Кинетика роста культур микроорганизмов

37

Министерство Образования и науки Российской Федерации

Федеральное агентство образования

Тверской государственный технический университет

Кафедра биотехнологии и химии

Реферат на тему: «Кинетика роста культур микроорганизмов»

Тверь 2008

Содержание.

Введение…………………………………………………………………..............3

1.Кинетические модели роста культур микроорганизмов.

1.1. Зависимость скорости роста культур микроорганизмов от концентрации лимитирующего субстрата «макроскопический подход» ………..….………...8

1.1.1. Простейшая схема взаимодействия клетки с субстратом……………….8

1.1.2. Упрощенные методы анализа кинетики и механизмов автокаталитического роста микроорганизмов………………………..………..10

2. Зависимость скорости роста культур микроорганизмов от концентрации лимитирующего субстрата «микроскопический» подход…………………....18

2.1. Простейшая схема…………………………………………………………..19

2.2. Влияние транспортных процессов на кинетику роста популяции….…...22

2.3. Старение клетки в процессе роста…………………………………………25

2.4. Пределы скорости роста культур микроорганизмов……………………..30

Заключение………………………………………………………………….…. 34

Список литературы…………………………………………………………......35

Введение

В последние десятилетия непрерывно возрастает интерес к изучению и практическому использованию микроорганизмов, мир которых чрезвычайно многообразен и динамичен. Микроорганизмы играют большую роль в природных процессах и в течение многих лет являются «полигоном», где современная наука исследует фундаментальные основы живой материи. Достаточно сказать, что нынешнее здание науки о молекулярных механизмах наследственности в значительной степени создано в результате изучения микробиологических объектов. Микробиология - это и фундамент современной биотехнологии. Ряд микробиологических систем в настоящее время уже весьма продуктивно используется в крупномасштабных производственных процессах. Еще более привлекательны возможности, открываемые при использовании, открываемые при использовании в микробиологической практике генетической инженерии, а так же весьма перспективно создание принципиально новых процессов на основе ферментных систем микроорганизмов.

В настоящее время количественная микробиология, основанная на химико-кинетическом моделировании процессов микробного роста, является активно развивающейся областью биокинетики, имеющей много интересных фундаментальных и практических приложений.

В данном реферате освещаются одна из важных частей биокинетики - анализ кинетических закономерностей роста и развития микробных популяций. По своей природе микробиологические процессы представляют собой ферментативные реакции, протекающие в полиферментных системах при переменной концентрации катализаторов (ферментов). Специфической особенностью роста микроорганизмов является автокаталитический характер процесса, определяемый увеличением общей концентрации ферментов в системе по мере развития популяции. В силу этого оказывается целесообразным применение в микробиологии ряда формальных методов и приемов, развитых при анализе кинетических закономерностей ферментативного катализа.

Культивирование (рост) микроорганизмов может осуществляться в двух основных режимах: периодическом и непрерывном. Первый тип культивирования относится к процессам в закрытых системах, второй - к открытым.

Вопросы кинетического описания роста микробных популяций давно привлекают внимание ученых. В конце 40-х годов 20-ого столетия Моно обнаружил и обосновал связь между скоростью роста культур микроорганизмов и концентрацией в среде лимитирующего субстрата. После этого работы по кинетическому моделированию роста культур микроорганизмов получили достаточно большое распространение. Широкое применение нашли методы непрерывного культивирования микроорганизмов, и, как следствие, возникла кинетическая теория, адекватно и плодотворно описывающая процессы роста микроорганизмов в открытых системах при непрерывном культивировании (Н.С. Печуркин, 1978; Дж. Перт,1978;). Важно отметить, что в развитие кинетической микробиологии большой и во многом определяющий вклад внесли советские исследователи Н.Д. Иерусалимский, Н.С. Печуркин, И.А. Терсков.

Современный этап исследований в области кинетического описания микробиологических процессов характеризуется рядом особенностей.

Во-первых, дальнейшее развитие получают экспериментальные методы исследования процессов, протекающих в микробной системе, в результате чего становятся доступными многопараметрические измерения, анализ многокомпонентных систем, детальный биохимический анализ микромолекулярных биосистем. Все это приводит к количественной точности, полноты, информативности микробиологического эксперимента. Во-вторых, заметное распространение получили аналитического рассмотрения кинетики роста микробных популяций, что позволяет иметь богатую информацию о природе процессов на основе первичных данных роста микробной культуры. В-третьих, произошли кардинальные изменения в связи с использованием компьютеров для анализа и кинетического моделирования микробиологических процессов.

1 Кинетические модели роста культур микроорганизмов

Кинетические кривые роста микроорганизмов в закрытых системах (периодическое культивирование) имеют сложный характер (рис 1.1). Выделяют несколько фаз в развитии культуры.

ь После введения инокулята обычно наблюдают индукционный период (лаг-фазу) (1), в течение которого не происходит сколько-нибудь заметного увеличения числа клеток или образования каких-либо продуктов. В этот период перестраивается метаболизм клетки, синтезируются ферменты, специфичные к использованию новых субстратов, активируется биосинтез белка.

ь Индукционный период сменяется фазой экспоненциального роста (2), в течение которой быстро накапливаются биомасса и продукты разных реакций. Эта фаза достаточно строго описывается экспоненциальной кривой.

ь В замкнутой системе экспоненциальная фаза роста не может развиваться неограниченно. Как правило, она переходит в фазу линейного роста (3), характеризующуюся равномерным во времени линейным ростом культуры, имеет место отклонение от точек в сторону меньших значений количества клеток или продуктов, что служит экспериментальным критерием перехода культуры в линейную фазу роста.

ь Фаза линейного роста может смениться весьма непродолжительным периодом, в течение которого скорость роста культуры снижается до нуля. Это фаза замедления роста (4).

ь В некоторых случаях рост культуры может переходить в достаточно устойчивую по продолжительности стационарную фазу. В этих условиях культура развивается в режиме постоянства общего числа клеток. Режим характеризуется достаточно высокими скоростями отмирания клеток. При этом скорость прироста биомассы полностью компенсируется скоростью гибели и лизиса клеток.

ь Если система полностью истощается по субстрату или накопление ингибирующих рост продуктов является значительным, то скорость прироста биомассы становится равной нулю, происходят существенные физиологические изменения клеток и, как правило, наблюдается фаза отмирания культуры (6) , сопровождаемая часто полным лизисом клеток.

Рисунок 1.1- Типичная кинетическая кривая роста популяции микроорганизмов: 1-индукционный период; 2- фаза экспоненциального роста; 3- фаза линейного роста; 4- фаза замедления роста; 5- стационарная фаза; 6-фаза отмирания культуры.

Принципиальной особенностью кинетики микробных популяций является зависимость скорости роста культуры от концентрации одного или нескольких наиболее важных компонентов среды, обеспечивающих биосинтетическую основу метаболизма. Эти компоненты, получившие название лимитирующих субстратов, в определенной степени регулируют скорость роста популяции.

В результате экспериментальных исследований зависимости роста культур микроорганизмов были обнаружены две особенности:

a. Скорость изменения числа микроорганизмов в режиме его роста (в экспоненциальной фазе) линейно связана с концентрацией клеток в системе:

, (1)

где N- это число клеток; ?- коэффициент пропорциональности,

получивший название удельной скорости роста ();

имеет размерность обратного времени. Предполагается, что ? не зависит от времени в исследуемом интервале. Собственно это уравнение в интегральной форме и представляет собой уравнение экспоненциального роста. Его интегрирование при начальном условии t=0, приводит к функции

. (2)

b. Было найдено, что в большинстве случаев значение удельной скорости роста зависит от концентрации лимитирующего субстрата и эта зависимость может быть представлена в форме

, (3)

где - предельная максимальная удельная скорость роста; - параметр, получивший название константы сродства субстрата к микроорганизму.

Впервые на зависимость скорости роста культуры от концентрации субстрата обратил внимание Моно, поэтому уравнение (3) получило название уравнения Моно. По своей форме это уравнение соответствует зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (уравнение Михаэлиса - Мент).

1.1 Зависимость скорости роста культур микроорганизмов от концентрации лимитирующего субстрата. «Макроскопический» подход.

Уравнение, связывающее скорость роста культур микроорганизмов с концентрацией субстрата (уравнение Моно), имеет эмпирический характер. Теоретическое рассмотрение вопроса на качественном уровне с привлечением представления о лимитирующей стадии в сложной последовательности ферментативных превращений субстрата в клетке также указывает на то, что зависимость скорости роста микроорганизмов должна быть аналогична зависимости, выражаемой уравнением Михаэлиса - Мент.

1.1.1 простейшая схема взаимодействия клетки с субстратом

Представим себе простейшую кинетическую схему автокаталитической реакции с разложением каталитических центров

S + N 2N +P, (4)

где N - число центров, претерпевших удвоение при взаимодействии с субстратом; P - продукт.

Число центров, с которыми взаимодействует субстрат, и число клеток микроорганизмов связаны между собой прямо пропорциональной связью, поскольку предполагается, что клетки в среднем содержат одинаковое число центров, на которых осуществляется трансформация субстрата. В рамках кинетического приближения частоту актов деления клеток можно обозначить константой k. Субстрат S в результате взаимодействия с компонентами клетки трансформируются с образованием продукта P.

Динамику изменения в системе концентрации компонентов будут описывать уравнения

(5)

(6)

где - коэффициент пропорциональности, связывающий количество образовавшейся биомассы и продукта ферментационного превращения:

(7)

Если концентрация вещества S в системе достаточно велика и за время процесса меняется несущественно, то можно её считать величиной постоянной (). В этом случае уравнение (5) может быть проинтегрировано относительно числа клеток N. Если использовать начальное условие (), интегрирование уравнения (5) дает экспоненциальную функцию

. (8)

Подстановка уравнения (8) в дифференциальное уравнение (6) и последующее его интегрирование (при допущении, что ) приводит к следующей зависимости от времени концентрации продукта:

(9)

При временах реакции, близких к нулю концентрация продукта близка к нулю, при больших временах реакции должен наблюдаться экспоненциальный рост концентрации продукта:

(10)

Уравнение (1.8), (1.10) и соответственно кинетическая схема (1.4) описывают важную особенность кинетики роста микробной популяции - количество клеток в системе экспоненциально растет во времени. Удельная скорость роста ?(S), представляющая собой показатель экспоненты в уравнениях (8) и (10), является линейной функцией концентрации субстрата:

. (11)

Уравнение (1.11) в отличие от уравнения Моно дает линейное неограниченное увеличение удельной скорости роста микроорганизмов с увеличением концентрации субстрата. Это противоречит экспериментальным данным и требует дополнительного усложнения простейшей кинетической схемы (1.4).

1.1.2 упрощенные методы анализа кинетики и механизмов автокаталитического роста микроорганизмов

Сложности анализа кинетики процесса существенно увеличиваются с усложнением кинетической схемы процесса. Так, для того чтобы найти характеристические времена для кинетической схемы с участием двух промежуточных состояний (трехстадийная схема), необходимо аналитически решить кубическое уравнение и детально проанализировать свойства корней этого уравнения. Сложности становятся практически непреодолимыми, если анализ кинетики сопряжен с исследованием четырехстадийных или пятистадийных процессов. Это требует поиска методов анализа кинетики на принципах существенного упрощения с сохранением адекватности кинетического описания.

Рассмотрим принцип и возможности такого подхода на примере двухстадийного процесса

(12)

Субстрат, взаимодействуя с каталитическими центрами внутри клетки (число центров N пропорционально числу клеток в популяции), приводит к образованию метаболитов, обеспечивающих возможность деления клетки и удвоения центров, с которыми взаимодействует субстрат.

Кинетику процесса описывает система уравнений (S постоянно,)

(13)

(14)

(15)

Измеряемая на опыте биомасса (или общее число клеток микроорганизмов) представляет собой сумму двух переменных величин:

M (t) = N (t) + X (t).

Система уравнений (1.13), (1.14) может быть решена относительно переменных N(t) и X (t). Из уравнения (1.13) следует:

(16)

Уравнение (1.16) можно представить в виде

(17)

При опредёленных условиях в левой части уравнения можно пренебречь членом по сравнению с Х. Найдем условия, при которых выполняется неравенство

(18)

Воспользуемся уравнением, которое получается в результате решения уравнения (16):

,

и подставим значения Х и из этого уравнения в неравенство в (18):

. (19)

Если в этом выражении пренебречь членами, содержащими отрицательное значение корня , поскольку в очень ограниченном интервале времени они будут равны нулю, в то время как члены, содержащие положительную экспоненту , будут неограниченно расти, то можно получить неравенство

(20)

или .

При выполнении этого неравенства в дифференциальном уравнении (17) можно пренебречь первым слагаемым и существенным образом упростить решение.

Можно показать, что всегда строго выполняется неравенство (20) .

Если воспользоваться результатами решения уравнения (14), а именно подставить в неравенство (20) значение положительного корня :

,

то получим

(21)

которое эквивалентно неравенству .

Таким образом, для кинетической схемы (12) и системы уравнений (13)-(15) весьма вероятно выполнение неравенства (21). Это позволяет в дифференциальном уравнении (17) в силу малости параметра с высокой степенью точности пренебречь членом по сравнению с Х В этом приближении дифференциальное уравнение (17) трансформируется в алгебраическое:

(22)

С учетом материального баланса можно записать

. (23)

Учитывая, что

(24)

получаем

(25)

Это уравнение представляет собой дифференциальное уравнение первого порядка с разделяющимися переменными, решение которого имеет вид

(26)

т.е. решение системы представляет собой уравнение экспоненциального роста культуры. При этом показатель экспоненты включает субстрат-зависимый параметр - удельную скорость роста:

. (27)

это соответствует уравнению, полученному при полном решении системы дифференциальных уравнений, а также согласуется с эмпирическим уравнением Моно.

Обсуждаемый упрощенный подход к анализу автокаталитической кинетики роста микроорганизмов позволяет анализировать субстрат - зависимую кинетику роста культур для кинетических схем любой степени сложности. Рассмотрим использование этого подхода для анализа кинетики трехстадийного процесса с участием произвольного числа n различных состояний.

Представим, что кинетика процесса включает несколько соизмеримых по параметрам последовательных стадий:

. (28)

Кинетику изменения во времени всех компонентов (при условии постоянства ) описывает система уравнений

; (29)

; (30)

(31)

Выражение для общего количества биомассы, включающее суммарное количество клеток во всех состояниях, имеет вид

(32)

Сложение дифференциальных уравнений (29)-(31) приводит к уравнению

(33)

Из уравнений (29) и (30) следует:

(34)

(35)

Воспользуемся изложенным выше подходом, согласно которому в силу малости параметров и можно пренебречь в левой части уравнения (34) и (35) членами, содержащими производные и . Это приводит к уравнениям

(36)

(37)

С учетом этих соотношений уравнение для общего количества биомассы можно записать в виде

(38)

или (39)

Если подставить это уравнение в (33), будем иметь

(40)

Решение этого дифференциального уравнения с разделяющимися переменными при использовании начального условия t=0, M = имеет вид

(41)

Соответственно уравнение удельной скорости роста культуры микроорганизма можно записать в виде

(42)

Подставим это уравнение в «классической» гиперболической форме:

(43)

при этом значения параметров и как функции констант скорости элементарных стадий даны уравнениями

; (44)

(45)

. (46)

Если на какой-либо стадии реакции образуется продукт, т.е.

, (47)

P

то зависимость его концентрации от времени можно найти из уравнения

(48)

где - экономический коэффициент по продукту.

Из (48)

(49)

При временах, превышающих 1/?, в (49) можно пренебречь единицей по сравнению с экспоненциальным членом. При этом справедливо уравнение

(50)

это уравнение экспоненциального роста культуры в условиях детекции продукта ферментативного процесса. Линеаризация данных по продукту реакции в полулогарифмических координатах позволяет, так же как и при определении биомассы, определить удельную скорость роста культуры.

Из уравнения (44) следует важное свойство кинетики роста популяций микроорганизмов: максимальная удельная скорость роста определяется наиболее медленной стадией. Если , то; если, то.

2 Зависимость скорости роста культур микроорганизмов от концентрации лимитирующего субстрата, «микроскопический» подход

Изложенный подход к описанию кинетики роста микробной популяции имеет «макроскопический» характер. Рост культуры микроорганизмов представлен как автокаталитический процесс, идущий с накоплением активных самовоспроизводящихся каталитических систем. Видно, что такой подход приводит к уравнениям, достаточно адекватно описывающим фундаментальные кинетические особенности микробного роста - экспоненциальный характер процесса и зависимость удельной скорости роста от концентрации лимитирующего субстрата. Методология построения кинетических уравнений микробного роста может быть основана и на другом подходе - на расчете из химико-технологческих представлений времени удвоения клеточного материала исходя из предположения, что это время определяется каким-то лимитирующим биохимическим процессом.

При условии, что это время удается рассчитать, рост популяции в экспоненциальной фазе будет описываться уравнением

(51)

где ? - характеристическое время биохимического цикла, лимитирующее деление (время удвоения); - начальная концентрация клеток.

Это достаточно общий и широкий подход, позволяющий проанализировать кинетику роста любой клеточной популяции, если имеется возможность количественного определения ?. Очевидно, что время удвоения будет зависеть от механизма процесса и скорости отдельных его стадий.

Рассмотрим механизм деления клетки, предполагая, что действие фермента (или ферментной системы), трансформирующего лимитирующий субстрат, и процесс репликации ДНК являются самыми медленными стадиями. Такая ситуация часто реализуется для активно растущих микроорганизмов, постоянно находящихся в процессе деления.

2.1 простейшая схема

Проанализируем простейшую схему:

(52)

На первой стадии процесса происходит трансформация исходного лимитирующего субстрата под действием фермента (или ферментной системы) Е с образованием ключевого метаболита S'.Этот процесс представляет собой обычную ферментативную реакцию, и кинетика его описывается «классическим» уравнением Михаэлиса - Метена. Ключевой метаболит S' участвует в процессе репликации и в других параллельных процессах, приводящих к накоплению клеточного материала P. Предполагается, что скорость синтеза ДНК на матрице ДНК пропорциональна концентрации промежуточного метаболита S' и может быть охарактеризована константой скорости . По физическому смыслу это может быть константа скорости удлинения полимерной цепи на одно основание. Важным также представляется предположение о том, что скорость биосинтеза фермента Е и белков репликационного комплекса - относительно быстрые процессы, концентрации этих компонентов постоянны и не входят в уравнения скорости процесса. Любое из этих предположений может быть неоправданно, что существенно изменит кинетическое описание, однако это не затрагивает принципы излагаемого метода.

Кинетику процесса в рамках кинетической схемы (52) описывает система уравнений

(53)

(54)

где - прирост ДНК на исходной матрице.

В условиях стационара по промежуточному метаболиту () имеем

. (55)

Соответственно

(56)

На начальном этапе процесса в режиме S=S₀ уравнение может быть проинтегрировано:

(57)

(при этом использовано начальное условие t=0, DNA=0).

Репликационный процесс заканчивается, когда количество синтезированной DNA=В, где В- количество базовой ДНК. Величина В может быть охарактеризована различным образом. Например, если скорость процессов в клетке выражается в единицах моль в секунду на клетку, то В может быть выражено в единицах моль оснований ДНК на клетку.

При t=_R, DNA=B имеем

(58)

или

(59)

Таким образом, найдено время, необходимое для удвоения ДНК. Видно, что оно зависит от концентрации субстрата обратно пропорционально активности лимитирующего фермента.

Динамика изменения числа клеток в популяции с учетом уравнения (59) определяется соотношением

(60)

т.е. удельная скорость роста культуры будет иметь вид

(61)

Уравнение (61) отражает принципиальную особенность кинетики микробного роста - зависимость удельной скорости роста от концентрации субстрата. При «насыщающих» концентрациях субстрата имеем максимальную удельную скорость

(62)

Из уравнения (62) видно, что основными факторами, приводящими к существенному уменьшению ?_m по сравнению с k_кат, является распределение потоков ключевого метаболита [?_R/(?_R+?) может быть существенно меньше единицы, если ?/?_R>>1, т.е. если на репликационный процесс идет небольшая фермента доля вещества] и малое количество в клетке лимитирующего фермента по сравнению с ДНК.

Величины К_S должны соответствовать константе Михаэлиса лимитирующего фермента.

Рассмотренный подход и полученное уравнение (62) соответствуют самому простому случаю - линейному развитию во времени репликационного процесса. В реальной практике микробного роста могут быть отклонения от этого закона определяемые более сложным характером процесса.

2.2 влияние транспортных процессов на кинетику роста популяции

Рассмотрим закономерности процесса для случая, когда транспорт вещества в клетку может вносить свой вклад в лимитирование процесса роста клетки. Известно, что транспорт лимитирующего субстрата, определяемый действием пермеаз, может быть относительно медленной стадией. Формально эквивалентным является случай, когда транспорт лимитирован внешнедиффуззионным субстрата. Простейшая кинетическая схема имеет вид

, (63)

где ?_т- скорость транспортных процессов.

Кинетику процесса описывает система дифференциальных уравнений

; (64)

; (65)

(66)

Предполагается, что скорость транспортных процессов может линейно зависеть от концентрации субстрата. Это достаточно справедливо для лимитирования субстрата (С.Д. Варфоломеев, Г.Ф. Судьина, 1980):

?_т= kS₀ (67)

Если транспорт вещества определяется действием белков-переносчиков (пермеаз), то скорость процесса может иметь вид уравнения Михаэлиса -Ментен

, (68)

где V- максимальная скорость транспорта; K - эффективная субстратная константа. ?_т может быть выражена в молях субстрата на клетку в единицу времени.

Если в клетке имеет место стационарное состояние по промежуточным субстратам S₁ и S₂, т.е. если то

; (69)

следовательно, скорость роста полимерной цепи ДНК лимитирована скоростью транспорта субстрата. В этом случае удельная скорость роста популяции должна быть представлена уравнением

(70)

где В - количество ДНК, выраженное числом молей оснований на клетку.

Таким образом, удельная скорость роста клеточной культуры может иметь вид (71)

[следствие уравнения 67] или

(72)

[следствие уравнения 68].

Транспорт веществ в клетку может быть быстрым и носить равновесный характер. Этому соответствуют кинетическая схема

(73)

и система уравнений

K= S₁/S₀; (74)

(75)

(76)

В режиме быстрого использования S₂ (? велико) (1/?) dS₂/dt <<S₂ имеет место стационарное состояние по S₂. Соответственно

. (77)

Удельная скорость роста популяции в этом случае дается уравнением

. (78)

Видно, что наличие быстрого равновесного транспортного процесса оказывает влияние на наблюдаемую константу сродства микроорганизма к субстрату и не сказывается на максимальной удельной скорости роста популяции.

2.3 старение клетки в процессе роста

Весьма важные явления, которые наблюдаются в процессе роста индивидуальной клетки, связаны с процессами старения или инактивации ключевых ферментных систем. Инактивации может подвергаться как репликативный комплекс, так и лимитирующий фермент. Как тот, так и другой процесс должны найти отражение в кинетике роста микробной популяции. Рассмотрим общий случай старения клетки, когда на динамику процесса накладывается кинетика неспецифических инактивационных процессов, вызывающих потерю репликационного потенциала и инактивацию лимитирующего фермента. Такого рода явления могут иметь место, например, при «старении» мембран клетки, инактивации энергетических процессов.

Простейшую кинетическую схему, описывающую, сущность таких процессов, можно представить в виде

(79)

где S- исходный лимитирующий субстрат; S'- промежуточный метаболит, лимитирующий репликацию; Е - лимитирующий фермент; Е_R - ферменты репликативного комплекса; Е_i, E'_i - инактивированные формы фермента и репликативного комплекса. Предполагается, что инактивационные процессы имеют экспоненциальную природу и характеризируются общим кинетическим параметром ?.

Кинетику процессов будет описывать система уравнений

(80)

(81)

(82)

(83)

На начальном этапе развития процесса в режиме постоянства концентрации исходного субстрата (S=S₀) и стационарности по S' имеет место соотношение

(84)

Соответственно кинетику роста цепи ДНК будет описывать уравнение

(85)

Обозначим

(86)

Интегрирование (84) при условии t=0, DNA=0 приводит к функции

(87)

Формально схеме (73) эквивалентна схема с инактивацией только лишь репликативного комплекса Е_R , если «отток» промежуточного субстрата S' на репликационный процесс относительно мал:

(88)

При ?_R0<<? уравнения, описывающие кинетику, фактически эквиваленты уравнениям (80)-(81), однако вместо множителя 1/?_R0 в уравнении (84) появляется множитель 1/?, т.е.

(89)

и соответственно в уравнении (85) - множитель ?_R/?:

При конечном росте полимерной цепи, соответствующей ДНК клетки, уравнение (87) позволяет определить время репликационного процесса ?_R . Если принять что при t= ?_R DNA=B, то имеем

(90)

Из этого уравнения следует

(91)

Соответственно

(92)

Как функция начальной концентрации субстрата уравнение удельной скорости роста будет иметь вид

(93)

При малых значениях ?, когда <<1, логарифмический знаменатель уравнения (93) разлагается в быстро сходящийся ряд, что приводит к функции

(94)

Эта функция соответствует уравнению удельной скорости роста типа Моно.

Внешне функция (1.92) мало похоже на «классическое» уравнение Моно, однако графически эти функции весьма близки. Это создает отдельные функции для дискриминации двух механизмов на основе конкретных экспериментальных данных. На рис. 1.2, а приведены рассчитанные значения ? как функции концентрации субстрата при различных значениях константы скорости инактивации ?. Для сравнения на этом же рисунке приведена кривая для случая неосложненного «старением» роста (кривая с ?=0).Видно, что удельная скорость роста культуры для случая «старения» клетки в процессе роста также «насыщаема» субстратом:

(95)

Принципиальное отличие этих двух функций выявляется при анализе их поведения в условиях малых концентраций субстрата. При старении клеток в процессе роста должна существовать пороговая минимальная концентрация субстрата, ниже которой микробный рост невозможен. Из уравнения (95) следует условие

1->0, (96)

из которого получаем

(97)

Видно, чем больше константа скорости инактивации ?, тем выше значение S_кр.

В микробиологии часты случаи, когда рост клеток весьма чувствителен к концентрации лимитирующего субстрата; рост культуры полностью прекращается при переходе к низким его концентрациям. Физический смысл критических эффектов заключается в том, что при малых концентрациях субстрата репликационный процесс идет настолько медленно, что инактивационные процессы успевают блокировать рост клетки.

Отличить рост культуры со старением от неосложненного роста можно на основе изучения зависимости удельной скорости роста от концентрации исходного субстрата. В случае заметных эффектов инактивации ключевых элементов клеточного деления кинетические данные не должны линеаризироваться в обратных координатах (рис.1.2 б). Возможность дискриминации механизмов в значительной степени зависит от точности эксперимента, в первую очередь от точности определения удельных скоростей роста популяции.

Для определения кинетических параметров роста культуры из экспериментальных данных можно воспользоваться приближенными уравнениями, основанными на разложении в ряд логарифмического члена уравнения (93).При концентрациях субстрата выше критической разложение в ряд логарифмического члена уравнения (93) и использование первых двух членов приводят к уравнению

(98)

Это уравнение справедливо при невысокой степени нелинейности экспериментальных данных в координатах 1/? от 1/S₀.

Уравнение (1.97) может быть записано в форме

(99)

где

При малых значениях 1/S₀ (большие концентрации субстрата) может быть сделана оценка K_S и ?_m на основе использования асимптотической прямой, описываемой уравнением

(100)

Эта прямая в координатах 1/? от 1/S₀, имеющая вид касательной в точке 1/?_m. Оценка K_S на основе этой прямой позволяет рассчитать функцию Ф при любой концентрации субстрата:

Ф = 1+ (K_S/S₀) (101)

С учетом этого уравнение (99) может быть трансформировано к виду

(102)

В координатах 1/? Ф от Ф экспериментальные данные должны быть представлены прямой линией, параметры которой дают значения ?_m и ?.

2.4 пределы скорости роста культур микроорганизмов

Представляет интерес анализ числовых значений параметров ?_m и K_S, входящих в уравнение скорости рота микроорганизмов. Значение ?_m характеризует время увеличения популяции микроорганизмов в е раз и может быть сопоставлено со временем удвоения каждой клетки:

?_1/2 =0,69/?_{m .} (103)

В рамках всех рассмотренных моделей параметр K_S связан с константой Михаэлиса наиболее медленно работающего фермента, осуществляющего конверсию лимитирующего субстрата.

Авторами по литературным данным был составлен пул значений ?_m и K_S для различных популяций микроорганизмов. Всего было использовано около 50 значений для каждого из параметров, характеризующих рост культур на лимитирующем субстрате. Значения ?_m найденных величин варьировали в диапазоне 10^-2-10^-5 с^-1, значения K_S - в диапазоне 10^-2-10^-8 М.

Значения параметров процесса удобно характеризовать функцией плотности распределения. Для получения представлений о распределение величины весь пул найденных значений был разбит на группы с приблизительно одинаковыми значениями K_S в пределах одного порядка. Далее было подсчитано число значений в группе и полученная величина разделена на общее число значений в пуле. Тем самым найдена вероятность обнаружения величин с заданным значением константы K_S.

На рис.1.3. приведены полученные значения плотности распределения как функции логарифма значений K_S . кривая распределения близка к нормальному логарифмическому распределению. Эта функция дает представление о вероятностных значениях K_S для любого микроорганизма и субстрата, а также позволяет подсчитать вероятность нахождения величины в заданном интервале значений. Из рисунка видно, что с вероятностью около 0,5 наугад взятый организм будет характеризоваться константой сродства с лимитирующим субстратом, равной 10^-5 М.

Для сравнения на этом же рисунке приведены плотности распределения констант Михаэлиса для ферментативных реакций (С.Д. Варфоломеев, С.В. Зайцев, 1982). Видно, что плотности распределения констант Михаэлиса ферментативных процессов и констант сродства к микроорганизмам в значительной степени перекрываются.

Нижний предел скорости роста культур микроорганизмов определяется, по-видимому, малой жизнеспособностью популяции клеток, имеющих относительно низкие скорости роста.

Абсолютный предел в скоростях удвоения клеток определяется скоростями полимерных молекул. Например, синтез молекулы ДНК занимает отрезок времени, превышающий 15 мин. Проиллюстрируем простым расчетом. Молекула ДНК с М_r~10⁷ содержит ~10⁵ связей, ферментативно образуемых в процессе синтеза. Как известно, наиболее характерные числа оборотов ферментов равны около 10²с^-1(рис.1.3), т.е. одна связь образуется за 10^-2с. Если для синтеза полимера необходимым является последовательный рост полимерной цепи, то этот процесс может завершиться лишь за 10³ с.

Таким образом, значения максимальных удельных скоростей роста микроорганизмов, соответствующие значениям 2,0-2,5 ч^-1, является, по-видимому, абсолютными предельными значениями скорости роста клеток микроорганизмов.

а)

б)

Рисунок 1.2 - Зависимость удельной скорости роста клеточной популяции от концентрации субстрата в условиях проявления клеточного старения (а); те же данные в обратных координатах (б).

Рисунок 1.3- Плотность распределения кинетических характеристик ферментативных реакций.

Заключение

В этой главе были рассмотрены кинетические модели роста популяции микроорганизмов для выявления связи между удельной скоростью роста популяции и концентрацией лимитирующего субстрата. Для этих целей может быть использовано два подхода. Первый подход основан на представлении о росте микробной популяции как автокаталитическом процессе, идущем с учетом, того, что это время определяется каким-либо биохимическим процессом, в частности временем биосинтеза ДНК. Оба подхода приводят к функциональной зависимости удельной скорости роста от концентрации лимитирующего субстрата.

Кинетической моделирование, как всякий модельный подход, позволяет проанализировать различные возможные механизмы процесса при последовательном усложнении схемы процесса. Так, были рассмотрены простейшая схема, схема с равновесным «насыщением » клетки субстратом, схема с субстратом, необратимо трансформирующемся в клетке. Последние две схемы дают зависимость удельной скорости роста от концентрации субстрата типа уравнения Моно. Вообще можно записать бесчисленной число кинетических схем, решения которых приводят к зависимости удельной скорости роста от концентрации субстрата типа уравнения Моно или Михаэлиса - Ментен. Необходимым общим элементом всех этих схем является, по крайней мере, двухстадийность процесса. Т.о., уравнение Моно - отражение многостадийности трансформации субстрата, при этом первая стадия процесса является субстрат-зависимый, скорость второй стадии не зависит от концентрации субстрата.

Принципиально важным и полезным при анализе конкретных экспериментальных данных является использование кинетической модели, учитывающей «старение» клетки в процессе роста. Предполагается, что «старение» клеточного аппарата выражается в инактивации клеточных ферментных систем. Уравнения для удельной скорости роста функционально мало похоже на «классическое» уравнение Моно, однако графически весьма к нему близко. Важный вывод в системах со «старением» должны иметь место критические явления при низких концентрациях субстрата. Рост культуры может происходить только при концентрации субстрата выше критического порога. Указанием на то, что рост исследуемой культуры клеток протекает в рамках механизма, отражающего «старение» клеток в процессе роста, может служить не линейность зависимости скорости роста от концентрации субстрата в обратных координатах. Скорость роста резко падает при низких концентрациях субстрата, соответственно в обратных координатах 1/? резко возростает.

Список использованных источников

1. С.Д. Варфоломеев, С.Д. Варфоломеев Биотехнология: Кинетические основы микробиологических процессов: Учеб. Пособие для биол. и хим. спец. вузов. - М.: Высш. шк., 1990.

2. Н.С. Паников Кинетика роста микроорганизмов. - М.: Наука, 1991.

3. Л.И. Воробьева Промышленная микробиология. - М.: МГУ, 1989.