Эколого-генетические принципы селекции растений на повышение эффективности взаимодействия с микроорганизмами

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ НА ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МИКРООРГАНИЗМАМИ*

Н.А. Проворов, И.А. Тихонович

Рассматриваются проблемы создания экологически сбалансированных сельскохозяйственных систем на основе повышения эффективности взаимодействия между растениями и симбиотическими микроорганизмами (клубеньковыми бактериями, ростстимулирующими ризобактериями, микоризными грибами), что позволит существенно снизить объемы применяемых удобрений и средств защиты растений. Обоснована необходимость использования дикорастущих форм растений в качестве доноров хозяйственно ценных генов симбиоза, так как современные сорта интенсивного типа обеднены наследственными факторами, контролирующими эффективное взаимодействие с микроорганизмами. Изложены принципы координированной селекции растений и микроорганизмов, направленной на создание комплементарных сочетаний их генотипов с целью наиболее полного использования симбиотического потенциала. На примере бобовых культур показана высокая наследуемость количественных признаков симбиоза (нитрогеназная активность, продуктивность растений при симбиотрофном питании азотом, их предпочтительная заражаемость эффективными штаммами ризобий), а также возможность использования широкого спектра методов селекции для повышения симбиотического потенциала растений.

сельскохозяйственный растение симбиотический микроорганизмы

Симбиотические взаимодействия с микроорганизмами играют исключительно важную роль в жизни растений, обеспечивая их минеральное питание (в первую очередь азотное и фосфорное), адаптацию к абиотическим стрессам (повышенная температура или кислотность почвы, недостаток влаги, техногенные загрязнения), а также защиту от патогенов и вредителей (табл. 1). Интенсивные исследования растительно-микробных взаимодействий позволили существенно расширить наши представления о природе растений, их экологических функциях и способах хозяйственного использования. В рамках классических представлений физиологии растение рассматривали как сложный химический реактор, который, используя солнечную энергию, превращает неорганические вещества в органические (1). В рамках возникшей позднее физиологической экологии продуктивность растений расценивали как проявление нормы реакции на действие абиотических факторов среды -- освещенности, влажности, температуры, химического состава почвы, особенностей климата (2). Однако по мере развития биоценотических представлений стало очевидным, что растения выполняют функцию первичных продуцентов в природных или искусственных экосистемах главным образом за счет интеграции с их биотическими компонентами (3). Среди последних центральное место занимают микроорганизмы, которые являются для растений донорами широкого круга адаптивно значимых функций. Поэтому очевидно, что экосистемные функции растений не сводятся к продуцированию органического вещества. Растение предоставляет множество ниш для развития микроорганизмов (поверхность органов, ткани и клетки), образуя в совокупности с ними сложное сообщество (симбионтоценоз), которое выполняет функцию первичного продуцента, а в значительной степени -- и первичного консумента органического вещества в экосистемах.

Соответственно эволюции представлений о природе и экосистемных функциях растений изменяется и стратегия их использования в сельском хозяйстве. Интенсивное землепользование, предусматривающее массированное применение удобрений и химических средств защиты, уступает место экологически сбалансированному (sustainable) землепользованию, основанному на реализации адаптивного потенциала растений в системе агроценоза (4).

1. Практически значимые микробно-растительные симбиозы

К сожалению, современные сорта интенсивного типа не всегда способны в силу генетических особенностей к взаимодействию с полезной микрофлорой. Так, у большинства бобовых культур потенциал симбиотической азотфиксации в модельных опытах в 3-4 раза превышает таковой в производственных условиях, то есть реально достигаемый (5). За счет селекции бобовых и совершенствования технологий применения микробных препаратов интенсивность симбиотической азотфиксации можно увеличить не менее чем на 300 % (6). Однако для реализации этого потенциала необходима серьезная перестройка селекции растений: она должна перейти от создания сортов интенсивного типа, ориентированных на использование минеральных удобрений и химических средств защиты, к конструированию «адаптивных» сортов, формирующих высокую продуктивность за счет биологического потенциала самих растений, достигнутого в ходе длительной коэволюции с окружающими организмами.

Идеи адаптивной селекции растений были заложены в трудах выдающегося эколога первой половины XX века Д. Ацци (7, 8), после чего получили активное развитие, в том числе и в нашей стране (9). Одним из основных направлений адаптивной селекции является симбиотическая селекция, нацеленная на повышение эффективности взаимодействия между растениями и полезными микроорганизмами (10). В мировой практике опыт этой работы пока ограничен симбиотической азотфиксацией, происходящей в клубеньках бобовых: люцерны, клевера, гороха, фасоли (11-15). Хотя генотипы, отселектированные на повышенную интенсивность азотфиксации, еще не нашли широкого хозяйственного применения, полученные данные показали чрезвычайную перспективность симбиотической селекции и позволили сформулировать общие принципы, которые должны быть положены в ее основу.

Симбиотический потенциал дикорастущих и культурных форм растений

Среди многочисленных функций, выполняемых микросимбионтами растений, наиболее широко распространена способность улучшать питание хозяина за счет азотфиксации, осуществляемой эндосимбиотическими или ассоциативными бактериями, а также мобилизации питательных веществ почвы, опосредованной главным образом микоризными грибами (16). Детально изучена симбиотрофность у бобовых растений, более 90 % которых вступают в симбиоз с азотфиксирующими клубеньковыми бактериями или ризобиями (17). При симбиозе бобовые образуют на корнях особые органы -- клубеньки, в которых ризобии синтезируют фермент нитрогеназу, катализирующий восстановление молекулярного азота до аммиака. Генетику бобово-ризо-биального симбиоза в настоящее время интенсивно исследуют у обоих партнеров. В частности, у бобовых растений выявлено уже свыше 100 генов, контролирующих все основные стадии развития клубеньков, а также системную регуляцию этого процесса и азотфиксирующую активность (18).

Для бобовых характерны два способа получения азота, обозначенные как симбиотрофный и автотрофный типы азотного питания (19). Несмотря на разнообразие методов оценки эффективности симбиотической азотфиксации, в их основу может быть положен единый подход, заключающийся в сравнении продуктивности растений в условиях, оптимальных для питания либо фиксированным, либо связанным азотом. В простейшем случае коэффициент симбиотической эффективности вычисляют по формуле Е = (М_с/М_а)100 %, где М_с и М_а -- продуктивность растений соответственно при симбиотрофном и автотрофном питании азотом (20).

Использование этого подхода позволило выявить широкое внутри- и межвидовое варьирование бобовых по способности использовать альтернативные источники азота (18). Для большинства сортов традиционных культур -- люцерны (Medicago sativa, M. varia), сои (Glycine max, G. soja), фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris), гороха посевного (Pisum sativum), вики посевной (Vicia sativa) -- характерно преобладание автотрофного азотного питания над симбиотрофным либо равнозначное использование этих источников азота. Преобладание симбиотрофного питания азотом выявлено лишь у некоторых новых культур, таких как вика мохнатая (V. villosa), клевер переменчивый (Trifolium ambiguum), козлятник восточный (Galega orientalis). Это связано с тем, что селекцию растений традиционно проводят на высоком агрохимическом фоне, включающем достаточное (а часто и избыточное) количество азота. Очевидно, что длительная селекция в таких условиях не могла не привести к обеднению генофонда растений наследственными факторами, контролирующими способность к симбиотрофному азотному питанию: селекционеры и растениеводы бессознательно «отучали» растения использовать экологически безопасный, но энергетически дорогостоящий атмосферный азот (19).

Снижение симбиотического потенциала при окультуривании и селекции можно проследить для ряда бобовых культур. Так, у люцерны и гороха дикорастущие популяции и местные сорта превосходят селекционные сорта по нитрогеназной активности (21, 22). У пажитника греческого (Trigonella foenum graecum) окультуренный подвид -- сенной (foenum graecum) уступает дикорастущему подвиду -- индийскому (indicus) по интенсивности образования клубеньков и азотфиксации (23, 24). У фасоли выявлено превосходство по азотфиксирующей активности примитивного вьющегося экотипа над окультуренным кустовым экотипом (25). При гибридизации этих экотипов получены линии, у которых комплекс хозяйственно ценных признаков, сформированный в ходе длительной селекции, совмещен с высоким уровнем азотфиксации, характерным для примитивных форм фасоли (15).

Таким образом, ближайшей задачей селекции бобовых следует считать восстановление естественного потенциала симбиотической азотфиксации. При этом необходимо максимально широко использовать дикорастущие и малоокультуренные формы; вавиловский принцип вовлечения в селекцию природного разнообразия растений в этом случае чрезвычайно актуален. Особое внимание селекционеры должны уделять центрам происхождения бобовых культур, которые являются резервуарами природной изменчивости не только растений-хозяев, но и их симбионтов (26). На примере пажитника и гороха показано, что в дикорастущих популяциях и у местных сортов изменчивость по симбиотическим признакам выражена намного сильнее, чем у селекционных сортов (24, 27). Очевидно, что этот полиморфизм позволяет растениям использовать разнообразные природные источники азота, обеспечивая стабильное поддержание популяций в широком диапазоне почвенных условий и при взаимодействии с различными формами бактерий.

Задача восстановления природного симбиотического потенциала актуальна и для других типов растительно-микробных взаимодействий. Так, для пшеницы показано превосходство дикорастущих диплоидных форм над гексаплоидными сортами по эффективности поддержания в ризосфере PGPR-бактерий (Plant Growth Promoting Rhizobacteria): число бактериальных клеток на 1 мг углерода корневых экссудатов у диплоидов в 20-30 раз выше, чем у гексаплоидов (28). У дикорастущих форм и местных сортов гороха и кукурузы выявлена более высокая эффективность образования арбускулярной микоризы, чем у сортов интенсивного типа (29, 30).

Несмотря на то, что для селекционных сортов бобовых в целом характерна пониженная по сравнению с дикорастущими формами эффективность симбиоза, в сортах сохраняется определенное количество симбиотически активных генотипов, которые могут и должны быть вовлечены в селекцию. Об этом свидетельствует высокая внутри- и межсортовая изменчивость по признакам симбиоза, выявленная практически у всех бобовых культур. Для многих сортов бобовых характерно преобладание генотипов с низкой симбиотической активностью, что выражается в левосторонне-асимметричных (As > 0) распределениях индивидуальных растений по нитрогеназной активности и числу клубеньков (18). Это показывает, что структура сортовых популяций бобовых складывалась в условиях сдвига баланса между различными типами азотного питания в пользу автотрофного, что было связано с активным применением азотных удобрений.

Оценка исходного материала

Симбиотическая селекция требует оценки большого количества генотипов растений на эффективность взаимодействия с микроорганизмами, что технически часто бывает трудновыполнимо. Поэтому разработано несколько групп экспресс-методов, позволяющих решать эту задачу:

-- Отбор растений на обедненных субстратах. Весьма эффективным является отбор бобовых, обладающих повышенной симбиотической активностью, на безазотном (резко обедненном по азоту) фоне. Сходная методология может быть использована при селекции растений на взаимодействие и с другими микроорганизмами, выполняющими трофические функции, например с микоризными грибами.

-- Учет интенсивности колонизации растений микроорганизмами. В случае морфологически оформленных взаимодействий (например бобово-ризобиального симбиоза) можно проводить учет образования анатомических структур, характерных для симбиоза. При взаимодействиях, не сопровождаемых образованием специальных органов (симбиозы с эндофитными и эпифитными микроорганизмами, разные формы микоризы), присутствие симбионтов в тканях или на поверхности органов растений можно регистрировать с помощью специально введенных генов-репортеров (lacZ, gus, lux, gfp).

-- Оценка ферментативных активностей, специфичных для симбиозов. При изучении азотфиксирующих систем в первую очередь следует определять активность нитрогеназы, катализирующей восстановление азота. Хотя этот фермент синтезируется и функционирует в бактериальных клетках, у большинства ризобий его синтез происходит только при симбиозе. В связи с этим нитрогеназная активность клубеньков может с полным основанием считаться признаком бобовых растений, по которому должна проводиться их селекция. Существенное возрастание интенсивности азотфиксации может быть достигнуто за счет отбора бобовых растений на высокую активность клубенько-специфических изоформ ферментов С- и N-обмена (например фосфоенолпируваткарбоксилазы и глутаматсинтазы), участвующих в снабжении бактерий углеродом и в ассимиляции фиксированного азота (6). При функционировании микоризных симбиозов важную роль играют некоторые ферменты углеродного (сукцинатдегидрогеназа) или фосфорного (полифосфатазы) метаболизма, которые в перспективе можно использовать в качестве маркеров при отборе симбиотически активных растений (30).

Для определения нитрогеназной активности при азотфиксирующих симбиозах применяют прямые и косвенные методы. Прямые методы на основе использования нерадиоактивного изотопа ¹⁵N позволяют дать наиболее адекватную оценку количества фиксируемого азота (31). Однако для экспресс-анализа селекционного материала нецелесообразно применение этих дорогостоящих методов. Поэтому широкое распространение получил косвенный метод, основанный на способности нитрогеназы восстанавливать ацетилен до этилена (ацетилен-редуктазная активность -- АРА). Первое время после разработки ацетиленового метода считалось, что он позволяет решать весь комплекс задач, связанных с изучением азотфиксирующих систем, в том числе определять количество фиксируемого азота (32, 33). Позднее выяснилось, что этот метод имеет серьезные ограничения: ацетилен нарушает каталитические свойства нитрогеназы, а также влияет на целостность диффузионного барьера, ограничивающего доступ в клубеньки токсичного для нитрогеназы кислорода (34). Кроме того, метод определения АРА моделирует лишь первую стадию фиксации азота, так как в молекуле С₂Н₂ происходит разрыв только одной из трех связей между атомами углерода.

Несмотря на эти ограничения, метод определения АРА может быть использован при сравнительной оценке большого числа генотипов растений, так как систематические ошибки этого метода нивелируются в ходе сравнения. Особенно удобен метод определения АРА на первых этапах селекции, когда решается задача отбраковки большого числа симбиотически неактивных растений. Эффективность этого подхода показана на примере козлятника восточного сорта Гале, весьма изменчивого по АРА и содержащего менее 10 % растений, обладающих высокой азотфиксирующей активностью (35).

Показана возможность применения метода определения АРА и на последующих этапах селекции при сравнительной оценке симбиотически активных генотипов (11, 14, 15, 36). Однако при этом необходимо иметь в виду, что излишне высокая нитрогеназная активность может приводить к потреблению больших количеств энергии, что отрицательно отражается на продуктивности растений. Ограничивает использование метода определения АРА в селекции симбиотрофных форм и то обстоятельство, что нитрогеназная активность не всегда четко связана с эффективностью симбиоза, определяемой по массе растений. В модельных опытах, проведенных с использованием самофертильных линий люцерны, показано, что АРА коррелирует с массой растений для индивидуальных особей внутри каждой линии (r = 0,55; Р₀ < 0,01), однако при сравнении разных линий достоверная корреляция отсутствует (r = 0,21; Р₀ > 0,05) (37). Следовательно, интенсивность фиксации азота и его использование для формирования биомассы контролируются у растений разными группами генов. Поэтому метод определения АРА наиболее эффективно может применяться в селекции при работе с относительно однородным растительным материалом.

Большой интерес представляет использование в симбиотической селекции биохимических признаков растений. На примере люцерны показано, что повышение симбиотической активности растений может быть обусловлено активацией выделения корнями флавоноидов, играющих ключевую роль в индукции генов вирулентности ризобий (38, 39). Взаимодействие небобовых растений с ризосферными PGPR-бактериями связано с составом выделяемых корнями экссудатов: наибольшая азотфиксирующая и антифунгальная активность PGPR-бактерий проявляется тогда, когда в экссудатах преобладают органические кислоты, являющиеся оптимальными источниками питания и энергии для этих бактерий (28, 40). В связи с этим в селекции растений на повышение активности ризосферных ассоциаций следует учитывать состав корневых экссудатов (41). Важно отметить, что в ходе симбиотической селекции можно существенно улучшить биохимический состав растений, например, у люцерны при активном симбиотрофном питании азотом накопление нитратов снижается, а накопление белка, витаминов и каротина -- возрастает (42, 43).

Улучшение симбиотических признаков бобовых растений

В селекции бобовых растений на повышение эффективности симбиотической азотфиксации может применяться широкий набор методов, включая массовый и индивидуальный отбор, рекуррентную и беккроссную селекцию, а также методы, связанные с использованием доноров и созданием синтетических популяций (18). Выбор используемого метода зависит от биологии размножения растений, а также от особенностей генетического контроля признаков симбиоза.

Наследование симбиотических признаков. Симбиотические свойства бобовых растений контролируются олигогенами, аллельное состояние которых определяет качественное проявление способности к симбиозу (например ключевые стадии морфогенеза клубеньков), и полигенами, детерминирующими количественное проявление симбиотических признаков (число и масса клубеньков, интенсивность фиксации азота, продуктивность симбиотрофно питающихся растений). Наибольшее внимание селекционеров привлекают полигены, то есть исследование количественных признаков симбиотической азотфиксации (12, 44). При гибридизации различных сортов бобовых наследуемость азотфиксирующей активности и числа клубеньков в широком смысле может достигать 0,8-0,9, а в узком смысле -- 0,6-0,8. Для люцерны, сои и инкарнатного клевера (Т. incarnatum) при селекции на симбиотические признаки выявлена высокая реализованная наследуемость (табл. 2).

Эти данные свидетельствуют о том, что отбор бобовых растений по признакам симбиоза может быть весьма результативным. В то же время при селекции необходимо учитывать, что характер наследования симбиотической активности в случае гибридизации контрастно различающихся форм зависит от вида растений и анализируемого признака (18). Так, у сои высокая азотфиксирующая способность является доминантным признаком, а у клевера лугового (T. pratense), люцерны и гороха -- рецессивным или полудоминантным. У клевера подземного (Т. subterraneum) число клубеньков и скорость их образования обусловлены соответственно доминантным и полудоминантным генами.

2. Характер наследуемости симбиотических признаков у растений различных бобовых культур (цит. по 18)

Существенную роль в определении количественных признаков симбиоза играют эффекты гетерозиса. При диаллельных скрещиваниях был выявлен существенный вклад специфической комбинационной способности (СКС) в определении симбиотических признаков, часто превышающий вклад общей комбинационной способности (ОКС). Так, у растений люцерны по нитрогеназной активности и удельному содержанию азота эффекты СКС оказались выше, чем ОКС, а по массе растений, общему содержанию азота и числу клубеньков преобладали эффекты ОКС (45). У растений гороха в определении нитрогеназной активности преобладали эффекты СКС, а массы растений и числа клубеньков -- ОКС (46). Гетерозис позволяет избежать снижения продуктивности, наблюдаемого у перекрестноопыляющихся бобовых (люцерна посевная, клевер луговой) при рекуррентной селекции на высокую нитрогеназную активность (11, 47).

Селекция по признакам клубенькообразования. Одним из первых и наиболее простых этапов получения симбиотически активных растений является отбор по интенсивности образования клубеньков. Так, у растений фасоли в результате двух-трех циклов рекуррентного отбора удалось получить формы, превышающие по числу клубеньков исходные сорта более чем в 2 раза (48). При этом общая масса клубеньков увеличивалась менее чем на 60 %, однако масса одного клубенька уменьшалась на 14-30 %. Аналогичные данные были получены при массовом отборе на повышенную интенсивность клубенькообразования у сои (49). У клевера подземного отбор на увеличение числа клубеньков также сопровождался уменьшением их размеров, в результате чего общий объем клубеньков оставался постоянным (50). Эта закономерность связана с наличием у бобовых мощных систем авторегуляции клубенькообразования, которые лимитируют формирование избытка клубеньков. Однако повышение интенсивности образования клубеньков до определенного предела может быть целесообразным: линии фасоли, отобранные по этому признаку, превосходили исходные сорта по массе семян на 74 %, по содержанию в них белка -- на 27 % (48). У растений гороха между эффективностью симбиотической азотфиксации и числом клубеньков высокая степень корреляции отмечена только у линий с низкой интенсивностью образования клубеньков (51).

При симбиотической селекции бобовых растений необходимо учитывать тот факт, что в полевых условиях растения взаимодействуют не только с производственными, но и с местными штаммами ризобий, которые часто обладают низкой азотфиксирующей активностью, но высокой конкурентоспособностью (52). Со стороны ризобий процесс конкуренции за образование клубеньков контролируется сложным комплексом генов, манипулирование которыми позволяет совмещать в одном штамме высокую азотфиксирующую активность и конкурентоспособность (53). Однако для эффективного решения проблемы конкуренции интродуцированных и местных штаммов ризобий необходимо использовать также и генетически обусловленную предпочтительность растений к заражению определенными штаммами.

Известно, что бобовые растения весьма полиморфны по способности отбирать из смешанного инокулюма эффективные штаммы ризобий. Возможность селекции по признаку предпочтительной заражаемости ризобиями (host preference) была впервые показана для клевера ползучего (Т. repens) (54). У люцерны при селекции на повышение азотфиксации удалось получить формы, обладающие способностью отбирать высокоактивные штаммы ризобий из смеси последних с низкоактивными штаммами (11). У гороха для решения этой задачи был использован метод интрогрессии в высокопродуктивные сорта аллеля sym-2, который определяет устойчивость к штаммам Rhizobium leguminosarum, доминирующим в почвах Европы, однако не препятствует инокуляции штаммами-интродуцентами, содержащими специфический ген вирулентности nodX. В качестве доноров аллеля sym-2 использовали примитивные линии гороха афганского происхождения, в качестве реципиента -- высокопродуктивный и симбиотически активный сорт Норд. После проведения серии беккроссов и отборов на безазотном фоне были выделены линии гороха, устойчивые к заражению почвенными штаммами ризобий, но образующие клубеньки при симбиозе со специально подобранным высокоактивным штаммом Al (nodX⁺). При инокуляции штаммом А1 урожайность семян была более чем на 50 % выше, чем у растений исходного сорта (55, 56). Аналогичный подход можно применить и в селекции сои, у которой выявлена серия генов, ограничивающих инокуляцию неэффективными штаммами Bradyrhizobium japonicum (57).

Селекция по азотфиксирующей активности. Приступая к селекции на повышение азотфиксирующей активности, селекционеры часто задаются вопросом: должны ли они стремиться к полному «переключению» бобовых растений на симбиотрофное питание азотом или необходимо лишь количественное изменение баланса между двумя типами питания? Известно, что максимальная эффективность симбиоза достигается при выращивании растений на обедненных почвах, так как усвоение связанного азота энергетически более выгодно, чем фиксация атмосферного азота, и при внесении нитратов в высоких дозах бобовые часто не образуют клубеньков. У этих растений можно получить формы со значительным преобладанием симбиотрофного типа питания азотом, например суперклубенькообразующие мутанты (Nod⁺⁺) сои или гороха (58, 59). Общая нитрогеназная активность (на одно растение) у этих мутантов обычно бывает повышена, однако специфическая активность (на единицу массы клубеньков) -- понижена. У таких форм часто снижена интенсивность усвоения нитратов, но повышена устойчивость симбиотического аппарата к ингибирующему действию последних, в связи с чем фенотип суперклубенькообразующих мутантов часто обозначают Nts (nitrate tolerant symbiosis). Однако общая продуктивность у Nod⁺⁺Nts-мутантов обычно понижена в связи с перерасходом энергии на образование и функционирование избытка клубеньков (60).

В результате селекции по АРА нам удалось получить линии гороха, продуктивность которых увеличивается в безазотной среде, но уменьшается при внесении нитратов (14). У этих линий соотношение симбиотрофного и автотрофного типов питания азотом было более сбалансированным: коэффициент эффективности составлял в среднем 96,06,5 %, тогда как у исходных сортов -- 77,03,5 %. Анализ полученных линий показал, что селекцию бобовых целесообразно проводить лишь на относительно небольшое превышение (на 30-50 %) нитрогеназной активности над исходным уровнем, тогда как существенное увеличение последней (в 4-6 раз) сопровождается снижением массы растений.

Представленные данные свидетельствуют о нецелесообразности резкого изменения эволюционно сложившегося соотношения между симбиотрофным и автотрофным типами азотного питания, характерного для каждого вида растений. Возможность достижения оптимального баланса двух типов питания при симбиотической селекции показана на примере люцерны (11). Популяции, отобранные на повышенную активность азотфиксации в безазотном субстрате (песке), не проявляли эту активность при выращивании в почве. На основании данных о повышенной чувствительности симбиотического аппарата полученных форм люцерны к связанному азоту было предложено модифицировать схему селекции и проводить отбор не только на безазотных субстратах, но и в присутствии нитратов (1-8 мМ), после чего объединять растения в синтетические популяции (12, 61). При использовании этого подхода удалось создать формы люцерны, у которых максимальная эффективность симбиоза проявлялась на разных фонах азотных удобрений. Аналогичные формы получены и у клевера лугового: некоторые из популяций, отселектированных в безазотных условиях, сохраняли повышенную (на 40-60 %) активность азотфиксации в присутствии нитратов (13).

Очевидно, что сбалансированное соотношение различных типов азотного питания сопряжено с оптимизацией энергетического обеспечения растений, так как образование симбиозов требует значительных затрат энергии (до 20 % продуктов фотосинтеза в случае бобово-ризобиального симбиоза или арбускулярной микоризы). Однако эти затраты являются восполнимыми, так как при взаимодействии с симбиотическими микроорганизмами обычно наблюдается стимуляция фотосинтетической активности растений, которая часто снижается при внесении эквивалентных доз минеральных удобрений (30, 62). Тесная взаимосвязь между интенсивностью фотосинтеза и эффективностью симбиотической азотфиксации, выявленная у ряда бобовых, свидетельствует о возможности параллельного улучшения этих показателей селекционными методами (18). Одним из следствий изменения энергетического статуса растений, отобранных на активную азотфиксацию, может быть повышение скорости их развития. Так, при селекции многолетних форм люцерны был получен сорт Nitro, активно фиксирующий азот и являющийся однолетником (12). Высокой активностью азотфиксации обладают сорта люцерны пастбищного типа, отселектированные на увеличение скорости отрастания (63). Генотипы козлятника восточного с повышенной нитрогеназной активностью способны формировать значительное количество семян уже в первый год жизни (35).

Координированная селекция растений и микроорганизмов

Эффективность любой растительно-микробной системы зависит от генотипов обоих партнеров, поэтому необходимы координированные исследования растений и микроорганизмов. Для организации этой работы важно знать, каковы относительные генотипические вклады партнеров в определение эффективности симбиоза. Общим подходом к решению этой задачи является двухфакторный дисперсионный анализ эффективности симбиоза, образуемого различными генотипами растений и микроорганизмов. Этот подход позволяет разделить общее варьирование симбиотической активности на четыре составляющие, которые соответствуют аддитивным (неспецифическим) действиям генов растений и штаммов бактерий, их неаддитивному (специфическому) взаимодействию, а также влиянию «неконтролируемых» (случайных) факторов (18).

Анализ различных бобово-ризобиальных систем показал, что вклад генотипов партнеров в варьирование показателей симбиотической активности зависит от вида растений, изучаемого признака, а также условий опыта. Так, нитрогеназная активность клубеньков приблизительно в равной степени контролируется генотипами партнеров, тогда как эффективность симбиоза зависит главным образом от генотипа растений (23). Наиболее изменчивым фактором оказалось неаддитивное сорто-штаммовое взаимодействие, которое в одних случаях обусловливало более 70 % варьирования симбиотической активности (64), а в других -- не проявлялось вообще (65, 66). При этом была выявлена важная закономерность: аддитивное действие генов растений или бактерий не коррелирует с общей эффективностью симбиоза, тогда как в случае неаддитивного взаимодействия эта корреляция наблюдается при сравнении различных бобовых культур или показателей активности симбиоза, а также оценке действия на азотфиксацию почвенных условий (табл. 3).

3. Оценка взаимосвязи между симбиотической эффективностью и вкладом партнеров в общее варьирование признаков при инокуляции бобовых растений ризобиями

Полученные данные подтверждают высказанную ранее гипотезу о том, что наиболее эффективный симбиоз формируется в тех случаях, когда в максимальной степени реализуется специфичность взаимодействия генотипов растений и штаммов бактерий (76). Очевидно, что высокая эффективность симбиотической азотфиксации может быть достигнута посредством создания комплементарных сочетаний генотипов партнеров, для чего и должна проводиться их координированная селекция. Такая селекция необходима и в системах ассоциативного симбиоза, эффективность которых существенно зависит от взаимодействия растительных и бактериальных генотипов (77).

Необходимо отметить, что в различных опытах высокая эффективность симбиоза коррелировала с низким уровнем ее «неконтролируемого» варьирования (см. табл. 3). Источником этого варьирования может служить как недостаточная выравненность условий в разных повторностях (ошибка опыта), так и генетическая изменчивость индивидуальных растений по признакам симбиоза. О важной роли второго фактора свидетельствует то, что у растений люцерны наибольший вклад «неконтролируемых» факторов (50-70 % от общего варьирования эффективности симбиоза) был выявлен в микровегетационных опытах, которые проводили в строго контролируемых и благоприятных для симбиоза условиях, однако при этом в каждой повторности испытывали единичные растения, что создавало предпосылки для максимального проявления внутрисортового полиморфизма (67, 78). В модельном опыте с пажитником греческим нами установлено, что при высоком полиморфизме растений невозможно подобрать штаммы ризобий, инокуляция которыми обеспечивала бы общее повышение продуктивности популяции, хотя при снижении изменчивости растений такой подбор не вызывает затруднений (23).

Вышеизложенное позволяет предположить, что не только сорта бобовых, но и индивидуальные растения внутри каждого сорта полиморфны по специфичности, проявляемой по отношению к бактериям. Действительно, у клевера лугового эмпирически выявляемая структура сортовых популяций зависит от штамма ризобий, использованного для инокуляции растений (47, 79). Следовательно, координированная селекция партнеров возможна лишь при достаточной выравненноcти растительных популяций, на фоне которой могут быть выявлены бактериальные штаммы, генетически комплементарные всем инокулируемым растениям (или хотя бы большинству из них).

Заключение

Симбиотическая селекция, направленная на использование потенциала микробно-растительных взаимодействий, является одним из важнейших условий создания систем экологически сбалансированного земледелия. Традиционно эти взаимодействия регулировали посредством отбора из природной среды обитания, а затем и направленного конструирования симбиотических микроорганизмов (52, 80-82). Проблема селекции растений по признакам симбиоза существует уже достаточно давно, однако эти признаки до сих пор остаются для селекционеров terra incognita (20, 49). Активное исследование генетических, физиологических, молекулярных и экологических механизмов микробно-растительных взаимодействий создало предпосылки для развития принципиально новых селекционных подходов, направленных на создание сортов, способных формировать высокую продуктивность за счет использования симбиотического потенциала. Накопленные данные позволяют нам сформулировать ряд принципов симбиотической селекции.

Во-первых, это вовлечение в селекционный процесс дикорастущих и малоокультуренных форм растений, которые сохранили эволюционно обусловленную способность адаптироваться к условиям среды в результате кооперации с микроорганизмами. Восстановление и преумножение симбиотического потенциала растений, в значительной степени утраченного в ходе сельскохозяйственной деятельности человека, -- одна из актуальных задач селекции. Во-вторых, это координированная селекция растений и микроорганизмов, направленная на создание комплементарных сочетаний их генотипов. Исходя из вавиловского представления о селекции как об эволюции, направляемой человеком (83), мы должны разработать методологию селекции, которая бы являлась аналогом естественного процесса коэволюции растений и микроорганизмов, приводящей к взаимной адаптации их генетических систем (84).

Не вызывает сомнений, что будущее симбиотической селекции в значительной степени связано с использованием молекулярных методов, которые активно применяют для анализа тонких механизмов микробно-растительных взаимодействий. Без выяснения организации и функций симбиотических генов растений и бактерий нельзя говорить о направленном повышении эффективности их взаимодействия и тем более о конструировании новых симбиозов. Оптимизация симбиотических систем требует создания высокоспецифичных систем узнавания, а также совместимости микросимбионтов с защитными и метаболическими системами растений, в первую очередь с системами снабжения энергией.

Для решения комплекса задач, связанных с организацией симбиотической селекции, необходимы междисциплинарные исследования, в которых должны участвовать специалисты разных профилей -- сообщества ученых, владеющих знаниями и методами в смежных областях. Примером такого сообщества служит Международное общество молекулярных микробно-растительных взаимодействий -- International Society of Molecular Plant-Microbe Interactions (IS-MPMI), 11-й Конгресс которого (июль 2003 года, Санкт-Петербург) будет посвящен проблемам молекулярно-генетического анализа и направленного улучшения симбиотических систем.

ЛИТЕРАТУРА

Т и м и р я з е в К.А. Физиология растений как основа рационального земледелия. В кн.: К.А. Тимирязев. Земледелие и физиология растений. М., 1957: 11-62.

Л а р х е р В. Экология растений. М., 1978.

Б и г о н М., Х а р п е р Дж., Т а у н с е н д К. Экология. Особи, популяции и сообщества. М., 1989, 1: 619-660.

Т и х о н о в и ч И.А., П р о в о р о в Н.А. Пути использования адаптивного потенциала систем «растение--микроорганизм» для конструирования высокопродуктивных агрофитоценозов. С.-х. биол., 1993, 5: 36-46.

К о ж е м я к о в А.П., Т и х о н о в и ч И.А. Использование инокулянтов бобовых и биопрепаратов комплексного действия в сельском хозяйстве. Докл. РАСХН, 1998, 6: 7-10.

V a n c e С.P. Legume symbiotic nitrogen fixation: agronomic aspects. In: The Rhizobiaceae/ Eds. H.P. Spaink, A. Kondorosi, P.J..J. Hooykaas. Dordrecht, 1998: 509-530.

А ц ц и Дж. Сельскохозяйственная экология. М.-Л., 1932.

А ц ц и Дж. Сельскохозяйственная экология. М., 1959.

Ж у ч е н к о А.А. Адаптивный потенциал культурных растений (эколого-генетические основы). Кишинев, 1988.

Ж у ч е н к о А.А. Стратегия адаптивной интенсификации сельского хозяйства (концепция). Пущино, 1994.

B a r n e s D.K., H e i c h e l G.H., V a n c e C.P. e.a. A multiple-trait breeding program for improving the symbiosis for N₂ fixation between Medicago saliva L. and Rhizobium meliloti. Plant and Soil, 1984, 32: 303-314.

P h i l l i p s D.A., T e u b e r L.R. Plant genetics of symbiotic nitrogen fixation. In: Biological Nitrogen Fixation /Eds. G. Stacey, R.H. Burris, H.J. Evans. N.Y., London, 1992: 625-647.

N u t m a n P.S. Improving nitrogen fixation in legumes by plant breeding; the relevance of host selection experiments in red clover (Trifolium pratense L.) and subterranean clover (T. subterraneum L.). Plant and Soil, 1984, 82: 285-301.

Т и х о н о в и ч И.А., А л и с о в а С.М., Ч е т к о в а С.А. и др. Повышение эффективности азотфиксации путем отбора линий гороха по активности нитрогеназы. С.-х. биол., 1987, 2: 29-34.

B l i s s F. Breeding common bean for improved biological nitrogen fixation. Plant and Soil, 1993, 152: 71-79.

D o u g l a s A.E. Symbiotic Interactions. Oxford, N.Y., Toronto, 1994.

A l l e n O.N., A l l e n E.K. The Leguminosae. A source book of characteristics, uses and nodulation. Madison, 1981.

Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции /Под ред. И.А. Тихоновича, Н.А. Проворова. СПб, 1998.

П р о в о р о в Н.А. Соотношение симбиотрофного и автотрофного питания азотом у бобовых растений: генетико-селекционные аспекты. Физиол. раст., 1996, 43: 127-135.

G i b s o n A.H. Genetic variation in the effectiveness of nodulation of lucerne varieties. Austral. J. Agric. Res., 1962, 13: 388-399.

С а и м н а з а р о в Ю.Б. Взаимодействие штаммов Rhizobium meliloti с сортами люцерны среднеазиатского генцентра. Автореф. канд. дис. Л., 1991.

Т и х о н о в и ч И.А. Генетический контроль симбиотической азотфиксации у гороха. Автореф. докт. дис. Л., 1991.

P r o v o r o v N.A., S i m a r o v B.V. Genetic variation in alfalfa, sweet clover and fenugreek for the activity of symbiosis with Rhizobium meliloti. Plant Breeding, 1990, 105: 300-310.

P r o v o r o v N.A., S o s k o v Yu. D., L u t o v a L.A. e.a. Investigation of the fenugreek (Trigonella foenum graecum L.) genotypes for fresh weight, seed productivity, symbiotic activity, callus formation and accumulation of steroids. Euphytica, 1996, 88: 129-138.

G r a h a m P.H., R o s a s J.C. Growth and development of indeterminate bush and climbing cultivars of Phaseolus vulgaris L. inoculated with Rhizobium. J. Agr. Sci. Camb., 1977, 88: 503-508.

П р о в о р о в Н.А. Перспективы использования популяций некоторых видов семейства Fabaceae в селекции на повышение интенсивности симбиотической азотфиксации. Раст. ресурсы, 1996, 32: 124-134.

С м е т а н и н Н.И., Р о д ы н ю к И.С., С о к о л о в В.А. и др. Полиморфизм видов гороха по азотфиксирующей активности. С.-х. биол., 1987, 9: 40-43.

К р а в ч е н к о Л.В., А з а р о в а Т.С., Д о с т а н к о О.Ю. Влияние корневых экзометаболитов пшеницы с различной плоидностью на рост Azospirillum brasilense. Микробиол., 1993, 62: 863-868.

Я к о б и Л.М., К у к а л е в А.С., У ш а к о в К.В. и др. Полиморфизм форм гороха посевного по эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом Glomus sp. в условиях инокуляции ризобиями. С.-х. биол., 2000, 3: 94-102.

S m i t h S.E., R e a d D.J. Mycorrhizal symbiosis (second edition). San Diego, London, N.Y., Boston, Sydney, Tokyo, Toronto, 1997.

H a r d a r s o n G. Methods for enhancing symbiotic nitrogen fixation. Plant and Soil, 1993, 152: 1-17.

H a r d y R.W.F., B u r n s R.C., H o l s t e n R.D. Application of acetylene reduction assay for measurement of nitrogen fixation. Soil Biol. Biochem., 1973, 5: 47-81.

H a r d y R.W.F., H o l s t e n R.D., J a c k s o n E. e.a. C₂H₂-C₂H₄ assay for N₂ fixation: laboratory and field evaluation. Plant Physiol., 1968, 43: 9-13.

W i t t y J.F., M i n c h i n F.R. Measurement of nitrogen fixation by the acetylene reduction assay; myths and mysteries. In: Nitrogen Fixation by Legumes in Mediterranean Agriculture. Dordrecht, 1988: 331-344.

М е т л и ц к а я Е.Н., П р о в о р о в Н.А., С и м а р о в Б.В. и др. Создание популяций козлятника восточного, различающихся интенсивностью развития и продуктивностью, путем селекции растений по нитрогеназной активности. Докл. РАСХН, 1995, 6: 7-9.

Биологическая фиксация азота /Под ред. В.К Шумного, К.К. Сидорова. Новосибирск, 1991.

К в а с о в а Э.В., П р о в о р о в Н.А., С и м а р о в Б.В. и др. Варьирование симбиотических признаков люцерны при инбридинге. С.-х. биол., 1994, 5: 64-68.

K a p u l n i k J., J o s e p h C.M., P h i l l i p s D.A. Flavone limitation to root nodulation and symbiotic nitrogen fixation in alfalfa. Plant Physiol., 1987, 84: 1193-1196.

H e r n a n d e z G., R a m i r e z M., S a u r e z R. Root-exuded nod-gene inducing signals limit the nodulation capacity of different alfalfa varieties with Rhizobium meliloti. Plant Cell Reports, 1995, 14: 626-629.

Ш т а р к О.Ю. Влияние корневых экзометаболитов пшеницы на антагонистические свойства ризобактерий по отношению к фитопатогенным грибам. Автореф. канд. дис. СПб, 2001.

К р а в ч е н к о Л.В. Роль корневых экзометаболитов в интеграции микроорганизмов с растениями. Автореф. докт. дис. М., 2000.

П р о в о р о в Н.А., К и р н о с о в М.М., Г р у ш и н А.А. и др. Действие инокуляции Rhizobium meliloti на урожайность и биохимические показатели люцерны. Физиол. и биохим. культ. раст., 1994, 26: 281-288.

Т а н р и в е р д и е в Т.А., П р о в о р о в Н.А., Л о г и н о в Ю.П. и др. Биохимический состав люцерны при образовании эффективного симбиоза с Rhizobium meliloti. Физиол. и биохим. культ. раст., 1994, 26: 170-174.

P r o v o r o v N.A., T i k h o n o v i c h I.A. Genetic resources for improving nitrogen fixation in legume-rhizobia symbiosis. Genetic Resources and Crop Evolution, 2003, 50, 1: 89-99.

T a n G.Y. Genetic variation for acetylene reduction rate and other characters in alfalfa. Crop Sci., 1981, 21: 485-488.

N a u m k i n a Т., Y a k o v l e v V., T i t e n o k Т. e.a. Pea breeding to improve effectiveness of symbiotic nitrogen fixation. In: New approaches and techniques in breeding sustainable fodder crops and amenity grasses (Proc. 22 EUCARPIA Fodder Crops and Amenity Grasses Section Meeting, October 17-21, 1999, St.-Petersburg, Russia) /Eds. N.A. Provorov, I.A. Tikhonovich, F. Veronesi. St.-Petersburg, 2000: 254-256.

N u t m a n P.S. Symbiotic effectiveness in nodulated red clover. 3. Further studies of inheritance of ineffectiveness in the host. Heredity, 1957, 11: 157-173.

P e r e i r a P.A.A., M i r a n d a B.D., A t t e w e l l J.R. e.a. Selection for increased nodule number in common bean (Phaseolus vulgaris L.). Plant and Soil, 1993, 148: 203-209.

Ш у л ы н д и н А.Ф. Повышение эффективности соевого нитрагина путем селекции сортов сои с высокой восприимчивостью к клубеньковым бактериям. Микробиол., 1953, 22: 288-293.

N u t m a n P.S. Varietal differences in the nodulation of subterranean clover. Austral. J. Agric. Res., 1967, 18: 381-425.

М а к а ш о в а Р.Х., А л и с о в а С.М., А л е к с е е в а Е.Г. и др.. Оценка симбиотических свойств гороха. Тр. по прикл. бот., ген. и сел., 1985, 91: 7-14.

Д о р о с и н с к и й Л.М. Клубеньковые бактерии и нитрагин. Л., 1970.

О н и щ у к О.П., С и м а р о в Б.В. Гены, контролирующие нодуляционную конкурентоспособность клубеньковых бактерий. Генетика, 1996, 32: 1157-1166.

H a r d a r s o n G., J o n e s D.G. The inheritance for preference of strains of Rhizobium trifolii by white clover (Trifolium repens L.). Ann. App. Biol., 1979, 92: 329-333.

T i k h o n o v i c h I.A., K o z h e m y a k o v A.P., P r o v o r o v N.A. e.a Genetic potential of plants for improving the beneficial microbe interactions. In: Biological Fixation of Nitrogen for Ecology and Sustainable Agriculture /Eds. A. Legocki e.a. NATO ASI Series. Series G: Ecological Sciences. Berlin, Heidelberg, 1997, 39: 191-194.

N a u m k i n a T. Improvement of nitrogen fixation in peas (Pisum sativum L.). In: Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications /Eds. I.A. Tikhonovich e.a. Dordrecht, 1995: 714.