н-фередоксинредуктаза, ендонуклеаза ІV.

Сенсором пероксиду водню є білок OxyR [ 7 ]. Він існує в двох формах : окисленій та відновленій, але тільки окислена форма відповідає за активацію регулону OxyR . Відновлена форма може зв'язуватись тільки з промотором гену оxyR, що відповідає за синтез білка OxyR.

Білок ОхуR в окисленому стані може репресувати промотор гену охуR і активувати гени кatG та ahpS у відповідь на оксидативний стрес. Ці гени кодують каталазу НРІ та алкілгідропероксидазу відповідно. У відповідь на підвищення концентрації пероксиду водню відбувається окислення цистеїнових залишків в положеннях 199 і 208 поліпептидного ланцюга цього білка ( ОхуR ) з утворенням внутрішньомолекулярного дисульфідного зв'язку, що робить білок ОхуR активним. Деактивація білка ОхуR відбувається ферментативно, при участі глутатіонредуктази, яка за рахунок відновленого глутатіону відновлює внутрішньомолекулярний дисульфідний зв'язок білка ОхуR [ 4,6 ]. Реакція окислення - відновлення ОхуR виглядає так :

глутатіонредуктаза

ОхуR ок + 8 GSH ОхуR відн + 4 GSSG

До регулону ОхуR входять гени, що відповідають за синтез каталази ( НР І ), алкілгідропероксидази, глутатіонредуктази та інші [ 7 ].

При збільшенні концентрації пероксиду водню в клітині на стаціонарній фазі активується - регулон. В активації - регулону важливу роль відіграє - фактор. Це білок, що є продуктом гену rpoS. Він є альтернативним транскрипційним у - фактором, який експресується в стаціонарній фазі або при нестачі поживних речовин. До RpoS - регулону входить не менше 50 генів, серед яких гени, що кодують Cu, Zn - СОД, НРI, НРІІ, екзонуклеазуІІІ, кислу фосфатазу, глутатіонредуктазу. Транскрипція, трансляція і стабільність фактора уs модулюються різними сигналами, включаючи цАМФ та УДФ - глюкозу [ 8 ].

Отже, можна зробити висновок, що механізми, задіяні в регуляції експресії генів, що відповідають за виживання клітин в умовах оксидативного стресу, складні, деякі гени входять до більш, ніж одного регулону, а отже регуляторами їхньої експресії можуть бути різні білкові і небілкові речовини, і є щонайменше два регулони, що відповідають за виживання клітин E.соlі в умовах підвищеного рівня пероксиду водню.

Наявність деяких ферментів, що входять до антиоксидантних систем, не є обов'язковою для всіх бактерій. Так, було показано, що при культивуванні Lactobacillus plantarum в умовах високого вмісту марганцю, активність СОД не проявлялась. Це може свідчити про те, що захист від супероксид - аніону здійснює якась низькомолекулярна Мn - вмісна речовина, яка функціонує аналогічно до СОД.

Останньою ланкою захисту від АФК є ферменти, які виправляють пошкодження - репарази. З приводу відновлення функцій білків, що були окислені АФК, відомо мало. Єдиним винятком є аконітаза. Встановлено, що цей фермент зворотньо інактивується супероксид - аніоном і пероксинітритом. Також відомо, що окислені форми білків швидше гідролізуються протеазами. Найбільше відомо про репарацію пошкоджених молекул ДНК. Найчастіше пошкоджуються такі два компоненти ДНК, як азотисті основи та дезоксирибоза. ДНК - глікозилази ініціюють репарацію, гідролізуючи зв'язок між азотистою основою і вуглеводом модифікованої основи. В E.соlі відомі такі ДНК - глікозилази як тимінглікольглікозилаза ( ендонуклеаза ІІІ ) та формамідпіримідинглікозилаза. В процесі репарації також беруть участь екзонуклеаза ІІІ та ендонуклеаза ІV. Остання є компонентом регулону SохRS. Окрему групу ендонуклеаз складають так звані “УФ-ендонуклеази” , що руйнують опромінену ультрафіолетом ДНК.

Алоксан

Алоксан представляє собою уреїд мезоксалевої кислоти [ 1,3 ]. Це кристалічна речовина. Він може існувати у двох формах : водній та безводній. Кристали алоксану розчинні у воді, ефірі і спирті. У водному розчині стабільність цієї сполуки залежить головним чином від температури і рН. При значеннях рН менше 3,0 алоксан досить стійкий навіть при кімнатній температурі. Але при рН 7,0 розчин треба зберігати при температурі нижче 4 є С для запобігання швидкого утворення алоксанової кислоти. Для кількісного визначення алоксану використовуються такі методи : газометричний, титрометричний, полярографічний, колориметричний флюорометричний.

Якісне визначення алоксану, введеного в організм експериментальної тварини, утруднене, так як він досить швидко він активується в результаті реакцій з SН- та NН - групами амінокислот і білків крові і тканин [ 1 ].

Алоксан широко застосовується в експериментальній діабетології для штучного викликання діабету. Довгий час для викликання діабету в піддослідних тварин користувалися методом часткового або повного видалення підшлункової залози. Зараз цей метод не так широко застосовується в зв'язку з появою хімічних моделей діабету. В хімічних моделях діабету застосовуються різні органічні речовини, що можуть вибірково вбивати в - клітини підшлункової залози. До хімічних речовин, які використовуються в експериментальній діабетології з цією метою, відносяться : дегідроаскорбінова кислота, стрептозотоцин, антиінсулінові сироватки, парабанова кислота, а також алоксан.

У піддослідних тварин у відповідь на введення діабетогенної дози алоксану спостерігається трьохфазна реакція : первинна гіперглікемія, гіпоглікемія, вторинна гіперглікемія. Якщо механізми гіпоглікемії і вторинної гіперглікемії практично з'ясовані, то щодо виникнення первинної гіперглікемії є різні погляди [ 1 ]. Одні дослідники пояснюють її як наслідок різкого зменшення кількості інсуліну в крові через інактивацію його алоксаном, інші припускають, що у виникненні первинної гіперглікемії відіграє роль нервова система.

Зараз є дані про підвищення рівня вільнорадикальних реакцій при цукровому діабеті, а сама молекула алоксану може потенційно слугувати джерелом утворення вільнорадикальних форм, що може бути однією з причин появи діабету [ 2 ]. Цікавим є також той факт, що алоксан в нормі міститься в біологічних субстратах. Алоксан був знайдений в екстрактах мозку, печінки і підшлункової залози людини, великої рогатої худоби, кроликів, птахів та інших тварин. Нормальний вміст алоксану в плазмі крові людей складає 0,15 - 0,25 мг / 100 мл. Після введення в кров глюкози спостерігається збільшення вмісту алоксану в плазмі крові.

Об'єкт, матеріали та методи досліджень.

В роботі використовувався штам Escherichia coli MC 4100 ( ara D 139 rel A1 thi rps L 150 flb B 5301 Д ( lac U 139 ) deo C7 pts F 25 ).

Умови культивування E.соlі.

Штам зберігався в стерильних умовах на агарових стовпчиках. Бактерії вирощували в поживному середовищі для культивування бактерій виробництва “ НДІ поживних середовищ “ ( м. Махачкала, Росія ), яке містить 10,05 г / л панкреатичного гідролізату кільки і 4,95 г / л хлориду натрію ( рН = 7,2 ± 0,2 ). Для цього готували середовище, що містило 1,5 % поживного бульйону, яке піддавали стерилізації на водяній бані на протязі 30 хвилин. Нічна культура вирощувалась протягом 18 годин в умовах глибинного культивування при температурі 37 є С. Для дослідження відповідний об'єм нічної культури розводили стерильним бульйоном у співвідношенні 1 : 50 та інкубували в умовах аерації, які створювалися завдяки прокачуванню повітря через середовище протягом 2 годин ( експоненційна фаза розвитку ) при температурі 37 є С. Оптична густина культури становила при цьому 0,45 одиниць ( довжина хвилі - 670 нм ).

Вивчення впливу різних рівнів кисню на ріст E.соlі.

Після розведення нічної культури стерильним бульйоном у відомому співвідношенні суспензію клітин вирощували в умовах глибинного культивування, культивування в середовищі, барбітованому стерильним повітрям (аерація ) та культивування в середовищі, барбітованому киснем ( оксигенація ). В усіх трьох випадках культуру вирощували до її виходу на стаціонарну фазу розвитку, вимірюючи оптичну густину через кожні 15 - 30 хвилин за допомогою фотоелектроколориметра при довжині хвилі 670 нм.

Вивчення впливу різних концентрацій алоксану на ріст бактерій E.соlі.

Після виходу суспензії бактерій на експоненційну фазу розвитку їх піддавали дії алоксану. Бактерії обробляли такими концентраціями алоксану : 10 мкмоль / л, 50 мкмоль / л, 100 мкмоль / л, 500 мкмоль / л, 1000 мкмоль / л та 1500 мкмоль / л протягом 30 хвилин при температурі 37є С. Контрольну суспензію клітин інкубували в тих же умовах без алоксану. Проби з суспензією і алоксаном шляхом серійних розведень розводились в 10000 разів, після чого здійснювався посів бактерій на чашки Петрі з агаровим середовищем. Чашки Петрі після цього інкубувались при температурі 37є С протягом 15 годин.

Вивчення впливу різного часу дії алоксану на ріст бактерій E.соlі.

Після виходу суспензії бактерій на експоненційну фазу розвитку їх піддавали окислювальному стресу. Окислювальний стрес викликали обробкою бактерій 500 мкмоль / л - концентрацією алоксану протягом 30 хвилин і 60 хвилин. Контрольні суспензії клітин інкубували в тих самих умовах без алоксану. Проби з суспензією і алоксаном та контрольні проби розводились в 10 000 разів, після чого здійснювався посів бактерій на чашки Петрі з агаровим середовищем. Чашки Петрі інкубувались при температурі 37є С протягом 15 годин.

Ріст бактерій в усіх випадках оцінювався по кількості колоній на чашках Петрі після закінчення періоду їх інкубації. Статистичну обробку отриманих результатів проводили за допомогою комп'ютерної програми “ Муnovа “ .

Результати та обговорення.

Відомо, що E.соlі є факультативним анаеробом, тобто може рости як в середовищі з низькою концентрацією кисню або взагалі без кисню, так і в середовищі, в якому концентрація кисню є високою. Тому ми дослідили ріст E.соlі в середовищах з різною концентрацією кисню. Нами були отримані криві росту бактерій штаму МС 4100 в умовах глибинного культивування, аерації та оксигенації ( мал. 1 ). Як свідчать отримані дані, бактерії виходять на експоненційну фазу розвитку при глибинному культивуванні та в умовах аерації вже через 1 годину після початку досліду. В умовах оксигенації лаг - фаза продовжується до 2 годин, після чого динаміка росту практично не відрізняється від динаміки росту аерованної суспензії. Це свідчить про те, що у випадку оксигенації штам потребує більше часу для адаптації антиоксидантних систем до підвищенного вмісту кисню в культуральному середовищі. Оксигенована та аерована культури характеризуються значно більшою продуктивністю, ніж культура, що розвивалась в анаеробних умовах. Хоча всі три культури досить швидко і за порівняно короткий проміжок часу адаптуються до умов культивування, середній час подвоєння клітин в експоненційній фазі розвитку суттєво відрізняються. Так, найбільший час подвоєння клітин в культурі, що розвивалася в умовах глибинного культивування - 2 години 45 хвилин. Майже однаковий цей показник у оксигенової та аерованої культур - 45 хвилин та 50 хвилин відповідно. Середній час подвоєння клітин розраховувався за формулою :

, де

Т - середній час подвоєння клітин, хв;

t1 і t2 - часові межі лінійного періоду експоненційної фази, хв;

ОД2 і ОД1 - значення оптичної густини, які відповідають часу t2 і

t1 відповідно ( при б = 670 нм ).

Продовженість експоненційної фази у оксигенованої культури - 2 години, у аерованої - 2 години, а у культури, що вирощувалась в умовах глибинного культивування - 4 години 30 хвилин.

У попередніх дослідженнях було виявлено, що після обробки нативних клітин E.соlі алоксаном, у них різко підвищувалась активність каталази. Було зроблено висновок, що алоксан викликає підвищення в клітинах концентрації АФК, а саме пероксиду водню. До подібного висновку дійшли і деякі вітчизняні та зарубіжні дослідники. Зважаючи на це, ми дослідили дію алоксану на бактерії штаму МС 4100.

При вивченні впливу різних концентрацій алоксану на ріст бактерій нами виявлено, що ріст бактерій достовірно підвищується порівняно з контролем при концентраціях алоксану в 500 мкмоль / л, 1000 мкмоль / л та 1500 мкмоль / л ( мал. 2 , табл. 1 ), що вказує на існування певного стимулюючого ефекту алоксану при таких концентраціях. Достовірне підвищення кількості бактерій при концентрації алоксану 500 мкмоль / л додатково підтверджується експериментами по вивченню росту бактерій при різній тривалості дії алоксану, де при концентрації алоксану 500 мкмоль / л після 30 хвилин інкубування також виявлене достовірне збільшення кількості бактерій порівняно з контролем. Це говорить про те, що потужність антиоксидантних систем даного штаму є достатньою для ліквідації цитотоксичного впливу алоксану при концентраціях до 1500мкмоль / л.

Результати вивчення виживання бактерій при дії алоксану в концентраціях 1500 мкмоль / л через 30 хв, 60 хв та відразу ж після додавання алоксану наведені на мал. 3 і в табл. 2. Аналіз наведених даних показує достовірне збільшення кількості бактерій порівняно з контролем після 30 та 60 хв інкубування. Звертає на себе увагу та особливість, що після 30 хв інкубування швидкість росту бактерій в контролі зрівнюється зі швидкістю росту культури, в яку був доданий алоксан. Це наводить на думку, що за час до 30 хв алоксан повністю метаболізується в клітинах і після цього вже ніяк не впливає на ріст культури.



Висновки.

1. Отримані в попередніх дослідженнях дані про роль алоксану як генератора активованих форм кисню, зокрема пероксиду водню, доповнені в даній роботі фактами, що вказують на певний позитивний фізіологічний вплив алоксану на клітини E.соlі.

2. Показане достовірне підвищення росту бактерій у відповідь на обробку клітин алоксану при концентраціях до 1500 мкмоль / л, що свідчить про стимулюючий вплив алоксану на даний штам.

3. Визначено максимальний час впливу алоксану на бактерії даного штаму, який дорівнює 30 хвилинам, після закінчення якого швидкість росту бактерій в суспензії, в яку було додано алоксан, знижується до швидкості росту бактерій в контрольній суспензії і далі вже не змінюється.

4. Виявлена різна продуктивність культури бактерій в залежності від вмісту кисню в культуральному середовищі, що відображається у відмінностях між середнім часом поділу клітин для різних культур.

Література.

1. Баранов В. Г. 1983. Экспериментальный сахарный диабет. Роль в клинической диабетологии. Ленинград : Наука, 1983.

2. Єфімов, Германюк. 1983. Цукровий діабет. Київ: Наука.

3. Лурьє Ю.Ю. Справочник по химии. М.: 1985.

4. Carmel-Нarel, O., Storz, G., 2000.Roles of glutathione - and thioredoxine - dependent reduction systems in the E.соlі and S. cerevisiae responses to oxidative stress . Annu. Rev. Biochem. 54, 439 - 461.

5. Amabile-Cuevas., C.F.,Demple,B., 1991. Molecular characterization of the sохRS genes of E.соlі : Two genes control a superoxide stress regulon. Nucleic Acids Res. 19, 4479 - 84.

6. Aslund, F., Zheug, M., Beckewith, J., Storz, G., 1999. Regulation of the OxyR transcription factor by hydrogen peroxide and the cellular thiol - disulfide status. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6161 - 65.

7. Christman, M.F., Storz, G., Ames, B.N., 1989. OxyR , a positive regulator of hydrogen peroxide - inducible genes in E.соlі and S. typhimurium, is homologous to a family of bacterial regulatory proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3484 - 88.

8. Лущак В. И., 2001. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий. Биохимия 66, 592 - 609.

9. Семчишин Г. М. Вплив різних рівнів кисню на ріст E.соlі // Вісник Прикарпатського університету. Серія : біологія. - 2001. - Вип. 1.- с. 112 - 117.

10. Семчишин Г. М. Біохімічні особливості антиоксидантних систем штамів E.соlі з різною толерантністю до кисню. Автореферат. Чернівці: 2002.

11. Вершигора. Мікробіологія. К.: Наука. 1997.

12. Fridovich, І., 1978. The biology of oxygen radicals. Science 201: 875-880.

13. Gregory, E.M., F. J. Yost, Jr., and I. Fridovich. 1973. Superoxide dismutases of E.соlі : intracellular localization and functions. J. Bacteriol. 115 : 987-991.

14. Ingledew, W.J., and R.K. Poole. 1984. The respiratory chains of E.соlі . Microbiol. Rev. 48 : 222 - 271.

15. Moody, C. S., and H.M. Hassan. 1982. Mutagenicity of oxygen free radicals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 2855 - 59.