Розробка експрес-тесту на виявлення антигенувірусу африканської чуми свиней методом магнітного імунофлуоресцентного аналізу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Розробка експрес-тесту на виявлення антигенувірусу африканської чуми свиней методом магнітного імунофлуоресцентного аналізу

Середа О.В., канд. хім. наук, ст. наук. сп., Спиридонов В.Г., д-р. с.-г. наук, ст. наук. сп., Тарасов О.А., канд. вет. наук, ст. наук. сп., Криця Я.П., канд. вет. наук, доцент, Ничик С.А., д-р. вет. наук, чл.-кор. НААН Інститут ветеринарної медицини

Для розробки методу магнітного імунофлуоресцентного аналізу (МІФлА) отримано магнітні агарозні мікросфери розміром 40-150 мкм з рівномірно диспергованими в них частинками магнетиту. До магнітних частинок були сорбовані специфічні курячі антитіла проти антигену K204R вірусу африканської чуми свиней (АЧС) та випробувані у тесті з антигеном АЧС у варіанті сендвіч-аналізу з подвійними антитілами. Отримані імунокомплекси антиген - антитіло, мічені флуоресцентною міткою, були візуалізовані за допомогою флуоресцентного мікроскопа і можуть бути кількісно оцінені за інтенсивністю свічення флуориметром.

Ключові слова: імунофлуоресцентний аналіз, магнітні агарозні мікросфери, африканська чума свиней.

Development of an express test for the detection of african swine fever virus antigen by the method of magnetic immunofluorescence analysis

Introduction. Immunofluorescence analysis is a diagnostic method that is based on the specific interaction of fluorescent antibodies with homologous antigens. The antigen-antibody complex formed during this interaction is marked with a fluorescent dye, which can be easily detected by fluorescence microscopy or quantitatively assessed by a fluorescence analyzer.

The goal of the work -production of agarose magnetic microspheres for the development of an express test for the detection of antigens of African swine fever virus (ASFV) in biological secretions by the method of magnetic immunofluorescence analysis.

Materials and methods. Microspheres were prepared using agarose powder (for molecular biology, Sigma-Aldrich) and magnetite powder (Fe3O4) with particle size <5 pm (Shanghai Knowhow Powder-Tech Co., Ltd.). Fluorescence of the conjugates was measured using the “StepOnePlus Instrument” polymerase chain reaction (PCR) analyzer from Applied Biosystems, USA.

Results of research and discussion. Immune complexes of magnetic agarose microspheres- ASF-IgY formed with fluorescently labeled antibodies were visualized by fluorescent microscopy. The bright green staining of sepharose particles, incubated with the target antigen ASFV, is visible in the image, while there is no staining of particles incubated with a 1000-fold excess of the control antigen of Classical swine fever virus, which is a visual confirmation of the high sensitivity and specificity of the proposed method.

Conclusions and prospects for further research. This article describes the development of a magnetic immunofluorescence analysis (MIFA) method using magnetic agarose microspheres (MAM) modified with antibodies. The effectiveness of the modified antibodies on MAM was demonstrated through an express test for the presence of ASFV antigens. The activity of MAM was comparable to that of non-magnetic affinity particles, but they simplified and intensified the process of capturing and isolating target molecules.

Keywords: immunofluorescence analysis, magnetic agarose microspheres, African swine fever.

Вступ

Імунофлуоресцентний аналіз (ІФлА) (метод флуоресціюючих антитіл, реакція імунофлуоресценції) заснований на специфічній взаємодії флуоресціюючих антитіл з гомологічним антигеном. Комплекс антиген - антитіло, що утворюється при цьому, мічений флуорохромом, легко виявити по характерному світінню за допомогою флуоресцентного мікроскопа або кількісно оцінити на флуоресцентному аналізаторі. Метод широко використовується у ветеринарній практиці для діагностування інфекційних, спадкових та інших видів захворювань тварин, а також контролю перебігу лікування [1]. Метод включено до списку рекомендованих Всесвітньої організації здоров'я тварин WOAH [2].

Недолік ІФлА полягає в тому, що його не можна проводити в рідкому середовищі - проба зразка має бути зафіксована на предметному склі або використаний варіант імунохроматографії.

Альтернативою традиційному ІФлА виступає аналіз на основі афінних мікрочастинок (Bead-basedimmunoassays - BBA). Його перевага перед твердофазним імуноферментним аналізом (ІФА), наприклад ELISA, де сорбція відбувається в лунках на планшеті, в тому, що реакція часток відбувається за аналогією з кінетикою молекул реакцій в розчині. Завдяки цьому досягається швидша реакція антиген - антитіло, скорочення часу аналізу та більш висока чутливість виявлення, що має вирішальне значення для виявлення біомаркерів захворювань із низькою поширеністю [3].

Використання магнітних частинок в імуноаналізах дає додаткові переваги за рахунок можливості автоматизувати процес та підвищити його ефективність. Порівняння методів гетерофазного імуноаналізу з різними твердофазними носіями показало найбільшу ефективність стадії преконцентрування аналіту при використанні магнітних частинок, а також найкращі результати чутливості та робочого діапазону імуноаналізу [4]. У варіанті мультиплексного BBA та проточної флуориметрії метод використовується у ветеринарних діагностичних лабораторіях [5].

Агароза широко застосовується для хроматографічного поділу біомолекул завдяки біосумісності, гідрофільності та простоті хімічної модифікації та іммобілізації біомолекул [6, 7]. Класичний метод імунопреципітації передбачає використання саме агарозних частинок для вилучення комплексу антиген-антитіло з клітинних лізатів, сироватки та тканинних гомогенатів [8]. Надання агарозним мікрочастинкам магнітних властивостей дозволяє підвищити функціональні можливості цього носія.

У цій роботі нами були отримані агарозні магнітні частинки та поверхня їх хімічно модифікована послідовно епокси-, аміно- та карбокси-групами. До магнітних частинок були сорбовані специфічні курячі антитіла проти антигену K204R вірусу АЧС та випробувані у діагностиці АЧС методом МІФлА.

Мета роботи: одержання агарозних магнітних мікросфер для розробки експрес-тесту для виявлення антигенів вірусу АЧС у біологічних виділеннях методом магнітного імунофлуоресцентного аналізу.

Матеріали і методи досліджень

Для отримання мікросфер використовувався порошок агарози (Sigma-Aldrich) та порошок магнетиту(Ее₃О₄)з розміром частинок <5 мкм (Shanghai Know how Powder-TechCo., Ltd.). Як емульгатор - полігліцерилполірицинолеат PGPRE476 (Usolf, China). Емульсію отримували за допомогою механічної верхньопривідної мішалки «Eurostar 20 digital» (IKA, DE). Циклогексан, натрію додецилсульфонат (SDS), епіхлоргідрин (ЕСН), N-гідроксисукцинімід (NHS), дициклогексилкарбодіімід (DCC), бурштиновий ангідрид ^А) та інші. Приєднання лігандів здійснювалася також до комерційного гелю агарози (Agarosebeads 4B, ShanghaiLanji, China).

Вимірювання розміру частинок та мікроскопію здійснювали за допомогою мікроскопа Olympus BX43 (Shanghai Lanji, China) флуоресцентною міткою. Для фарбування препаратів агарозних частинок з метою мікроскопії у видимому світлі використовували аптечний 5% спиртовий розчин йоду.

Потенціометричне титрування проводили з використанням приладу “848 Titrinoplus”, Metrohm, Switzerland. Флуоресценцію кон'югантів вимірювали за допомогою аналізатору полімерно-ланцюгової реакції (ПЛР) “Step One Plus Instrument” (Applied Biosystem, USA).

Результати досліджень та їх обговорення

Рекомбінантний антиген K205R вірусу АЧС та антиген E2 вірусу класичної чуми свиней (КЧС) були отримані методами генної інженерії в E. coli. Імунізація курей та виділення з жовтка яєць специфічних курячих антитіл проти антигену K205R (імуноглобулінів ASF-IgY) проводилися аналогічно до схеми, описаної в раніше опублікованій нами роботі [9]. Флуоресцентна мітка до антитіл вводилася за допомогою ізотіоціанату флуоресцеїну (FITC) за описаною методикою [10].

Магнітні агарозні мікросфери. У колбі змішують 0,6 г агарози, 0,25 г магнетиту та 15 мл води, нагрівають у мікрохвильовій печі до повного розчинення агарози та гомогенізації магнетиту, періодичн о обробляючи в підігрітій до 55°С ультразвуковій бані. Колбу з реакційною сумішшю переносять у підігріту до 55°С водяну баню, обладнану механічною тефлоновою мішалкою, додають підігріту до 70°С суміш циклогексану і PGPR, перемішують при 1800-1900 об./хв. протягом 5 хв і знижують температуру в бані до кімнатної. За допомогою неодимового магніту частинки відокремлюють, і послідовно промивають гексаном, водою, 1% розчином SDS, водою й ізопропіловим спиртом. Суспензію частинок у воді пропускають через мембрану (своєрідне «сито») й одержують фракцію розміром 40-150 мкм. Зберігають частки у 20% розчині етанолу.

Функціоналізація магнітних агарозних мікросфер. Магнітні агарозні (магарозні) мікросфери промивають водою на скляному фільтрі, 5 г суспендують у 7,5мл води, додають 3,3мл 2М NaOH та 0,83 мл ECH. Суспензію інкубують при перемішуванні протягом 2 годин при 45°C, та промивають водою і висушують. Суспендують в 1,5 мл води, додають 5 мл концентрованого розчину аміаку, інкубують при 40°С протягом 1,5 год на ротаційному шейкері, промивають водою до pH 7,0 і висушують. Якісний аналіз на наявність КЛ₂-груп в отриманій аміно-магарозі проводили тестом з нінгідрином, кількісний вміст введених аміногруп визначали потенціометричним титруванням 0,1М HCl до pH 7,0 в середовищі 5мл 0,2 М KCl.

Висушену аміно-магарозу суспендують в 15мл 0.1 М NaCl і поступово при перемішуванні додають 0.8г бурштинового ангідриду підтримуючи pH суспензії на рівні 6.0 за допомогою 20% NaOH доти, доки pH не стане стабільним протягом не менше 30 хв. Перемішують на ротаційному шейкері протягом 5год при кімнатній температурі, послідовно промивають водою, 0.05М NaOH, 0.05М HCl і, нарешті, водою до pH 7.0 і висушують. В результаті одержують проміжний продукт - сукциніламіно-магарозу, яку можна тривалий час зберігати в 20% етанолі при 4°С.

Сорбування ASF-IgY до магарозних мікросфер. Висушену на скляному фільтрі сукціаніламіно-магарозу (1г) промивають безводним діоксаном, суспендують у 1,5 мл безводного діоксану, а потім поступово додають 0.05 г NHS та 0.09 г DCC. Суспензію інкубують при перемішуванні протягом 90 хв при кімнатній температурі. Отриману активовану магарозу послідовно промивають діоксаном, метанолом, холодною водою, висушують відсмоктуванням і негайно використовують для пришивки антитіл ASF -IgY. Для цього змішують NHS-активовану магарозу з розчином 1 мг ASF-IgY 1мл PBS pH 7.0. Доводять рН реакційного середовища до 7.0-7.5 карбонатним буфером для зв'язування (0.1M NaHCO3, 0.5M NaCl, pH 8.4) та інкубують протягом ночі при 4°C на ротаційному шейкері. Промивають на скляному фільтрі PBS послідовно pH 7.0; 1М Tris-буфером, pH 8; 0.1М Tris, рН 8, що містить 0.5М NaCl; 0,1 М ацетатом натрію, рН 4, що містить 0.5 М NaCl. Отриманий гель афінної магарози зберігають при 4°С PBS pH 7.0.

Аналогічно з комерційного гелю агарозних мікросфер та імуноглобуліну ASF-IgY синтезовано немагнітний варіант афінних агарозних мікросфер.

Тестування отриманих частинок для виявлення антигену вірусу АЧС за технологією МІФлА. Як негативний контроль для аналізу був використаний рекомбінантний антиген E2 вірусу КЧС. До мікросфер (концентрація 1.0%) додають 10 мкг або антигену K205R, або антигену E2 у буфері PBS. Інкубують 5 хв при кімнатній температурі і промивають 3 рази з PBS-Tween-20, щоб елюювати неадсорбовані матеріали. Після цього до обох зразків додають FITC - мічений IgY (специфічний для K205R) у розведенні 1/10⁶ і інкубацію продовжують протягом 5 хв при кімнатній температурі. Після цього повторюють 3 промивання за допомогою PBS-Tween-20 і переглядають мікросфери під мікроскопом або вимірюють флуоресценцію.

Агарозні мікросфери з магнітними частинками були отримані з гарячого розчину агарози класичним емульсійним методом (W/O) [7, 11], який застосовується у виробництві комерційних сферичних гранул агарозного гелю типу Сефарози (Sepharose®). Для надання магнітних властивостей гарячий розчин агарози у воді з концентрацією 4% попередньо змішували з порошком магнетиту. В якості диспергуючого середовища замість мінерального масла був використаний циклогексан [12].

Для формування та стабілізації емульсії W/O в 84 літературі описані різні емульгатори, наприклад Span-85, Triton Х-100 [12-14]. Експериментальним шляхом нами було обрано найбільш оптимальний на нашу думку емульгатор PGPR, який має показник гідрофільно-ліпофільного балансу близько 1.5. Отримані мікросфери мали правильну сферичну форму, більш вузький розподіл частинок за розміром і легко відмивалися від залишків емульгатора. Частинки магнетиту були рівномірно дисперговані у більшості агарозних сфер (рис. 1).

Рис. 1. Фотографії магнітних агарозних мікросфер, фарбування препарату розчином йоду.

Агарозні мікросфери мали хороші магнітні властивості, завдяки використанню щільних мікрочастинок природного магнетиту. Неправильна форма частинок порошку магнетиту та присутність усередині деяких частинок щільних конгломератів не впливає на їх функціональні властивості. Передбачається, що шляхом підбору умов додаткової попередньої обробки поверхні частинок магнетиту, можливе виключення їхньої агрегації в процесі формування магнітних агарозних мікросфер .

Хімічна модифікація гідроксильних груп магнітних агарозних мікросфер проводилася шляхом епоксидування та амінування [15] з подальшим переведенням у карбокси-форму ацилюванням янтарним ангідридом (рис. 2).

У проміжному продукті - аміно-магарози - потенціометричним титруванням було встановлено вміст 33-35 цМ аміногруп в 1г вологого гелю, що корелює з величиною, отриманою в роботі [15] для епоксигруп агарозного гелю - 662 цМ/г в перерахунку на суху вагу. Такий вміст функціональних груп на поверхні МАМ дозволив успішно іммобілізувати по аміногрупам білкові ліганди методом активних NHS-ефірів SA-MAM (рис. 2).

Рис. 2. Хімічна модифікація гідрокси-груп агарози та іммобілізація білкової молекули.

Випробування отриманих афінних МАМ проводилося методом, в основі якого лежить принцип сендвіч-аналізу з подвійними антитілами. Типова схема виявлення цільового антигену методом МІФлА та її покрокове пояснення зображені на рис. 3.

Рис. 3. Типова схема технології МІФлА

Імунні комплекси магарозних частинок, що утворилися з антитілами, міченими флуоресцентною міткою, були візуалізовані за допомогою флуоресцентні мікроскопії (рис. 4А). На малюнку видно яскраве зелене забарвлення частинок сефарози, які інкубувалися з антигеном вірусу АЧС, при цьому відсутнє забарвлення частинок, інкубованих з 1000 кратним надлишком контрольного антигену вірусу КЧС.

Аналогічні результати флуоресцентної мікроскопії були отримані і для специфічної взаємодії немагнітних частинок з цільовим антигеном вірусу АЧС та антитілами з флуоресцентною міткою (рис. 4В), що підтверджує однакову активність синтезованих магнітних агарозних мікросфер порівняно з частинками комерційного агарозного гелю. Промивання частинок у цьому випадку проводилося центрифугуванням.

Інтенсивна флуоресценція з антигеном K205R може спостерігатись також і за допомогою ПЛР, який використовується як флуориметр. З антигеном E2 вірусу КЧС флуоресценція не спостерігалася (рис. 5).

Рис. 4. Мікроскопічна оцінка МАМ, протестованих антигенами вірусу A4CK205R (ліва панель) або антигенами вірусу КЧС E2 (права панель): A - магнітні агарозні мікросфери+ASF-IgY; В - немагнітні агарозні мікросфери+ASF-IgY; I, III - візуальне світлове спостереження; II, IV - у люмінесцентному світлі (520 нм).

Рис. 5. Флуоресценція комплексу з міченими антитілами, отримана за допомогою ПЛР аналізу.

Висновки та перспективи подальших досліджень

1. В результаті проведеної роботи були синтезовані магнітні агарозні мікросфери, які були успішно використані в експрес -тесті по виявленню африканської чуми свиней.

2. Активність магнітних агарозних мікросфер не поступається активності афінних немагнітних частинок, отриманих на основі комерційного гелю агарози, але дозволяють спростити та інтенсифікувати процес захоплення та виділення молекул-мішеней. У порівнянні з традиційним імуноаналізом використання магнітних частинок та вимірювання флуоресценції дозволяють автоматизувати процес.

Підсумовуючи отримані дані, ми можемо зробити висновок про перспективність використання магнітних агарозних мікросфер для розробки методу виявлення вірусних антигенів у сендвіч-аналізі з подвійними антитілами. Метод не вимагає складного обладнання, а синтез афінних магнітних частинок може бути здійснений в лабораторних умовах.

вірус чума імунофлуоресцентний агарозний

1. Radchuk N.A., Dunayev H.V., Kolyyev N.M., et al. (1991). Veterynarnamikrobiolohiya ta imunolohiya [Veterinary microbiology and immunology]. Moskow: Ahropromvydav [in Russian].

2. Cullinane A.A., Garvey M. (2021). A review of diagnostic tests recommended by the World Organisation for Animal Health Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Scientific & Technical Review, 01, 1, 75-89.

3. You M., Li Z., Zhang P., Bai D., Lin M., Xu F. (2018). Nanomaterial and Micromaterial-Based Immunoassays. Handbook of Immunoassay Technologies, 273-304.

4. Makhneva E., Sklenarova D., Brandmeier J.C., Hlavacek A., Gorris H.H., Skladal P., Farka Z. (2022). Influence of Label and Solid Support on the Performance of Heterogeneous Immunoassays. Anal Chem., 94(47), 16376-16383.

5. Christopher-Hennings J., Araujo K.P.C., Souza C.J.H., Fang Y., Lawson S., Nelson E.A., Lunney J.K. (2013). Opportunities for bead-based multiplex assays in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 25(6), 671-691.

6. Zucca P., Fernandez-Lafuente R., Sanjust E. (2016). Agarose and Its Derivatives as Supports for Enzyme Immobilization. Molecules, 21(11), 1577.

7. Ioannidis N., Bowen J., Pacek A., Zhang Z. (2012). Manufacturing of agarose-based chromatographic adsorbents - Effect of ionic strength and cooling conditions on particle structure and mechanical strength. Journal of Colloid and Interface Science, 367(1), 153-160.

8. Kaboord B., Perr M. (2008). Isolation of Proteins and Protein Complexes by Immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology, 424, 2D PAGE: Sample Preparation and Fractionation, 349-364.

9. Spyrydonov V., Pihida D., Sereda A., Likhanov A., Yu W. (2020). Production and evaluation of egg derived hot start antibodies. Electronic Journal of Biotechnology, 44, 6-13.

10. Hermanson G.T. (2013). Fluorescent Probes. Bioconjugate Techniques, 395-463.

11. Mu Y., Lyddiatt A., Pacek A.W. (2005). Manufacture by water/oil emulsification of porous agarose beads: Effect of processing conditions on mean particle size, size distribution and mechanical properties. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 44(10), 1157-1166.

12. Gustavsson P.-E., Larsson P.-O. (1996). Superporous agarose, a new material for chromatography. Journal of ChromatographyA, 734(2), 231-240.

13. Safdarian M., Hashemi P., Adeli M. (2013). One-step synthesis of agarose coated magnetic nanoparticles and their application in the solid phase extraction of Pd(II) using a new magnetic field agitation device. Analytica Chimica Acta, 774, 44-50.

14. Li J., Guo Z., Zhang S., Wang X. (2011). Enrich and seal radionuclides in magnetic agarose microspheres. Chemical Engineering Journal, 172(2-3), 892-897.

15. Muller T.K.H., Cao P., Ewert S., Wohlgemuth J., Liu H., Willett T.C., Franzreb M. (2013). Integrated system for temperature-controlled fast protein liquid chromatography comprising improved copolymer modified beaded agarose adsorbents and a travelling cooling zone reactor arrangement. Journal of Chromatography A, 1285, 97-109.

Размещено на Allbest.ru