Характеризація генів та протеїнів вірусу імунодефіциту великої рогатої худоби

Размещено на http://www.allbest.ru/

Характеризація генів та протеїнів вірусу імунодефіциту великої рогатої худоби

Балак О.К., Харківський національний медичний університет, Лиманська О.Ю., Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини»

Метою роботи було визначення дії природного відбору на вірус імунодефіциту великої рогатої худоби (ВІ ВРХ) через ідентифікацію поліморфізмів шляхом порівняння низки генів, відкритих рамок зчитування та протеїнів і аналіз впливу несинонімічних замін в протеїні Vif ізолятів ВІ ВРХ на конформаційні параметри Vif. Тиск відбору на гени оцінено за допомогою тесту Таджими, а також визначення співвідношення коефіцієнтів несинонімічних замін (Ka) до синонімічних (Ks) Ka/Ks. Коефіцієнти Ka та Ks, їхнє співвідношення (K/Ks) розраховано на основі вирівнювань амінокислотних та нуклеотидних послідовностей гена vif ізолятів ВІ ВРХ. Відношення частот несинонімічних (dN) до синонімічних (dS) замін на нуклеотидний сайт dN/dS для оцінки впливу відбору на ген vif розраховували з використанням методу SLAC на сервері Datamonkey.

Кількість водневих зв'язків, а-спіралей, р-шарів, ^-поворотів для третинних структур протеїнів визначено за допомогою сервера I-TASSER. Ідентифіковано гени, відкриті рамки зчитування (ORF) та регуляторну область U3 геному ВІ ВРХ, які перебувають під дією відбору. Гени gag, pol, s, vif, відкриті рамки зчитування ORF W та ORF Y перебувають під тиском негативного (очищуючого) відбору. На ген env та регуляторну область U3 діє позитивний відбір. Аналіз ентропії Шеннона (піків, які є специфічними до позицій амінокислотних залишків), що інтерпретують як поліморфізми, дозволив виявити 16, 8 та 4 несинонімічних замін для протеїнів Pol, Gag, Vif ВІ ВРХ відповідно. Через аналіз впливу чотирьох несинонімічних замін в протеїні Vif на конформаційні параметри Vif двох ізолятів ВІ ВРХ визначено істотні зміни числа водневих зв'язків, а-спіралей, р-шарів, р-поворотів. Показано різнонаправлений вплив відбору на гени ВІ ВРХ

Ключові слова: позитивний відбір, молекулярна еволюція, амінокислотна заміна, однонуклеотидний поліморфізм.

Characterization of bovine immunodeficiency virus genes and proteins

Balak O.K., Kharkiv National Medical University, Lymanska O.Yu., National Scientific Center “Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine”

The goal of the study was determining the effect of natural selection on the bovine immunodeficiency virus (BIV) through the identification of polymorphisms by comparing a number of genes, open reading frames and proteins and analyzing the effect of nonsynonymous substitutions in the Vif protein of BIV isolates on the Vif conformational parameters. The selection pressure on the genes was estimated by Tajima test, as well as the determination of the ratio of nonsynonymous substitutions (Ka) to synonymous (Ks) Ka/Ks. Ka and Ks coefficients, their ratio (Ka/Ks) were calculated on the basis of alignments of amino acid and nucleotide sequences of the vif gene of BIV isolates. The nonsynonymous (dN) to synonymous (dS) substitution rate ratio per nucleotide site dN/dS was calculated to estimate the effect of selection on the vif gene by SLAC method on Datamonkey server. The number of hydrogen bonds, a-helices, в-sheets, в-turns for the protein tertiary structures of proteins was determined by I-TASSER server.

Genes, open reading frames (ORFs) and the U3 regulatory region of BIV genome which are under the influence of selection have been identified. Gag, pol, s, vif genes, ORF W and ORF Y are under the negative (purifying) selection pressure. Env gene and the U3 regulatory region are under positive selection. Shannon entropy analysis (peaks that are specific to the positions of amino acid residues), interpreted as polymorphisms, revealed 16, 8, and 4 nonsynonymous substitutions for Pol, Gag, and Vif BIV proteins, respectively. Significant changes in the number of hydrogen bonds, a-helices, в-layers, в-turns were determined by the analysis of the effect of four nonsynonymous substitutions in the Vif protein on the conformational parameters of Vif of two BIV isolates. The multidirectional effect of selection on BIV genes is shown.

Keywords: positive selection, molecular evolution, amino acid substitution.

Вірус імунодефіциту великої рогатої худоби (ВІ ВРХ, bovine immunodeficiency virus, BIV) -- лентівірус сімейства Retroviridae -- вперше був ізольований у 1969 році, і з цього часу серопозитивних тварин виявляли у багатьох країнах світу. Вірус є причиною прогресуючих та персистентних інфекцій ВРХ, втрати ваги та зниження надоїв молока, виникнення вторинних інфекцій. Аналіз гематологічного профілю BIV-інфікованих тварин свідчить про лімфаденопатію, лімфоцитоз, дисфункцію нейтрофілів та моноцитів. Антигенно та генетично ВІ ВРХ є близьким до вірусів імунодефіциту людини та мавпи та, отже, може бути моделлю при вивченні інших ретровірусів [1].

Одним з основних факторів еволюції вірусів є природний відбір, який підтримує молекулярну адаптацію, тобто виникнення, накопичення та поширення корисних для реплікації та трансмісії мікроорганізмів мутацій (позитивний відбір), або направлений на елімінацію несприятливих генетичних змін (негативний, або очищуючий, відбір) [2].

Найчастішою молекулярно-генетичною подією в ході молекулярної еволюції є нуклеотидні заміни: синонімічні заміни (нейтральні мутації), які змінюють первинну структуру гена, але не підпадають під дію відбору на рівні білків, та несинонімічні заміни, результатом яких є зміни на всіх рівнях організації білка. Зміна первинної структури білка може впливати на конформаційні параметри молекули (наприклад, кількість а-спіралей та p-шарів), упаковування просторової структури, функціональні та фізико-хімічні властивості білка.

Для дослідження молекулярної еволюції генів та відхилення від моделі нейтральної еволюції [3] розроблено низку статистичних методів [4], призначених як для порівняння коротких послідовностей (наприклад, тест Таджими [5]), так і для аналізу великих масивів даних у масштабі геномів (наприклад, метод оцінювання відносного часу дивергенції -- RelTime (relative time) метод [6]).

Для вивчення механізму еволюції білків важливим є питання дії відбору на ті чи інші заміни амінокислот, які можуть бути консервативними або радикальними залежно від їх впливу на фізико-хімічні властивості амінокислоти (зокрема, заряд, полярність). Радикальна заміна веде до значної зміни структури та функції протеїну. Цей термін є вельми відносним, оскільки існує велика кількість визначень радикальних замін, які суперечать одне одному.

Для визначення тиску відбору застосовують співвідношення швидкостей радикальних та консервативних амінокислотних замін [7, 8], яке є прямо пропорційним співвідношенню частот несинонімічних (dNa) та синонімічних (dNs) нуклеотидних замін, що до теперішнього часу широко використовують для визначення типу відбору при вивченні еволюції генів, кодуючих білки [9].

Стримування багатьох інфекційних захворювань ускладнено виключною здатністю патогенів адаптуватися шляхом еволюційних змін [10]. Так, розвиток резистентності до противірусних препаратів вірусу імунодефіциту людини є прикладом паралельної еволюції [11]. Великий розмір популяцій та висока швидкість мутування багатьох патогенів, в тому числі, ретровірусів, дозволяє їм ефективно уникати тиску імунної системи [12].

GenBank містить інформацію щодо 3 ізолятів ВІ ВРХ з повним геномом (нуклеотидні послідовності двох з яких (NC_001413 та М32690) є ідентичними), відомості щодо яких надано до цієї бази даних з 1990 по 2006 рік. Відсутність нових повногеномних сиквенсів ізолятів ВІ ВРХ спонукали автора порівняти існуючі біомолекули ізолятів цього вірусу та спробувати відповісти на запитання, чому за останні понад 15 років в GenBank не депоновано жоден ізолят ВІ ВРХ з повним геномом.

В даній роботі визначено дію природного відбору на ВІ ВРХ через ідентифікацію мутацій шляхом порівняння послідовностей низки генів, відкритих рамок зчитування та протеїнів та проведено порівняльний аналіз впливу несинонімічних замін в протеїні Vif ізолятів ВІ ВРХ на конформаційні параметри цієї молекули.

Матеріали і методи

Нуклеотидні послідовності ізолятів ВІ ВРХ з повним геномом (таксономічний ідентифікатор (txid) 11657) отримано з бази даних GenBank.

Вирівнювання послідовностей ВІ ВРХ проведено за допомогою програми Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) (версія 6.06) [13]. Програму BioEdit (версія 7.2.5) [14] використано для маніпулювання з нуклеотидними та амінокислотними послідовностями, мутаційного аналізу протеїнів, побудови графіків ентропії Шеннона. Тиск відбору на гени оцінено через проведення тесту Таджими на нейтральність, який вбудовано в програму MEGA 6.

Коефіцієнти несинонімічних замін (Ka) та синонімічних замін (Ks), їхнє співвідношення (Ka/Ks) розраховано на основі вирівнювань амінокислотних та нуклеотидних послідовностей гена vif ізолятів ВІ ВРХ. Для цього спочатку обчислено загальне число несинонімічних відмінностей для пари послідовностей, що порівнюють, - реальних Ц,(реальн.) та теоретично можливих Ц,(теор.) несинонімічних замін на даному фрагменті. Ka дорівнює співвідношенню Ц,(реальн.)М,(теор.). Таким же чином визначено Ks.

Крім того, додатково для порівняння гомологічних послідовностей гена ізолятів ВІ ВРХ розраховували відношення частот несинонімічних (dN) до синонімічних (dS) замін на нуклеотидний сайт dN/dS. dN/dS > 1 вказує на позитивний відбір, dN/dS » 1 -- немає відбору, тобто нейтральна еволюція, dN/dS <1 -- очищуючий відбір. Оцінку впливу відбору на ген vifvif проводили з використанням методу SLAC (single likelihood ancestor counting) на сервері Datamonkey [15].

Нуклеотидні послідовності генів та відкритих рамок зчитування ВІ ВРХ (ORF, послідовностей нуклеотидів, які не мають стоп-кодону після стартового кодону (сайту ініціації трансляції) та потенційно можуть кодувати протеїни) отримано з повновимірних геномів 4 ізолятів ВІ ВРХ.

Кількість водневих зв'язків, а-спіралей, р-шарів, p-поворотів для третинних структур протеїнів визначено за допомогою сервера I-TASSER (Iterative Threading Assembly Refinement) за стандартних параметрів [16].

Результати роботи

Проведеним пошуком по базі даних GenBank визначено наступна кількість повногеномних сиквенсів для лентівірусів за період з 01.01.2006 р. по 28.09.2023 р.: вірус артриту-енцефаліту кіз -- 65, вірус інфекційної анемії коней -- 32, вірус вісна-маеді -- 4, вірус хвороби Джембрана -- 0, ВІ ВРХ -- 0.

За час 01.01.1990 р. по 31.12.2006 р. до GenBank депоновано 2 варіанти одного і того ж ізоляту ВІ ВРХ (HXB3) з повним геномом, нуклеотидні послідовності яких збігаються, за різними номерами (NC_001413 та М32690). Програми для біоінформатичного аналізу, наприклад, SLAC на сервері Datamonkey, враховують тільки один з зазначених вище варіантів ВІ ВРХ.

За допомогою аналізу ентропії Шеннона ідентифіковано 4, 8 та 16 амінокислотних варіабельних сайтів для протеїнів Vif, Gag та Pol ВІ ВРХ відповідно (рис. 1).

Варіабельність розраховано як ентропію для позиції кожного амінокислотного залишка (а.з.). Відносна кількість варіабельних сайтів для протеїнів Pol, Gag, Env, Vif ВІ ВРХ та протеїнів, що транслюються з відкритих рамок зчитування, становила: Pol -- 1.5 % (16/1056), Gag -- 1.6 % (8/476), Vif -- 2.0 % (4/198), Env -- 2.6 % (24/904), ORF Y -- 2.5 % (2/80), ORF W -- 3.6 % (2/55).

Аналіз ентропії Шеннона, а саме, піків, які є специфічними до позицій а.з., що інтерпретують як поліморфізми, показав, що в протеомі ВІ ВРХ найменшою варіабельністю характеризується протеїн Pol, а найбільшою -- протеїн ORF W.

Найбільш вивченим ретровірусом є вірус імунодефіциту людини типу 1 (ВІЛ-1), для якого встановлено, що протеїн Vif (virus infectivity factor) протидіє ферментам родини APOBEC. Ці ензими призводять до мутацій геному ВІЛ через дезамінування нуклеотидів. Протеїн Vif блокує включення APOBEC3F та APOBEC3G при синтезі віріону. Внаслідок цього процесу утворюються гіпермутовані та нежиттєздатні вірусні геноми [17].

Рис. 1. Графік ентропії Шеннона для протеїнів, які кодують гени ВІ ВРХ gag (А), vif (Б) та pol (В). Міру мінливості кожного сайту амінокислотної послідовності отримано на підставі множинного вирівнювання нуклеотидних послідовностей та наступної трансляції для 4 ізолятів ВІ ВРХ.

Одним з методів виявлення дії відбору на рівні послідовностей є визначення співвідношення коефіцієнту несинонімічних замін (Ka) до такого синонімічних замін (Ks).

Значення Ka/Ks<1 свідчить про дію переважно очищуючого відбору, при якому значимі мутації є шкідливими. Ka/Ks>1 вказує на дію позитивного відбору.

На основі вирівнювань амінокислотних та нуклеотидних послідовностей гена vif ізолятів ВІ ВРХ та їхніх графіків ентропії Шеннона визначено кількість несинонімічних (ведуть до заміни амінокислоти) та синонімічних (не ведуть до заміни амінокислоти) замін та розраховано співвідношення Ka/Ks. Для протеїну Vif ізоляту L04972 порівняно з ізолятом nC_001413 виявлено дві несинонімічні заміни а.з. (Ц,(реальн.) дорівнює 2), одна з яких (T (P), позиція 4 табл. 1) відповідає заміні неполярного а.з. (T) на інший також неполярний а.з. (P), а друга (T (I), позиція 66 табл. 1) -- заміні неполярного а.з. (T) на гідрофобний а.з. (I).

Полярність а.з. та гідрофобні взаємодії відіграють важливу роль при формуванні третинної структури протеїну. Неполярні а.з. формують ядро протеїнової глобули, що уникає контактів з молекулами води. Зазначені дві заміни двох неполярних а.з. на неполярний та гідрофобний а.з. ведуть до суттєвого зменшення числа водневих зв'язків молекули Vif ізоляту L04972 порівняно з таким ізоляту NC_001413 (табл. 2).

Число теоретично можливих несинонімічних замін Ц,(теор.) становило 12, Ka -- 0,17. Число синонімічних замін Ц._;(реальн.) становило 3, Ц._;(теор.) -- 7, Ks -- 0,43. Відношення Ka/Ks становило 0,39, що свідчить про дію очищуючого відбору (рис. 2) на протеїн Vif ізоляту L04972.

Відбір не діє на синонімічні заміни, і патоген (в даному випадку ВІ ВРХ) з синонімічною заміною неможливо відрізнити від патогена з відсутньою синонімічною заміною без аналізу його геному. Вони відбуваються тільки через випадкові причини, і такий процес називається генетичним дрейфом.

Таблиця 1 -- Позиції амінокислотних залишків (а.з.) протеїнів Gag, Vif, Pol ВІ ВРХ з несинонімічними замінами. Амінокислотні послідовності протеїнів ізоляту NC_001413 використано як референтні