Влияние значений рН и температуры на активность ферментов

Федеральное агентство по образованию

САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ Н.Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО

Биологический факультет

Кафедра биохимии и биофизики

Реферат

Влияние значений рН и температуры на активность ферментов

Выполнила

студентка 3 курса

Кочанова Ирина

Проверил

К.Б.Н. Мельников Г.В.

Саратов 2008

Содержание:

Введение

· Активность ферментов

· Общие методы определения активности ферментов

· Спектрофотометрические методы

· Спектрофлюорометрические метоы

· Колориметрические (фотометрические) методы

· Манометрические методы

· Другие методы

· Специальные методы определения активности пепсина и папаина

· Методы определения активности протеолитических ферментов

· Модификационный метод

· Определение пепсина по Ансону и Мирскому

· Определение протеолитических ферментов по Муру и Штейну

· Микрометод определения активности протеиназ А.П.Алексеенко

· Определение активности протеиназ по белковому субстрату

· Определение активности протеиназ по реакции с реактивом Фолина

· Влияние рН на активность ферментов

· Влияние температуры на активность ферментов

· Теплота инактивации ферментов

Заключение

Литература

Введение.

Ферменты, (от лат. fermentum - брожение, закваска) или энзимы, представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый живыми организмами для осуществления с высокой скоростью многих тысяч взаимосвязанных химических реакций, включая синтез, распад и взаимопревращение огромного множества разнообразных химических соединений. Жизнь и многообразие ее проявлений - сложная совокупность химических реакций, катализируемых специфическими ферментами. И.П. Павлов считал ферменты «возбудителями всех химических превращений» у живых существ. Как известно, важнейшим свойством живого организма является обмен веществ, ускоряющийся аппаратом, основой молекулярных механизмов, интенсивности которого являются ферменты. «Вся тайна животной жизни,- писал Д.И. Менделеев,- заключается в непрерывных химических превращениях веществ, входящих в состав животных тканей».

В настоящее время теоретические и практические достижения энзимологии используются в решении многих проблем биохимии и молекулярной биологии, включая их сравнительное и эволюционное рассмотрение. «Под знаком молекулярной энзимологии,- говорил на III Всесоюзном биохимическом съезде (1974) А.Е. Браунштейн,- развивается и встречное течение - реконструкция или интеграция, восходящая от молекулярного яруса к высшим уровням структурно-функциональной организации живого и пронизывающая весь комплекс актуальных проблем биологии и медицины».

Ферменты обеспечивают осуществление таких важнейших процессов жизнедеятельности, как экспрессия (реализация) наследственной информации, биоэнергетика, синтез и распад биомолекул (обмен веществ). Изучение их способствует проникновению в суть и сокровенные тайны того загадочного явления, которое мы называем жизнью. Этими обстоятельствами может быть объяснено пристальное внимание исследователей к влиянию различных факторов на активность ферментов - рН, температуры, давления и степени гидратации среды.

Активность ферментов.

Активность ферментов - способность в разной степени ускорять скорость реакции. Активность выражают в:

1)Международных единицах активности - (МЕ) количество фермента, катализирующего превращение 1 мкМ субстрата за 1 мин.

2)Каталах (кат) - количество катализатора (фермента), способное превращать 1 моль субстрата за 1 с.

3)Удельной активности - число единиц активности (любых из вышеперечисленных) в исследуемом образце к общей массе белка в этом образце.

4)Реже используют молярную активность - количество молекул субстрата превращенных одной молекулой фермента за минуту.

Общие методы определения активности ферментов.

Активность фермента меняется при различных условиях реакции и зависит от температуры, рН среды, от концентраций субстратов и кофакторов. Учитывая это, при определении активности фермента на разных стадиях очистки необходимо строго соблюдать одни и те же условия. Желательно не ограничиваться определением активности по одному какому-либо методу. Количество субстрата, превращаемого в условиях теста по определению активности фермента, должно быть пропорционально количеству последнего и времени инкубирования. Если же нет такой пропорциональности, то активность рассчитывают по предварительно построенному калибровочному графику, отражающему зависимость скорости реакции от количества единиц фермента. Когда ход реакции нелинеен во времени, следует определять начальную скорость реакции (по тангенсу угла наклона касательной к начальному отрезку кривой превращения). Для этого легче всего применять такие методы изменения активности, которые позволяют непрерывно следить за ходом превращения во времени: спектрофотометрические методы, потенциометрические, полярографические и т.п. Для измерения скорости ферментативной реакции необходимо выбрать буфер, который не тормозит исследуемую активность и обеспечивает поддержание рН раствора, близкой к оптимальной для данного фермента. Реакцию проводят при температуре, лежащей в большинстве случаев в пределах 25-40⁰С. При исследовании ферментов, требующих присутствия кофакторов (ионов металлов, коферментов и др.), концентрация которых может снижаться по мере очистки фермента, в реакционную смесь следует добавлять недостающие кофакторы, например, соли металлов, АТФ, НАДФ и т.п. Также для определения активности ферментов вводят стабилизаторы в состав опытных смесей. Во многих случаях добавление желатина, альбумина и других добавок предотвращает денатурацию ферментного белка.

Спектрофотометрические методы.

Спектрофотометрические методы основаны на поглощении света в определенных участках спектра многими соединениями, являющимися активными группами ферментов, субстратами или продуктами реакции. Положение максимума поглощения при определенной длине волны определяется наличием в исследуемом материале определенных групп - аналитических форм. Для измерения спектров используют специальные приборы - спектрофотометры, фотометрические абсорбциометры и др. Этот метод отличается высокой чувствительностью, быстротой определения, малым расходованием фермента и реактивов и позволяет следить за течением реакции во времени. Для этого реакционную смесь помещают в кювету, вставленную в термостатируемый кюветодержатель. Через малый промежуток времени после добавления фермента (или субстрата) и быстрого перемешивания измеряют поглощение при длине волны, характерной для используемого субстрата или конечного продукта, образующегося в данной реакции. С помощью спектрофотометрического метода можно измерять непосредственно концентрацию некоторых ферментов (после достаточной очистки) по величине характерных максимумов поглощения прочно связанных коферментов (простетических групп). Необходимо иметь произвольно выбранную единицу фермента, с помощью которой можно было бы количественно выразить чистоту и активность различных фракций. В большинстве случаев выбор единицы зависит от избираемого метода определения. В случае спектрофотометрического метода такой единицей может служить количество фермента, которое вызывает определенное изменение в оптической плотности за определенное время при данных условиях опыта; если определяется продукт реакции, то единицей будет количество фермента, которое вызывает образование определенного количества вещества в минуту, и т.д. Тогда удельную активность фермента, которая является мерилом чистоты ферментного препарата, выражают числом единиц в 1 мг вещества (белка).

Спектрофлюорометрические методы

Для целей определения ферментов могут быть использованы не только измерение поглощения света, но также измерения флюоресценции - спектрофлюорометрические методы. Такое определение активности фермента в ряде случаев по чувствительности превосходит спектрофотометрические методы на целый порядок величины. Некоторые коферменты и субстраты обладают сильной флюоресценцией. НАД и НАДФ в восстановленном состоянии имеют сильную флюоресценцию и не флюоресцируют в окисленном состоянии. Поэтому спектрофлюорометрию используют для изучения кинетики и механизма действия никотинамидных и флавиновых ферментов.

Колориметрические (фотометрические) методы.

В основе этих методов лежит измерение при помощи визуального или фотоэлектрического колориметра окрашенного продукта, образующегося при взаимодействии субстрата или продукта действия фермента со специфическими реактивами, которые обычно добавляются в фиксированную опытную пробу, взятую после остановки ферментативной реакции. Эти методы весьма разнообразны. Разработаны количественные методы, основанные на биуретовой реакции, при которой состав белка, очевидно не должен сказываться на результатах определения, т.к. эта реакция на пептидные связи, а не на боковые группы в белке. Метод Горнелла и соавторов, основанный на измерении полосы поглощения в области 550-650 нм, используется для определения значительных количеств (1-10 мг) белка в пробе. Предлагаются биуретовые микрометоды, основанные на поглощении ультрафиолетовых лучей медно-белковыми комплексами: они позволяют определять 0.1 - 2.0 мг белка в пробе. Число небелковых веществ, которые могут влиять на определения с помощью биуретовой реакции, невелико, но следует вносить поправки на те вещества, которые присутствуют в высоким концентрациях (соли аммония, сахароза). Наиболее ценными являются те фотометрические методы, которые позволяют следить во времени за ходом ферментативной реакции без ее прекращения по изменению окраски хромогенного субстрата или добавленного индикатора. Метод Фолина и Чиокальто, предложенный для определения количества белка, основан на хромогенной природе некоторых боковых групп аминокислот, а также на присутствии в белках пептидных связей. Этот метод обладает высокой чувствительностью (на пробу достаточно 0.01 - 0.1 мг белка), но многие небелковые вещества мешают определению.

В настоящее время для определения количества белка широко пользуются измерениями интенсивности поглощения света при 280 нм, которое обусловлено присутствием в белке ароматических аминокислот. Количество этих аминокислот в разных белках различно и, следовательно, интенсивность неодинакова. В кювете толщиной 1 см у раствора, содержащего 1 мг “усредненного” белка в 1 мл, оптическая плотность равна 1 при длине волны 280 нм. Нуклеиновые кислоты поглощают при 280 нм, но можно сделать поправку на их присутствие, проводя измерения и при 260 нм и при 280 нм. Очень важна быстрота измерения активности ферментов. То же относится и к измерению количества сухого остатка или количества белка. Тем самым предпочитают быстрый метод определения белка путем измерения величины поглощения при 280 нм. Выигранное время важнее, за счет того, что удельное поглощение выделяемого белка иногда значительно отличается от средней величины поглощения смеси белков, присутствовавших в исходном материале.

Манометрические методы.

Эти методы используются при определении активности фермента в тех случаях, когда в исследуемых реакциях один из компонентов находится в газообразном состоянии. К таким реакциям относится главным образом те, которые связаны с процессами окисления и декарбоксилирования, сопровождающимися поглощением или выделением кислорода и углекислоты, а также реакции, в которых выделение или связывание газа происходит в результате взаимодействия продуктов ферментативного превращения с добавленным в систему реактивом. Наблюдение за ходом реакции во времени проводится в специальных приборах - манометрических аппаратах Варбурга.

Другие методы.

Сюда относится обширный ряд методов, включающих поляриметрию, вискозиметрию, потенцио- и кондуктометрические измерения и т.п. Также определение активности можно выполнять, используя методы хроматографии и электрофореза на бумаге. Эти методы высокочувствительны и специфичны, что делает их во многих случаях незаменимыми; они позволяют значительно сократить расход фермента на измерение активности, но не всегда применимы ввиду продолжительности разделения веществ в процессе хроматографии (и электрофореза).

Специальные методы определения активности пепсина и папаина.

Пепсин и папаин относятся к одной из наиболее многочисленных групп ферментов - протеолитические ферменты (протеазы). Они принадлежат к классу гидролаз, к подклассу пептидгидролаз и катализируют расщепление белков и полипептидов в соответствии с уравнением:

R₁CONHR₂ + H₂O + R₁COOH + H₂NR₂ ,

R₁ и R₂ - остатки аминокислот, ди- или полипептиды.

Т.е. протеазы катализируют расщепление пептидной связи ѕCOѕNHѕ

Методы определения активности протеолитических ферментов.

Модификационный метод.

Модификационный метод с применением субстрата казеина основан на определении скорости ферментативной реакции гидролиза субстрата под действием исследуемых протеолитических ферментов, содержащихся в материале, взятом на анализ. Скорость реакции определяют по количеству образовавшихся аминокислот - тирозина (-амино--оксифенилпропионовая кислота) и триптофана (-амино--индолилпропионовая кислота), которые устанавливают колориметрической реакцией с реактивом Фолина. Этим методом определяют указанные аминокислоты как в свободном, так и в связанном состоянии.

По количеству тирозина и триптофана, содержащемуся в гидролизате, определяют количество превращенного белка в процессе ферментативной реакции (из расчета содержания в белке 6% тирозина и 1.8% триптофана). В основу расчета активности протеолитических ферментов положена зависимость степени гидролиза белка от числа единиц активности фермента, введенных в ферментативную реакцию. На основе этой зависимости составляется график.

Поскольку в данном методе количество аминокислот, характеризующих количество превращаемого белка, определяется по интенсивности окраски реакционных сред - оптической плотности после реакции с реактивом, то в графике для простоты расчета вместо количества превращенного белка ставится пропорциональная ему оптическая плотность раствора. При составлении графика по оси абсцисс откладывают число единиц фермента, введенное в ферментативную реакцию, а по оси ординат - оптическую плотность, полученную после колориметрической реакции с реактивом Фолина.

а) Содержание белка,мг б) Единицы активности

а) Зависимость оптической плотности от количества превращенного в процессе ферментативной реакции белка.

б) Зависимость оптической плотности от числа единиц активности протеолитических ферментов.

Относя количество введенных в реакцию единиц активности фермента к действию 1 г препарата, определяют его активность. Для расчета прямой, изображенной на графике, составляет расчетное уравнение.

За единицу протеолитической активности принято такое количество фермента, которое катализирует за 30 минут гидролиз 1 г белка в принятых условиях до продуктов, не осаждающихся трихлоруксусной кислотой. 1г составляет 25% от взятого на ферментативную реакцию белка.

Протеолитическая активность характеризуется числом единиц активности фермента, содержащегося в 1 г препарата и твердых полупродуктов или в 100 мл жидких материалов. Метод предназначен для анализа очищенных ферментных препаратов грибного происхождения и всех полупродуктов, получающихся при их производстве.

Определение пепсина по Ансону и Мирскому.

Данный метод основан на следующих принципах. Гемоглобин подвергают воздействию пепсина, оставшийся гемоглобин осаждают трихлоруксусной кислотой. Фенольные свойства остатка (тирозин), определяемые фотометрически, используют как меру активности фермента.

Субстратом служит 2%-ный раствор гемоглобина в 0.06 н. растворе соляной кислоты, 5 мл субстрата нагревают до 25⁰С, прибавляют 1 мл раствора фермента, оставляют в течении 10 мин., добавляют 10 мл 0.3 н. раствора трихлоруксусной кислоты, энергично взбалтывают, фильтруют и 5 мл фильтрата отливают в мерную колбу на 25 мл. Сюда же приливают 10 мл 0.5 н. раствора едкого натра и 3 мл фенольного реактива (реактив Фолина-Чиокалтеу разводят предварительно двойным объемом воды) и доводят водой до метки. По истечении нескольких минут окрашенный раствор фотометрируют относительно стандартного раствора, содержащего 0.0008 мэкв тирозина в 5 мл 0.2 н. раствора соляной кислоты (к раствору добавляют 0.5% формальдегида в качестве антисептика). Для исключения возможных ошибок ставят холостой опыт. Единицы пепсина выражают в миллиэквивалентах тирозина (в пределах от 6^.10^-4 до 11^.10^-4): единицы пепсина = миллиэквиваленты тирозина х1.47.

Определение протеолитических ферментов по Муру и Штейну.

Метод основан на том, что содержащие -аминогруппу аминокислоты дают с нингидридом окрашенную производную - дикетогидриндилидендикетогидриндамин, а также альдегид-аминокислоты и углекислоту.

Окрашенный продукт обладает характерным максимумом поглощения при 570 м, а интенсивность окраски зависит от количества аминокислоты. С пролином и оксипиролином реакция протекает в ином направлении, а максимум поглощения получаемого при этом окрашенного продукта расположен при 440 м.

Инкубацию фермента удобно проводить в мерных колбочках по 5 мл, в которых смешивают и уравновешивают при постоянной температуре на водяной бане все компоненты за исключением фермента. После этого добавляют фермент, раствор смешивают и берут пробы для исследования. Для кинетических измерений концентрацию фермента желательно подобрать таким образом, чтобы аликвотные части можно было бы брать каждые 5 минут.

Аликвотные части пробы, взятые сразу же после добавления фермента, а затем через соответствующие интервалы, добавляют в фотометрические пробирки, содержащие 2 мл реактива нингидрида - это тотчас обрывает реакцию. После этого смесь 20 мин. нагревают на водяной бане; полученная окраска устойчива минимум 24 часа. Средняя ошибка при анализе повторных проб составляет 2%. После разбавления кипяченой смеси пробы и нингидрида 10 мл смеси, состоящей из равных объемов воды и н.пропанола, интенсивность окраски определяют на спектрофотометре Колемана при 570 м.

Для калибровки пользуются постоянными количествами стандартных аминокислот, содержащих реакционные компоненты. При помощи калибровочных кривых, построенных отдельно для каждой исследуемой аминокислоты, измерения интенсивности окраски (по отношению к контрольной колбе) пересчитывают в миллимоли. При делении этих величин на миллимоли субстрата, использованного в процессе реакции, можно найти процент гидролиза.

Построение калибровочной кривой исключает ошибки, происходящие от качественных различий реакции аминокислот на цветной реактив. До оптической плотности 0.1 зависимость между величиной поглощения и количеством субстрата носит линейный характер.

Воспроизводимость составляет 3%. Мешающее влияние аммония, аминов и других веществ, содержащихся в биологическом материале и дающих цветную реакцию с нингидридом, исключается при помощи соответствующих холостых проб. Анализ сравнительно упрощается, когда изучают протеолитические ферменты, субстратами которых являются пептиды, не содержащие свободных аминогрупп. В этом случае вся образующаяся окраска целиком приходится на освободившуюся аминокислоту.

Микрометод определения активности протеиназ А.П.Алексеенко.

Предлагаемый микрометод определения активности протеолитических ферментов основан на измерении содержания аргинина в пептидах, освобождающихся при гидролизе протеиназами белковых субстратов. Содержание аргинина определяют с помощью стабилизированной и усовершенствованной реакции Сакагучи (хроматограмму погружают в 0.1% раствор 8-гидроксихинолина в ацетоне, высушивают на воздухе, опрыскивают раствором 0.2 мл Br₂ в 100 мл 0.5 М NaOH; аргинин и другие гуанидины дают оранжево-красные пятна, тауромицин и гликоциамин - лишь временную окраску), позволяющей определить содержание аргинина в растворах трихлоруксусной кислоты после осаждения и удаления нерастворимых белков. Зная содержание аргинина в белковом субстрате и определяя его количество в перешедших в раствор пептидах, можно рассчитать процент гидролиза белкового субстрата изучаемыми протеиназами. В этом состоит главное преимущество метода, поскольку метод Ансона не дает возможности рассчитать процент гидролиза белка, атакуемого протеолитическими ферментами. Из всех существующих методов только метод Мура и Штейна позволяет определить процент гидролиза белковых субстратов, но он имеет ограниченное применение, поскольку требует предварительного проведения полного кислотного гидролиза как белка-субстрата, так и образовавшихся пептидов. В предложенной методике калибровочная кривая строится по растворам свободного аргинина. Введение в реакцию пептидов и белков в виде их биуретовых комплексов повысило чувствительность реакции Сакагучи с остатками аргинина и сделало ее такой же чувствительной, как и для свободного аргинина. В качестве белкового субстрата используют классический субстрат - гемоглобин и окисленный по Сангеру лизоцим. Этот низкомолекулярный белок, содержащий 12.7% аргинина прекрасно расщепляется пепсином (рвется около 30 связей).

Прежде чем приступить к определению активности ферментов в изучаемых тканевых субстратах, необходимо:

1. Определить зависимость активности от рН и выбрать оптимальную реакцию среды для проявления активности изучаемого фермента.

2. Построить график зависимости активности фермента от времени его инкубации с субстратом, выбрать для работы те сроки инкубации, при которых сохраняется линейная зависимость между величиной активности фермента и временем его инкубации.

3. Определить зависимость величины активности от концентрации белка в пробе. Выбрать такие концентрации фермента, при которых величина активности фермента была бы пропорциональна его концентрации. Следует учитывать, что в тканевых экстрактах и биологических жидкостях могут присутствовать ингибиторы протеолитических ферментов. При разведении пробы их концентрация снижается , а протеолитических - увеличивается. Определяя “фактор разведения”, можно одновременно с подбором оптимальных условий для определения протеолитической активности выявить и наличие ингибитора.

4. При определении активности фермента необходимо работать при постоянной скорости ферментативной реакции, достигаемой при полном насыщении фермента субстратом, при так называемой максимальной скорости ферментативной реакции. В каждом отдельном случае максимальную скорость необходимо найти экспериментально, измерив активность препарата при разных концентрациях субстрата, при постоянных концентрациях белка и времени инкубирования.

Определение активности протеиназ по белковому субстрату.

К 0.5 мл субстрата в соответствующем буферном растворе добавляют 0.5 мл пробы, содержащей фермент (экстракт, биологическую жидкость), инкубируют установленное опытным путем время , после чего белки в пробе осаждают 5 мл 10% трихлоруксусной кислотой. Отделяют осадок центрифугированием, а надосадочную жидкость (ТХУ-центрифугат) подвергают дальнейшей обработке. Контрольные пробы - пробы, где реактив добавлен в обратном порядке: к 3 мл 10% раствора ТХУ добавляют 0.5 мл раствора, содержащего фермент и 0.5 мл субстрата. Рекомендуется ставить пробу на автолиз субстрата: к 0.5 мл субстрата добавляют 0.5 мл прокипяченного раствора, содержащего фермент, инкубируют вместе с опытными пробами и осажденной ТХУ.

Определение содержания аргинина в ТХУ-центрифугантах по модифицированной реакции Сакагучи. К 0.5 мл ТХУ-центрифуганта добавляют 0.5 мл 2.5мМ раствора CuSO₄ , 0.5 мл 5 Н. КОН, 0.5 мл раствора ДХН (2,4-дихлор-1-нафтол). Раствор встряхивают и вносят 0.5 мл гипобромита натрия, мгновенно возникает ярко-розовая окраска. Раствор встряхивают и через 20-30 секунд стабилизируют пробы добавлением 0.2 мл раствора 2-тиогликоля (чтобы предотвратить разрушение окрашенного продукта избытком гипобромита натрия. После добавления 2-тиодигликоля в пробы как опытные, так и контрольные, появляется желтоватое окрашивание за счет побочного продукта реакции между избыточной ТХУ и гипобромита натрия. Побочный продукт также стабилизируется 2-тиодигликолем. Оптическая плотность пробы измеряется спектрофотометром при 520 нм в кювете толщиной 1 см.

Определение активности протеиназ по реакции с реактивом Фолина.

К 0.5 мл того же ТХУ-центрифуганта добавляют 0.5 мл 2.5 мМ раствора CuSO₄ , 4 мл 0.5 н. раствора NaOH и 1.5 мл разбавленного в три раза реактива Фолина. Через 30 минут измеряют на спектрофотометре оптическую плотность при 760 нм

Калибровочные кривые по пепсиновому гидролизату окисленного лизоцима. 30 мг окисленного лизоцима растворяют в 50 мл подкисленной воды (40 мл Н₂О + 10 мл 0.3 н. раствора HСl. и к полученном раствору добавляют 0.5 мг пепсина. Смесь оставляют при комнатной температуре на сутки. По истечении этого срока инкубации препарат не дает осадка с ТХУ. Этот препарат используют наряду с растворами аргинина и тирозина в качестве стандарта для построения калибровочных кривых. Приготовляют разведения с содержанием от 60 до 600 мкг/мл исходного лизоцима. В пробы вводят соответствующее опытным пробам количество ТХУ. Приготовляют также растворы свободного аргинина и тирозина с концентрациями от 0.04 до 0.25 мкмоль/мл. Из каждой пробы берут по 0.5 мл (в трех параллельных пробах) для определения содержания аргинина и тирозина по Фолину.

Калибровочные кривые. Количество аминокислоты или ее остатка в гидролизате в наномолях на 1 мл.

Кривая 3 получена с помощью микрометода на основе реакции Сакагучи (520 нм) по растворам аргинина (х) и по пептидному гидролизу лизоцима (о); 1 и 2 - с помощью реакции Фолина (760 нм): 2 - по растворам тирозина, 1 - по пептидному гидролизу лизоцима. Значение оптической плотности проб, измеренные при 520 нм или 760 нм, нанесены на график против концентрации аргинина или тирозина или их остатков в пепсиновом гидролизате лизоцима. Кривая 1, проходящая выше кривой 2, получена при реакции реактива Фолина с растворами тирозина эквивалентной концентрации. Кривая 3 получена в результате реакции Сакагучи как со свободным аргинином, так и с его остатками, содержащимися в пептидах пепсинового гидролизата лизоцима. Расположение опытных точек точно по прямой свидетельствует о том, что в гидролизате, осажденном ТХУ, весь аргинин полностью реагирует с реактивом Сакагучи.

Воздействие Фолина на тирозин не специфично. Кроме тирозина в пептидах с этим реактивом реагируют триптофан, цистеин. Образуемые медью с тетрапептидами и полипептидами биуретовые комплексы облегчают такое взаимодействие. Следовательно, выражение величины активности протеолитических ферментов в тирозиновых эквивалентах и по Фолину, как это иногда делают, неправильно.

Влияние рН на активность ферментов.

Влияние концентрации водородных ионов на каталитическую активность

ферментов состоит в воздействии ее на активный центр. При разных значениях рН в реакционной среде активный центр может быть слабее или сильнее ионизирован, больше или меньше экранирован соседними с ним фрагментами полипептидной цепи белковой части фермента и т.п. Кроме того, рН среды влияет на степень ионизации субстрата, фермент-субстратного комплекса и продуктов реакции, оказывает большое влияние на состояние фермента, определяя соотношение в нем катионных и анионных центров, что сказывается на третичной структуре белковой молекулы. Последнее обстоятельство заслуживает особого внимания, так как определенная третичная структура белка-фермента необходима для образования фермент-субстратного комплекса.

Ферменты, вообще говоря, активны только в определенном интервале рН, и в большинстве случаев для действия каждого фермента имеется определенный оптимум рН.

Наличие такого оптимума может иметь несколько причин:

1. истинное обратимое влияние рН на скорость реакции V(в условиях, когда фермент насыщен субстратом)

2. влияние рН на сродство фермента к субстрату (в этом случае падение активности по обе стороны оптимума рН будет следствием понижения насыщения фермента субстратом в силу понижения сродства)

3. влияние рН на стабильность фермента, который может необратимо инактивироваться при рН по одну или по обе стороны от оптимума.

Перечисленные факторы могут действовать и в комбинации друг с другом, например, падение активности по одну сторону от оптимума рН может быть результатом уменьшения сродства фермента к субстрату, а по другую - результатом инактивации фермента. Поскольку в клетке содержатся сотни ферментов и для каждого из них существуют свои пределы опт рН, то изменение рН это один из важных факторов регуляции ферментативной активности. Так, в результате одной химической реакции при участии определенного фермента рН, оптимум которого лежит в пределах 7.0 - 7.2, образуется продукт, который является кислотой. При этом значение рН смещается в область 5,5 - 6.0. Активность фермента резко снижается, скорость образования продукта замедляется, но при этом активизируется другой фермент, для которого эти значения рН оптимальны и продукт первой реакции подвергается дальнейшему химическому превращению. (Еще пример про пепсин и трипсин).

Действие рассматриваемых факторов можно легко различить экспериментальным путем. Наличие необратимой инактивации устанавливают, сначала инкубируя фермент в растворах с различными значениями рН, а затем определяя его активность по возвращении рН к определенному значению.

На рис.1 приведены результаты опытов такого рода для моноаминоксидазы, из которых видно, что падение активности в щелочной области (по отношению к оптимуму рН) вызвано инактивацией фермента. Так как степень инактивации фермента со временем увеличивается, то и форма кривой, и положение кажущегося оптимума рН зависят от времени, в течение которого проводятся наблюдения; если бы можно было определить истинные начальные скорости сразу же после приведения раствора фермента к определенному значению рН, то тогда фактор инактивации был бы полностью исключен. Наблюдаемый оптимум рН аналогичен ложному “ температурному оптимуму”, который мы рассмотрим ниже.

Рис.1. Влияние рН на активность моноаминоксидазы (флавинсодержащей)

І-активность при рН, указанных на оси абсцисс,

ІІ-активность при рН=7,3 после инкубации в течение 5 мин при рН, указанных на оси абсцисс

Влияние рН на сродство фермента к субстрату можно исключить, если работать с такими концентрациями субстрата, которые достаточно высоки, чтобы насытить фермент при всех изучаемых значениях рН. Так как величина Км может значительно изменять при сдвиге рН, то мы отнюдь не вправе считать, что концентрация субстрата, достаточная для насыщения при одном из значений рН, будет достаточной для его насыщения и при других значениях рН. Чтобы определить влияние изменений собственно рН на активность фермента, необходимо получить достаточное количество данных по зависимости скорости реакции от концентрации субстрата при каждом значении рН, а затем с помощью одного из графических методов, показанных на рис.2 найти значения Км и V. Большинство приводимых в литературе кривых, характеризующих влияние рН на активность фермента, представляет собой сложные кривые, форма которых зависит частично от изменений V, а частично от изменений Км. Кривые, иллюстрирующие влияние изменения рН на Км и V приведены ниже.

Рис.2. Шесть способов графического определения величин Км и V по влиянию концентрации субстрата на скорость реакции.

А-изменение величин, обратным рН-функциям, для системы с двумя ионизирующимися группами, рК которых равны 5 и 10

Б- изменение величин, обратным рН-функциям, для симметричной системы с рК 7 и 8.

Рис.3.Характер изменения рН функций про изменении рН:

Влияние рН на активность ферментов, подобно всем другим видам влияния рН, осуществляется путем изменения в состоянии ионизации отдельных компонентов системы при изменении рН. Такие изменения могут происходить в свободном ферменте, в фермент-субстратном комплексе или субстрате. Поскольку ферменты представляют собой белки, молекулы которых содержат большое число ионизирующихся групп, то они могут находится в виде целого ряда различных ионных форм, причем распределение всего количества фермента между этими ионными формами зависит от рН и от констант ионизации различных групп. Поскольку, однако, каталитическая активность наблюдается обычно в относительно небольшом интервале значений рН, можно думать, что только одна из ионных форм фермента (или, точнее, его активного центра) каталитически активна, как это и предполагали Михаелис и Девидсон еще в 1911г. Имеется ряд соображений в пользу того, что ионизация тех групп в ферменте, которые удалены от активного центра, либо оказывает незначительное влияние, либо совсем не оказывает влияния на каталитическую активность; в то же время состояние ионизации групп, расположенных в самом центре или около него, очень существенно.

Если фермент активен только в одном состоянии ионизации, то и этого следует, что активность его будет в значительной мере определятся его ионизацией двух особых групп в активном центре или вблизи него, а именно тех групп, которые в первую очередь ионизируются(или, наоборот, деионизируются) при сдвиге рН в кислую или щелочную сторону от оптимума. Эти группы иногда называют кислой и основной группами фермента. Мы не будем рассматривать другие процессы ионизации, которые могут протекать при сдвиге рН до значений, еще более удаленных от оптимума, так как эти процессы влияют на состояние уже неактивных форм фермента. Правда, молекула фермента может содержать несколько одинаковых групп, которые будут ионизироваться одновременно, но присутствие в активном центре более одной такой группы маловероятно. В силу рассмотренных выше обстоятельств влияние рН на скорость ферментативных реакций обсуждают часто с учетом только двух ионизирующихся групп, используя при этом уравнения, применимые к двухосновным кислотам или к простым амфолитам, хотя без сомнения, такой подход является слишком упрощенным.

Влияние температуры на активность ферментов.

Активность зависит в первую очередь от температуры. Наибольшую активность тот или иной фермент проявляет при оптимальной температуре. Для ферментов живого организма это значение находится в пределах +37,0 - +39,0 С, в зависимости от вида животного. При понижении температуры, замедляется броуновское движение, уменьшается скорость диффузии и, следовательно, замедляется процесс образования комплекса между ферментом и компонентами реакции (субстратами). В случае повышения температуры выше +40 - +50 С молекула фермента, которая является белком, подвергается процессу денатурации. При этом скорость химической реакции заметно падает (рис. 4.).

Рис 4. 

Зависимость скорости реакции, катализируемой ферментом от температуры. Максимальная скорость соответствует температуре тела человека (фермент человеческого организма).

Влияние температуры на скорость ферментативных реакций может быть обусловлено действием ряда различных факторов. Температура влияет на:

1. стабильность фермента

2. скорость распада фермент-субстратного комплекса, определяемую по величине теплоты активации реакции

3. сродство фермента к субстрату

4. величину рН-функций одного или всех компонентов (в результате изменения рК, определяемых по теплоте ионизации)

5. сродство фермента к активаторам и ингибиторам (если таковые имеются)

6. природу ключевой реакции (если в системе участвуют несколько ферментов с различными температурными коэффициентами)

7. изменение концентрации растворенного О2 вследствие изменения растворимости (в манометрических опытах)

8. рН используемого буферного раствора.

Многообразие форм, в которых проявляется влияние температуры на скорость ферментативных реакций, дает основание ожидать, что анализ этого влияния должен представлять большие трудности. В действительности влияние температуры легко исследовать экспериментально. Влияние на стабильность фермента можно изучить, инкубируя фермент при различных значениях температуры в течение определенного периода времени, а затем определяя его активность в той температурной зоне, в которой он остается стабильным. Влияние температуры на сродство фермента к субстрату или активатору можно элиминировать использованием достаточно высоких концентраций субстрата или активатора, при которых фермент оказывается насыщенным, что дает возможность определить влияние температуры на V. Влияние на константу Михаэлиса можно изучить с помощью обычных методов, в некоторых случаях можно даже определить влияние температуры на каждую из трех констант скорости. В полиферментных системах каждый фермент обычно можно изучать в отдельности, чтобы таким образом избежать лимитирующих влияний на скорость наблюдаемого процесса со стороны других ферментов. Наконец, влияние температуры на большую часть прочих факторов можно, как правило, исключить, если достаточно тщательно следить за всеми деталями методики проведения опытов.

Теплота инактивации ферментов.

Если построить серию кривых, отражающих ход ферментативной реакции при различных значениях температуры, то эти кривые будут в общем случае близки к тем, которые изображены на рис.5. Хотя истинная начальная скорость реакции неуклонно увеличивается по мере повышения температуры, количество субстрата, подвергшегося превращению за определенный промежуток времени, вначале повышается, а затем падает, вследствие чего наблюдается кажущийся температурный оптимум. Эта наблюдаемая оптимальная температура не остается постоянной, она падает по мере увеличения промежутка времени, в течении которого рассматривается процесс, что видно, например, из сравнении t1 и t2 на рис.5.

Рис5.

Типичные кривые хода ферментативной реакции при различных значениях температуры, показывающие зависимость кажущегося температурного оптимума от времени наблюдения.

В данном случае одновременно действуют два различных фактора, определяющих влияние температуры: с одной стороны - увеличение начальной скорости (или истинной каталитической активности фермента), с другой - деструкция фермента при более высоких значениях температуры, обуславливающая непрерывное уменьшение концентрации активного фермента. Все это проявляется в увеличении кривизны приведенных на рис.5 кривых при увеличении температуры. Оптимальная температура зависит от соотношения между влиянием температуры на скорость ферментативной реакции и ее влиянием на скорость деструкции фермента, так что наблюдаемые величины температурных оптимумов, в сущности, не имеют особого значения.

Скорость инактивации ферментов в растворе быстро возрастает с повышением температуры; почти во всех случаях инактивация происходит практически мгновенно при значениях температуры, близких к 100°С, в большинстве же случаев она наступает при температуре около 70°С. Число ферментов, которые устойчивы при температуре 100°С, исключительно мало; классическим ферментом может служить аденилаткиназа, выдерживающая в течение продолжительного времени температуру 100°С при рН 1. Интересно, однако, что некоторые бактерии, обычно живущие в условиях высоких температур (термофильные бактерии), содержат ферменты, отличающиеся высокой термостабильностью. Показано, например, что кристаллическая ?-амилаза, выделенная из Bacillus stearothermophilus, сохраняет 90% своей активности после инкубации при 90°С в течение 1ч.

Тепловая инактивация ферментов почти всегда является результатом денатурации белка. Температурный коэффициент процесса инактивации значительно выше, чем у какого-либо другого известного процесса, за исключением денатурации белков, величина этого коэффициента может, однако, сильно варьировать - от 10 до нескольких сотен. Строгая пропорциональная зависимость между инактивацией фермента и денатурацией белка была продемонстрирована для пепсина А и трипсина Нортропом; результаты одного из опытов такого рода представлены на рис6. В тех случаях, когда при определенных условиях денатурация белка могла быть обращена, параллельно с ренатурацией белка наблюдалось и восстановление активности фермента.



Рис 6.Соответствие между процессами инактивации фермента и ренатурации белка. Фермент - пепсин А. Т=20°С.

Скорость инактивации ферментов (как и вообще денатурации белков) в большинстве случаев зависит от рН раствора. Влияние рН на инактивацию различных ферментов может быть весьма различным. Обычно имеется область максимальной стабильности фермента, причем она не обязательно располагается по близости от его изоэлектрической точки; инактивация увеличивается при сдвиге в кислую или щелочную сторону от этой области. Многие ферменты уже при рН 4-5 и 8-10 инактивируются даже при комнатной температуре. Так как параметры инактивации значительно изменяются с изменением рН, то следует проявлять осторожность при выведении каких-либо заключений общего характера из наблюдений, относящихся только к одному значению рН. Другие факторы, помимо рН, например ионная сила, концентрация белка и защитное действие субстратов, ингибиторов и прочих веществ, также могут оказывать значительное влияние на скорость инактивации. Имеет значение также и содержание воды, ибо в высушенном состоянии ферменты весьма термостабильны.

Заключение.

Ферменты являются высокоспециализированными веществами белковой природы и используются живыми организмами для осуществления с высокой скоростью многих тысяч взаимосвязанных химических реакций; мерой ускорения этих многочисленных реакций является активность ферментов, которая зависит от целого комплекса взаимосвязанных и взаимозависимых характеристик состояния среды - рН, температуры, степени гидратации среды и других факторов. Изменение показателей рН оказывает действие на структуру активного центра фермента, степень его ионизации и экранирования; изменение температурных показателей влияет на скорость броуновского движения, скорость диффузии, сродство к активаторам и ингибиторам, изменение рН среды и, конечно, на стабильность самого фермента (!) так как третичная структура фермента, необходимая для его функционирования, очень чувствительна к изменениям температурного показателя - при попадании фермента в условия повышенной или пониженной температуры (относительно температурного оптимума фермента) происходит процесс денатурации т. е. разрушения нативной структуры белка (в основном это касается третичной) и таким образом фермент инактивируется и перестает выполнять свои функции; относительно степени гидратации среды можно сказать, что гидратация белков является одним из факторов удержания их в растворе, это очень важно потому что мы говорим о живых организмах, внутренняя среда которых жидкая и фермент функционирует именно в этих жидких условиях. Ферменты в высушенном состоянии - весьма устойчивы к действию различных факторов, но и не могут выполнять свои функции. Важно также помнить, что в естественных внутриорганизменных условиях все эти и другие факторы действуют совместно и влияют друг на друга, таким образом, оказывают существенное влияние на активность ферментов.

Литература.

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник.- М.: Медицина, 1990.- с.115

2. Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. ун-тов/под ред. А.А. Анисимова.- М.: Выс.шк., 1986. - с.133-140

3. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки // М.: Мир, 1974, 956 с.;

4. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.- М., 1989

5. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: пер.англ.- М.: Мир, 1982.- т.1.- с. 36-43, 99, 199-202, 204, 235-239.

6. Асатиани В.С. Биохимическая фотометрия.- М.: Изд. АН СССР, 1957.- с.248-253