Анализ метильного статуса отдельных CG-динуклеотидов промотора гена SDH3-1 сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян кукурузы

D. N. Fedorin, A. P. Peltikhina, S. D. Krylova, A.T. Eprintsev

Voronezh State University

Abstract. Analysis of the nucleotide composition of the promoter of the sdh3-1 gene of succinate dehydrogenase showed a uniform distribution of cytosines in the analyzed sequence and the absence of CpG islands. The absence of the CpG island in the promoter of the studied gene suggests the possibility of its regulation due to the conformational state of the analyzed DNA molecule when the methyl status of individual CG-dinucleotides changes. The change in the level of compaction of the DNA molecule is due to a change in the methyl status of the regulatory element of the sdh3-1 gene, the promoter, which can play an important role in controlling the interaction with transcription factors. Based on the nucleotide sequence, primers for bisulfite sequencing were developed to analyze the methylation level of 20 CG-dinucleotides that make up the promoter of the succinate dehydrogenase C subunit gene. A specific amplification product was obtained with the developed primers and its sequencing was carried out. A comparative analysis of the nucleotide sequence of the amplicon with methylated and unmethylated DNA of the studied promoter made it possible to establish its general methylation level, as well as the methyl status of all analyzed CGdinucleotides that make up the studied promoter, at different periods of germination of corn seeds. The results of the study, using comparative analysis methods with specialized software, showed that on the first day of corn seed germination, the total degree of methylation of the studied promoter is 75%, which may indicate poor DNA compaction and a low level of transcription of the studied gene. However, as maize seeds develop, both the general methyl status of the promoter of the sdh3-1 gene of the C subunit of succinate dehydrogenase and the methyl status of individual CG-dinucleotides in its composition change. It was found that on the 4th day of germination of corn seeds, the total methylation degree of CG-dinucleotides of the sdh3-1 gene promoter is 37.5%. It has been shown that a number of analyzed CG-dinucleotides are demethylated. However, it was found that the cytosines at position -451 and -517 do not change their methyl status throughout the experiment and remain unmethylated throughout the experiment.

Keywords: succinate dehydrogenase, DNA methylation, bisulfite sequencing, promoter, primer, amplicon

Одной из ключевых реакций цикла трикарбоновых кислот является реакция, катализируемая сукцинатдегидрогеназой (СДГ, КФ 1.3.99.1) [1]. Ранее было установлено, что данный фермент представлен множественными формами, локализуемыми в митохондрии [2]. Кроме того, показана сложная генетическая детерминация СДГ-системы, что обеспечивает возможность формирования набора изоферментов, участвующих в различных метаболических процессах клетки [3, 4]. В связи с этим, важное значение имеет выяснение механизмов регуляции данного фермента, в том числе эпигенетического. Установлено, что в разные периоды развития семян кукурузы и арабидопсиса наблюдается изменение в функционировании сукцинатдегидрогеназы, проявляющееся в контроле набора изоферментов данного энзима [5, 6]. Отличие набора изоферментов в разные периоды прорастания семян связано с дифференциальной экспрессией генов, кодирующих сукцинатдегидрогеназу. Важное значение в формировании множественных молекулярных форм СДГ играют мембраносвязанные субъединицы С и D, обеспечивающие формирование гидрофобной части фермента и его участие в работе электронтранспортной цепи митохондрий. Установлено, что в регуляции экспрессии генов субъединиц С и D не принимают участие фоторецепторные системы растительной клетки [7], однако данный механизм может быть связан с изменением метильного статуса промоторов генов исследуемого энзима.

Одним из методов анализа статуса метилирования ДНК является бисульфитное секвенирование. В его основе лежит бисульфитная обработка ДНК [8]. Далее проводится амплификация интересующей области с использованием праймеров, после чего амплификаты должны быть клонированы с последующим секвенированием [9, 10]. Этот метод позволяет проводить исследование аллельспецифичного метилирования. Бисульфитное пиросеквенирование основано на последовательном добавлении нуклеотидов к ДНК с высвобождением пирофосфатов, которые под воздействием сульфурилазы, аденозинфосфосульфата и люциферазы индуцируют биолюминесценцию. Люминесценция регистрируется камерой и далее анализируется специальной компьютерной программой [11]. Данный метод обеспечивает надежное и быстрое определение метилирования ДНК принципиально любой последовательности. Бисульфитное секвенирование может использоваться для анализа как глобального статуса метилирования ДНК, так и отдельных ДНК-элементов, в частности мобильных генетических элементов [12, 13]. Изучение статуса метилирования всей ДНК особенно актуально для онкологии, поскольку опухолевые клетки характеризуются глобальным гипометилированием ДНК [14]. Наиболее перспективным методом оценки полногеномного статуса метилирования ДНК является секвенирование следующего поколения. Под ним понимаются различные варианты циклического матричного секвенирования [15]. Данный метод позволяет достаточно быстро определить статус метилирования каждого CpG локуса в геноме. Несмотря на существование некоторых ограничений, этот метод является перспективным в анализе метильного статуса ДНК, в том числе и регуляторных элементов генов промоторов.

В связи с этим целью данной работы являлось изучение уровня метилирования CGдинуклеотидов промотора гена sdh3-1 субъединицы С сукцинатдегидрогеназы в щитках при прорастании семян кукурузы с использованием метода бисульфитного секвенирования.

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

В качестве объектов исследования использовали щитки семян кукурузы (Zea mays L.) 1 и 4 дней прорастания, выращенные гидропонным способом при температуре 25⁰С и 12-часовом световом дне.

ДНК выделяли из щитков кукурузы с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК ПробаГС согласно рекомендациям производителя.

Для визуализации и анализа качества выделенной ДНК использовался электрофорез в агарозном геле.

Модификацию ДНК бисульфитом натрия проводили по методике, описанной ранее [8, 16]. Обессоливание. Очистку ДНК из солевого раствора проводили с помощью набора QIAEX II GelExtraction (“Qiaex”, Германия), в соответствии с рекомендациями производителя.

Десульфонирование. Очищенную пробу ДНК инкубировали в 0,3 М растворе NaOH при 37°С в течение 20 мин. Для этого к 100 мкл раствора ДНК добавляли 11 мкл свежеприготовленного 3 М раствора NaOH.

Для анализа промотора гена sdh3-1 на наличие CpG-островков и подбора праймеров для бисульфитного секвенирования была использована программа MethPrimer (http://www.urogene.org/ methprimer/index1.html). Нуклеотидная последовательность промоторной области гена субъединицы С сукцинатдегидрогеназы кукурузы (LOC100283351) была взята из базы данных NCBI.

ПЦР проводили с помощью набора реактивов AmpliSence (Хеликон, Россия). Реакцию ПЦР проводили на приборе Терцик (ДНК-Технология, Россия) со следующими параметрами амплификации: предварительная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов: 95°С, 20 с, 56°С, 20 с, 72°С, 30 с и 72°С, 4 мин [17].

Очищенный и экстрагированный ампликон секвенировали в ЗАО «Евроген» на платформе Illumina NovaSeq6000.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение нуклеотидного состава промотора гена sdh3-1 субъединицы С сукцинатдегидрогеназы позволило установить присутствие регуляторных элементов в его составе. Результаты исследования с применением программы Methprimer указывают, что промотор гена sdh3-1 имеет невысокий уровень содержания CG-динуклеотидов в своем составе. Результаты проведенного анализа позволили разработать праймеры для бисульфитного секвенирования, позволяющего провести оценку метильного статуса исследуемого промотора в различные периоды развития семян кукурузы (рис. 1).

Рис. 1. Анализ нуклеотидной последовательности промотора гена sdh3-1 на наличие CpG-островков.

Таблица 1.

Праймеры к гену sdh3-1 для бисульфитного секвенирования

На основе представленной в NCBI нуклеотидной последовательности промотора гена sdh3-1 СДГ нами были разработаны праймеры для проведения бисульфитного секвенирования (табл. 1).

Праймеры были специфичны к модифицированной бисульфитом молекуле ДНК, то есть цитозины, входящие в состав промотора были заменены на тимины. Все сайты неметилированных цитозинов показаны в виде тиминов в полученной амплифицированной последовательности смысловой цепи и в виде аденинов в амплифицированной антисмысловой цепи [4]. Для праймеров использовались участки, близкие к центральной области промотора, что представляет собой важный момент в регуляции работы гена, поскольку данная область определяет взаимодействие гена с транскрипционными факторами.

С разработанными праймерами для бисульфитного секвенирования методом ПЦР были получены ампликоны на 1 и 4 дни прорастания семян кукурузы и проведено их секвенирование. Проведенный сравнительный анализ сиквенса, полученного на основе ДНК в 1 день прорастания семян, с теоретическими вариантами метилированной и неметилированной версии анализируемой последовательности, сконструированной программой Methprimer, позволил установить метильный статус CG-динуклеотидов (рис. 2).

Результаты анализа метильного статуса CGдинуклеотидов промотора исследуемого гена показали, что степень его метилирования в 1 день прорастания семян кукурузы составила 75% (табл. 2).

Таблица 2. Процентное содержание метилированных и неметилированных CG-динуклеотидов

Ампликон, полученный с ДНК на 4 день прорастания семян кукурузы, также проанализировали путем сравнения с метилированной и неметилированной версией анализируемой последовательности. Результаты сравнительного анализа представлены на рисунке 3.

Было установлено, что на 4 день прорастания семян кукурузы происходит изменение метильного статуса промотора гена sdh3-1 субъединицы С сукцинатдегидрогеназы. В данный период метилировано 37.5% CG-динуклеотидов исследуемого промотора (табл. 3).

Таблица 3. Процентное содержание метилированных и неметилированных CG-динуклеотидов

В результате проведенного исследования установлено, что в процессе прорастания семян кукурузы наблюдается изменение степени метилирования отдельных CG-динуклеотидов промотора гена субъединицы С сукцинатдегидрогеназы. Цитозин -251 изменяет свой статус c неметилированного в 1 день прорастания на метилированный на 4 день прорастания. При этом, цитозин -441 неметилирован на протяжении всего анализируемого периода прорастания семян. Цитозины в положениях -342, -456 и -479 изначально были метилированы, но на 4 день прорастания семян наблюдается их деметилирование, что проявляется в снижении общего статуса метилирования промотора в данный период. Следует также отметить, что цитозины в положении -451 и -517 не изменяют свой метильный статус на протяжении эксперимента.

Рис. 2. Сравнение нуклеотидных последовательностей ампликона с метилированной и неметилированной ДНК исследуемого промотора гена sdh3-1 на 1 день прорастания семян кукурузы.

Рис. 3. Сравнение нуклеотидных последовательностей ампликона с метилированной и неметилированной ДНК исследуемого промотора гена sdh3-1 на 4 день прорастания семян кукурузы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, бисульфитное секвенирование является эффективным методом анализа уровня метилирования ДНК. Он имеет очевидные преимущества перед метилспецифичной ПЦР. Этот метод позволяет проводить полный анализ метильного статуса генома. Первые данные с применением этой технологии в онкологии уже опубликованы [17], и благодаря увеличению длины секвенируемого фрагмента, а также совершенствованию биоинформационного анализа она может занять лидирующую позицию при анализе метилирования ДНК.

Установлено, что на начальных стадиях развития семян кукурузы наблюдается высокий статус метилирования CG-динуклеотидов промотора гена sdh3-1 субъединицы С сукцинатдегидрогеназы. Высокий статус метилирования соотносится с низким уровнем ферментативной активности исследуемого фермента, что было установлено ранее [18]. Это необходимо для поддержания активной работы метаболических путей, снабжающих проросток энергией и обеспечивающих метаболизацию запасных веществ эндосперма семени. По мере развития растения происходит изменение метильного статуса промотора исследуемого гена и к 4 дню прорастания семян анализируемый показатель составляет 37.5%. Такое снижение степени метилирования промотора гена sdh3-1 связано с увеличением уровня транскриптов данного гена в этот период [19]. Нами показано, что регуляция гена sdh3-1 сукцинатдегидрогеназы осуществляется за счёт эпигенетического механизма путем изменения статуса метилирования промотора исследуемого гена.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Krebs H.A., Lowenstein J.M., Greenberg M. The tricarboxylic acid cycle. NY, Academic Press, 1960, 175 p.

2. Епринцев А.Т., Федорин Д.Н., Карабутова Л.А., Флорес О., Пуглла М. // Прикладная биохимия и микробиология. 2018. Т 54. №1. C. 42-45.

3. Федорин Д.Н., Карабутова Л.А., О.Х. Флорес К., Епринцев А.Т. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2017. Т. 17. C. 818-823.

4. Igamberdiev A.U., Eprintsev A.T., Fedorin N., Popov V.N., Plant Cell Environ, 2014, Vol. 37, No. 2. pp. 290-299.

5. Епринцев А.Т., Федорин Д.Н., Селиванова Н.В., Ву Т.Л., Махмуд А.С., Попов В.Н. // Физиология растений. 2012. Т 59. № 3. C. 332-340.

6. Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Karabutova L.A., Igamberdiev A.U. // Journal of Plant Physiology. 2016. Vol. 205. pp. 33-40.

7. Федорин Д.Н., Добычина М.А., Лопырева Г.Б., Черкасских М.В., Епринцев А.Т. // Auditorium. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2017. № 2 (14).

8. Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S., Collis C.M., Watt F., Grigg G.W., Molloy P.L., Paul L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Vol. 89. pp. 1827-1831.

9. Clark S.J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. // Nucleic Acids Res. 1994. Vol. 22. pp. 2990-2997.

10. Dikow N., Nygren A.O., Schouten J.P., Hartmann C., Kramer N., Janssen B., Zschocke J. // Mol. Cell Probes. 2007. Vol. 21. pp. 208-215.

11. Tost J., Gut I. // Nat. Protoc. 2007. Vol. 2. pp. 2265-2275.

12. Irahara N., Nosho K., Baba Y., Shima K., Lindeman N.I., Hazra A., Schernhammer E.S., Hunter J., Fuchs C.S., Ogino S. // J. Mol. Diagn. 2010. Vol. pp.177-183.

12. Ponomaryova A.A., Rykova E.Y., Cherdyntseva N., Laktionov P.P. // CNAPS. Ed. P.B. Gahan. 2011. Vol. 6. pp. 41-45.

13. Goelz S.E., Vogelstein B., Hamilton S.R., Feinberg A.P. // Science. 1985. Vol. 228. pp. 187-190.

14. Warnecke, P.M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J.R., Clark, S.J. // Methods. 2002. Vol. 27. pp. 101-107.

15. Shendure J. // Nat. Biotechnol. 2008. Vol. 26. pp.1135-1145.

16. Епринцев А.Т., Москалёв Е.А., Попов В.Н. // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. 2001. №1. C. 9-14.

17. Link D.C., Schuettpelz L.G., Shen D., Wang Walter M.J., Kulkarni S., Payton J.E., Ivanovich J., Goodfellow P.J., Le Beau M., Koboldt D.C., Dooling J., Fulton R.S., Bender R.H., Fulton L.L., Delehaunty

K. D., Fronick C.C., Appelbaum E.L., Schmidt H., Abbott R., O'Laughlin M., Chen K., McLellan M.D., Varghese N., Nagarajan R., Heath S., Graubert T.A., Ding L., Ley T.J., Zambetti G.P., Wilson R.K., Mardis R. // JAMA. 2011. Vol. 305. pp. 1568-1576.

18. Епринцев А.Т., Федорин Д.Н., Селиванова Н.В., Ахмад Дж.А., Попов В.Н. // Известия РАН. Серия биологическая. 2010. № 3. C. 324-332.

19. Епринцев А.Т., Попов В.Н., Федорин Д.Н. Сукцинатдегидрогеназа высших растений. Воронеж: ООО Центрально-Черноземное книжное изд-во, 2010, 184 с.

REFERENCES

2. Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Karabutova A., Flores O., Pugla M., Applied biochemistry and microbiology, 2018, Vol. 54, No. 1, pp. 42-45. DOL10.1134/S0003683818010039

3. Fedorin D.N., Karabutova L.A., O. Kh. Flores K. , Eprintsev A.T., Sorption and chromatographic processes, 2017, Vol. 17, pp. 818-823.

4. Igamberdiev A.U., Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Popov V.N., Plant Cell Environ, 2014, Vol. 37, No. 2. pp. 290-299. DOI: 10.1111/pce.12155.

5. Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Selivanova N.V., Wu T.L., Makhmud A.S., Popov V.N., Russian Journal of Plant Physiology, 2012,Vol. 59, No. 3, pp. 332-340. DOI:10.1134/S1021443712030053.

6. Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Karabutova A., Igamberdiev A.U., J. of Plant Physiology, 2016, Vol. 205, pp. 33-40.

7. Fedorin D.N., Dobychina M.A., Lopyreva G.B., Cherkassky M.V., Eprintsev A.T., Auditorium. Electronic scientific journal of Kursk State University, 2017, No. 2 (14).

8. Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S., Collis C.M., Watt F., Grigg G.W., Molloy P.L., Paul C.L., PNAS. USA, 1992, Vol. 89, pp. 1827-1831. DOI: 10.1073/pnas.89.5.1827.

9. Clark S.J., Harrison J., Paul C. L., Frommer M., Nucleic Acids Res, 1994, Vol. 22, pp. 2990-2997. DOI: 10.1093/nar/22.15.2990.

10. Dikow N., Nygren A.O., Schouten J.P., Hartmann C., Kramer N., Janssen B., Zschocke J., Mol. Cell Probes, 2007, Vol. 21, pp. 208-215. DOI: 10.1016/j.mcp.2006.12.002.

11. Tost J., Gut I., Nat. Protoc, 2007, Vol. 2, pp. 2265-2275. DOI: 10.1038/nprot.2007.314.

12. Irahara N., Nosho K., Baba Y., Shima K., Lindeman N.I., Hazra A., Schernhammer E.S., Hunter D.J., Fuchs C.S., Ogino S., J. Mol. Diagn, 2010, Vol. 12, pp. 177-183. DOI: 10.2353/jmoldx.2010.090106.

13. Ponomaryova A.A., Rykova E.Y., Cherdyntseva N., Laktionov P.P., CNAPS. Ed. P.B. Gahan, 2011, Vol. 6, pp. 41-45.

14. Goelz S.E., Vogelstein B., Hamilton S.R., Feinberg A.P., Science, 1985, Vol. 228, pp. 187-190. DOI: 10.1126/science.2579435.

15. Warnecke P.M., Stirzaker C., Song, J., Grunau C., MelkiJ.R.,ClarkS.J.,Methods,2002,Vol.27,pp.101-107.

16. Shendure J., Nat. Biotechnol, 2008, Vol. 26, pp. 1135-1145. DOI: 10.1038/nbt1486.

17. Eprintsev A.T., Moskalev E.A., Popov V.N., System analysis and management in biomedical systems, 2001, No. 1, pp. 9-14.

18. Link D.C., Schuettpelz L.G., Shen D., Wang J., Walter MJ, Kulkarni S., Payton J.E., Ivanovich J., Goodfellow P.J., Le Beau M., Koboldt D.C., Dooling D.J., Fulton R.S., Bender R.H., Fulton L.L., Delehaunty K.D., Fronick C.C., Appelbaum E.L., Schmidt H., Abbott R., O'Laughlin M., Chen K., McLellan M.D., Varghese N., Nagarajan R., Heath S., Graubert T.A., Ding L ., Ley T.J., Zambetti G.P., Wilson R.K., Mardis E.R., JAMA, 2011, Vol. 305, pp. 1568-1576. DOI: 10.1001/jama.2011.473.

19. Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Selivanova N.V., Akhmad J.A., Popov V.N. // Bulletin of the Russian Academy of Sciences. Biological Series, 2010, No. 3, pp. 324-332.

20. Eprintsev A.T., Popov V.N., Fedorin D.N. Succinate dehydrogenase of higher plants. Voronezh. Publishing House LLC, 2010, 184 p.

Размещено на Allbest.ru