Размещено на http://www.allbest.ru/

Дніпровський державний аграрно-економічний університет

ЦИТОГЕНЕТИЧНІ ЕФЕКТИ ДІЇ НІТРОЗОЕТИЛСЕЧОВИНИ У ПШЕНИЦІ ОЗИМОЇ

Горщар В.І. - к.с.-г.н.,

доцент кафедри рослинництва,

Назаренко М.М. - д.с.-г.н.,

професор кафедри селекції і насінництва

Анотація

Використання хромосомних аберацій для моніторингу мутагенних ушкоджень на рівні хромосомного апарату клітини має досить довгу історію як у плані дослідження цитогенетичної активності окремих препаратів, так і для моніторингу впливу різних антропогенних чинників, передусім пов'язані з різними типами хімічних і радіаційних забруднень. Насіння 8 сортів пшениці озимої Балатон, Боровиця, Зелений Гай, Золото України, Каланча, Нива Одеська, Полянка, Почайна обробляли розчином хімічного мутагену нітрозоетилсечовини (НЕС) у концентраціях 0,01 та 0,025%. Методом світлової мікроскопії проводили аналіз хромосомних аберацій на препаратах мітозів верхівок первинних коренів сортів озимої пшениці на пізній стадії метафази та ранній анафазі. В цілому цитогенетична активність даного мутагену була доволі високою. Досліджували такі показники як загальна частота, фрагменти (одинарні та подвійні), мости (також одинарні - хроматидні - та подвійні - хромосомні), більш рідкісні аберації як мікроядра, відстаючі хромосоми. Окремо враховувалися клітини з множинними хромосомними абераціями (комплексними). Значимо підвищення концентрації вплинуло на всі показники, різниця по генотипу дії була значущою лише для кількості інших аберацій. Кількість клітин з двома і більше абераціями зазвичай є вкрай надійним і достовірним параметром, який відображає підвищення концентрації (дози) мутагену. За модельними ознаками для генотипів відрізняються лише присутності рідкісних типів аберацій (мікроядер, що відстають хромосом). Очевидно, саме ця частина спектра і зумовила зміни за загальною частотою цитогенетичних порушень, які вплинули на відмінності двох сортів від інших за характером мінливості на клітинному рівні. Сайт-специфічні можливості мутагену проявляються саме таким чином, а не через індукцію фрагментів і мостів, які мають більш загальний характер. При цьому в цілому не варто очікувати особливо високих параметрів мінливості на рівні організму, також мутаген у своїх концентраціях, що застосовуються, не досяг значних летальних величин для даних генотипів. Дослідження цитогенетичних параметрів активності навіть порівняно непогано вивчених мутагенних факторів має сенс в аспекті їх взаємодії, менш ушкоджуючи речовини деколи показують досить значні ефекти з точки зору як індукції загальної частоти перебудов, так і їх співвідношень у спектрі.

Ключові слова: пшениця озима, нітрозоетилсечовина, цитогенетика, хромосомні аберації.

Annotation

Horshchar V.I., Nazarenko M.M. Cytogenetic effects of nitrosoethylurea action for winter wheat

The use of chromosomal aberrations to monitor mutagenic damage at the level of the chromosomal apparatus of the cell has a long history, both in terms of studying the cytogenetic activity of individual substances and for monitoring the impact of various anthropogenic factors, primarily related to various types of chemical and radiation pollution. Seeds of 8 winter wheat varieties Balaton, Borovytsia, Zeleny Gai, Zoloto Ukrainy, Kalancha, Niva Odeska, Polyanka, Pochayna were treated with a solution of the chemical mutagen nitrosoethylurea (NES) in concentrations of 0.01 and 0.025%. Analysis of chromosomal aberrations was performed using light microscopy on preparations of mitoses of the tips of primary roots of winter wheat varieties at the late stage of metaphase and early anaphase. In general, the cytogenetic activity of this mutagen was quite high. We studied such indicators as the total rate, fragments (single and double), bridges (also single - chromatid - and double - chromosomal), rarer aberrations such as micronuclei, lagging chromosomes. Cells with multiple chromosomal aberrations (complex) were taken into account separately. A significant increase in concentration affected all indicators, the difference by genotype was significant only for the number of other aberrations. The number of cells with two or more aberrations is usually an extremely reliable and reliable parameter that reflects an increase in the concentration (dose) of the mutagen. Only the presence of rare types of aberrations (micronuclei lagging behind chromosomes) differ according to the model features for the genotypes. Obviously, it was this part of the spectrum that led to changes in the general frequency of cytogenetic disorders, which affected the differences of the two varieties from others in the nature of variability at the cellular level. The site-specific capabilities of the mutagen are manifested in this way, and not through the induction of fragments and bridges, which are more general in nature. At the same time, in general, one should not expect particularly high parameters of variability at the level of the organism, and the mutagen in its applied concentrations did not reach significant lethal values for these genotypes. The study of the cytogenetic parameters of the activity of even relatively well-studied mutagenic factors makes sense in terms of their interaction, less damaging substances sometimes show quite significant effects from the point of view of both the induction of the overall frequency of rearrangements and their ratios in the spectrum.

Key words: winter wheat, nitrosoethylurea, cytogenetics, chromosomal aberrations.

Постановка проблеми

Використання хромосомних аберацій для моніторингу мутагенних ушкоджень на рівні хромосомного апарату клітини має досить довгу історію як у плані дослідження цитогенетичної активності окремих препаратів, так і для моніторингу впливу різних антропогенних чинників, передусім пов'язані з різними типами хімічних і радіаційних забруднень [2, 9]. Методологічно, розробка протоколу застосування певного чинника для індукції мутацій не може проходити без тесту його цитогенетичної активності для визначення загального рівня мінливості при впливі, встановлення порогових значень з точки зору летальних порушень у функціонуванні спадкового апарату [1, 3].

Аналіз останніх досліджень і публікацій

При первинному дослідженні характеру впливу хімічного мутагенного чинника мають значення такі показники як загальна частота хромосомних перебудов, співвідношення окремих типів аберацій, наявність рідкісних типів змін [4, 5]. Також за динамікою частоти перебудов можна судити по пороговому значенню даного чинника з точки зору практичного застосування для генетичного поліпшення даного сорту/гібриду [6, 8].

Хоча безпосередньо неможливо ув'язати певні типи перебудов із змінами у господарсько-цінних ознак, проте, правильний підбір (який починається з тестів цитогенетичної активності) генотипу в залежності від механізмів генетично-обумовленої толерантності до мутагенного впливу, відмінностями в геномі (що призводить до змін ступеня спорідненості до хімічного супермутагену та різної активності окремих ділянок, виникнення нових асоціацій генів) призводить до активізації корисних змін [7, 9].

Постановка завдання

Насіння 8 сортів пшениці озимої Балатон, Боровиця, Зелений Гай, Золото України, Каланча, Нива Одеська, Полянка, Почайна обробляли розчином хімічного мутагену нітрозоетилсечовини (НЕС) у концентраціях 0,01 та 0,025%. Для кожної обробки були використані 1000 зерен пшениці озимої. Експозиція дії мутагену становила 18 годин.

Методом світлової мікроскопії проводили аналіз хромосомних аберацій на препаратах мітозів верхівок первинних коренів сортів озимої пшениці на пізній стадії метафази та ранній анафазі. Після обробки НЕС частини верхівок коренів культивували в чашках Петрі на фільтрувальному папері з дистильованою водою в термостаті за температури - 20-22°С. Після цього частину зразків довжиною 0,8-1,0 см зрізали та фіксували протягом 24 годин у розчині Кларка, який складається з 3 частин 96% етилового спирту та 1 частини очної кислоти. Для кожного варіанту готували близько 25-30 коренів. Цитологічні дослідження забезпечували тимчасовими препаратами, забарвленими ацетокарміном. Зразки оцінювали за допомогою світлового мікроскопа Micromed XS-3330 (множення в 600 разів) з камерою 5М. У кожному варіанті міститься приблизно 1000 рослинних клітин на відповідних стадіях. Статистичний аналіз дат проводився програмою Statistica 10.0. Відмінності між відборами визначали за допомогою однофакторного аналізу (ANOVA) і вважали надійними при Р < 0,05. Відмінності між зразками оцінювали за допомогою тесту Тьюкі HSD.

озимий пшениця хромосомний аберація

Виклад основного матеріалу дослідження

Загальна частота хромосомних аберацій (таблиця 1) показала, що в цілому фактор генотипу не вплинув значною загальною вибіркою (F = 2,44; F0,05 = 2,76; P = 0,07), тоді як послідовне збільшення концентрації підвищило загальний рівень перебудов ( F = 363,82; F0,05 = 3,73; P = 8,54 * 10^-13). Однак окремі генотипи все ж значимо виділилися при попарному порівнянні. Це стосується сорту Зелений Гай (F = 6,32; F0,05 = 2,48; P = 0,01) та сорту Боровиця (F = 2,56; F0,05 = 2,48; P = 0,05), які виявилися відповідно менш та більш стійкими ніж інші. Частота хромосомних аберацій варіювала від 5,58% (сорт Зелений Гай) до 7,94% (сорт Боровиця) при дії НЕС 0,01%, за дії НЕС 0,025% від 7,28% (сорт Зелений Гай) до 10,35% (сорт Боровиця). Таким чином, в цілому цитогенетична активність даного мутагену була доволі високою.

Щодо спектру перебудов хромосомного апарату клітини (таблиці 2 та 3) досліджували такі показники як фрагменти (одинарні та подвійні, які в цілому більш характерні для дії хімічних супермутагенів), мости (також одинарні - хроматидні - та подвійні - хромосомні), а також інші, більш рідкісних аберацій таких як мікроядра, відстаючі хромосоми. Окремо враховувалися клітини з множинними хромосомними абераціями (комплексними), які є досить потужним інтегративним показником впливу мутагену.

Для сумарної частоти фрагментів і подвійних фрагментів суттєвої різниці за фактором генотип не виявлено (F = 2,12; F0,05 = 2,76; P = 0,08), за фактором концентрація різниця достовірна (F = 117,13; F0,05 = 3,73; P = 3,19 * 10 ). Однак попарне порівняння показало, що хоча перша концентрація значуще діяла в порівнянні з контролем, при переході між окремими концентраціями різниця була достовірна не завжди (сорти Золото України, Каланча). Загалом, кількість фрагментів варіювала від 26 (сорт Зелений Гай) до 49 (сорт Полянка) при дії НЕС 0,01%, при концентрації НЕС 0,025% від 34 (сорт Зелений Гай) до 57 (сорт Полянка).

Таблиця 1

Частота хромосомних аберацій при дії НЕС (x ± SD, n = 25)