Создание внутригенного днк-маркера гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-b и его использование в практической селекции

Размещено на http://www.allbest.ru/

Статья по теме:

Создание внутригенного ДНК-маркера гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-b и его использование в практической селекции

И.И. Супрун, Е.Т. Ильницкая, Ж.М. Мухина

На основе анализа полиморфизма нуклеотидных последовательностей аллелей гена устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-b осуществляли дизайн и подбор комбинации праймеров для проведения полимеразной цепной реакции и получения продуктов, специфичных доминантному и рецессивному аллелям гена. Созданную ДНК-маркерную систему идентификации аллелей гена Pi-b применяли в программах маркерной селекции по интрогрессии гена Pi-b в отечественную генплазму риса с использованием районированных сортов Хазар и Янтарь и донора гена -- сорта BL1. Получено 18 линий BC1 в комбинации Янтарь Ѕ BL1 и 14 линий в комбинации Хазар Ѕ BL1.

Ключевые слова: внутригенный кодоминантный ДНК-маркер, ген Pi-b, устойчивость к пирикуляриозу, интрогрессия гена, возвратные скрещивания, маркерная селекция.

Пирикуляриоз, возбудителем которого является несовершенный гриб Magnaporthe grisea, -- одно из наиболее вредоносных заболеваний риса. В Краснодарском крае потери урожая риса от пирикуляриоза в среднем составляют 25-30 %, а выход крупы из зерна зараженных растений уменьшается на 23-25 % (1), что определяет значимость селекции на устойчивость к этому заболеванию. Однако интрогрессия генов устойчивости в реципиентную генплазму классическими селекционными методами -- обычно длительная, трудоемкая и дорогостоящая процедура, требующая постоянного фитопатологического тестирования. При работе с несколькими генами задача усложняется, поскольку проявления признаков устойчивости фенотипически перекрываются.

С развитием методов ДНК-маркирования генов появилась технология так называемой маркерной селекции, позволяющей идентифицировать и отбирать устойчивые генотипы на основании анализа ДНК, минуя фенотипическую оценку. Внутригенные ДНК-маркеры -- наиболее ценные для программ по маркерной селекции, поскольку сонаследуются с геном, но их создание возможно лишь для генов с установленной нуклеотидной последовательностью.

Ген устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-b, расположенный на дистальном конце длинного плеча хромосомы 2 (2), входит в число секвенированных. Изначально его картировали с использованием RFLP-маркерной системы (restrict fragments length polymorphism -- RFLP). Затем выполнили тонкое картирование, клонирование и секвенирование (3, 4), а также выявили гомолог гена с неизвестной функцией, удаленный от него на расстояние примерно 80 тыс. п.н. (4, 5). По результатам анализа аминокислотной последовательности продукта гена Pi-b определено, что он относится к наиболее распространенному классу генов устойчивости растений -- NBS-LRR, кодирующих белки, в структуру которых входит нуклеотидсвязывающий домен (nucleotide binding site -- NBS) и рецепторная область, богатая лейцином (leucinе rich repeat -- LRR) (4).

Основной целью нашей работы было создание внутригенного кодоминантного ДНК-маркера для Pi-b и его использование для интрогрессии этого гена в отечественную генплазму риса.

Методика. При дизайне праймеров использовали последовательности доминантного аллеля гена устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-b и его гомолога (соответственно № АВ013448 и № АВ013450 в базе данных www.ncbi.nih.gov). В качестве рецессивного аллеля был взят соответствующий доминантному аллелю участок генома сорта Nipponbare (№ AP004048), не несущего доминантный аллель этого гена. У указанного сорта геном секвенирован под эгидой международного проекта IRGSP (International Rice Genome Sequencing Project) и доступен в международных базах данных www.ncbi.nih.gov и www.gramene.org (6). Поиск области генома сорта Nipponbare, соответствующей рецессивному аллелю гена Pi-b, проводили в системе поиска BLAST базы данных www.gramene.org с использованием нуклеотидной последовательности № АВ013448 в качестве запроса поиска. Сиквенсы гена Pi-b, его гомолога и рецессивного аллеля сравнивали с помощью алгоритма «multiple аlignment» в программе CLUSTALW (7). Дизайн праймеров осуществляли в программе Primer3. Эффективность праймеров определяли с использованием ДНК растений сортов Tohoku IL9 и BL1 с доминантным аллелем Pi-b, а также Sasanishiki, Янтарь и других сортов, несущих соответствующий рецессивный аллель.

ДНК экстрагировали методом СТАВ (8). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по следующей программе: начальная денатурация -- 1 мин при 96 °С; 35 циклов: денатурация -- 15 с при 94 °С, отжиг -- 30 с при температурах 55, 60 и 65 °С (в разных вариантах), элонгация -- 2 мин при 72 °С; заключительная элонгация -- 5 мин при 72 °С. Состав реакционной смеси: 0,5 мкл буфера 10ЅExTaq Polymerase, 1 мкл 100 % глицерола, 0,1 мкл 25 мМ MgCl2, 0,5 мкл 2 мМ dNTPs, 0,02 мкл ExTaq ДНК полимеразы (5 ИЕ/мкл), 20 мкМ прямого и обратных праймеров, 10 нг ДНК в общем объеме 5 мкл. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 2 % агарозном геле на основе 0,5ЅТрис-боратного буфера (0,045 М Трис-HCl, 0,045 М борной кислоты, 1 мМ ЭДТА, рН 8,2), визуализировали бромистым этидием.

В работе по интрогрессии гена Pi-b в отечественную генплазму риса в качестве донора гена использовали сорт BL1, в качестве реципиентов -- сорта Янтарь и Хазар селекции Всероссийского НИИ риса, районированные в Краснодарском крае.

Для подтверждения статистической достоверности данных применялся метод ч-квадрат (9).

Результаты. При дизайне праймерных пар на полиморфные участки гена Pi-b, выявленные на основании анализа нуклеотидных последовательностей его аллелей, главным требованием было обеспечение синтеза продуктов с разницей в размере между доминантным и рецессивным аллелями не менее 100 п.н. Это необходимо для надежной идентификации аллелей гена Pi-b при электрофорезе в агарозном геле, что технически проще по сравнению с использованием полиакриламидного геля. Поскольку функция гомолога гена Pi-b не установлена (4) и в настоящее время его маркирование не представляет интереса для практической селекции, при дизайне праймеров исключали возможность синтеза продуктов ПЦР с его последовательности.

Дизайн и подбор комбинации из трех праймеров выполняли таким образом, чтобы прямой праймер отжигался на гомологичный участок доминантного и рецессивного аллеля гена, а два обратных -- на разные участки, что обеспечивало синтез продукта ПЦР специфичного размера для каждого аллеля. Всего отобрали два прямых и четыре обратных праймера (табл. 1). Из трех использованных температур отжига амплификация проходила наиболее эффективно при 60 °С, при 55 °С регистрировали неспецифически амплифицированные фрагменты, а при 65 °С -- отсутствие продуктов ПЦР по некоторым комбинациям праймеров.

1. Праймеры, входящие в состав маркерной системы гена устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-b

ген рис пирикуляриоз праймер

По результатам эле-ктрофоретического разделения продуктов ПЦР выделили следующие комбинации прямых и обратных праймеров: № 4 + № 5 + № 6 (рис., А) и № 4 + № 2 + № 3 (см. табл. 1). Указанные комбинации позволяли четко идентифицировать рецессивный и доминантный аллели гена Pi-b благодаря большой разнице в размере их ПЦР-продуктов (табл. 2), что подтверждало эффективность разработанной ДНК-маркерной системы.

Рис. 1

Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов, полученных при выявлении гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-b у сортов и образцов риса с использованием комбинации праймеров № 4 + № 5 + № 6: А -- тестирование маркерной системы, Б -- идентификация аллелей гена Pi-b в популяциях F2; 1 -- маркер молекулярной массы; 2 и 12 -- соответственно сорта Tohoku IL9 и BL1 с доминантным аллелем гена; 3 и 13 -- соответственно сорта Sasanishiki и Янтарь с рецессивным аллелем гена; 4-11 -- коллекционные образцы с рецессивным аллелем; 14, 17 и 19 -- образцы F2, гетерозиготные по локусу гена Pi-b; 15, 16, 18 и 21 -- образцы F2, гомозиготные по доминантному аллелю; 20 -- образец F2, гомозиготный по рецессивному аллелю.

Оценивая эффективность использования созданной маркерной системы для определения состояния гетерозиготности, в ПЦР-смесь вносили в качестве матрицы одновременно ДНК сортов, гомозиготных по доминантному и рецессивному аллелю гена Pi-b. Наиболее эффективной оказалась комбинация пра-ймеров № 4 + № 5 + № 6: в электрофоретических спектрах продуктов амплификации присутствовали оба типа ДНК-фрагментов, четко разделяемые по молекулярной массе.

В программе по интрогрессии гена Pi-b в отечественную генплазму визуализацию переноса аллеля проводили с использованием созданной ДНК-маркерной системы, эффективность которой была апробирована на начальном этапе исследования (см. рис., А, Б). В выборке из 135 растений F2 в комбинации сорт Янтарь Ѕ сорт BL1 по результатам маркерного анализа получили следующее расщепление: 29 растений несли доминантный аллель Pi-b в гомозиготном состоянии, 75 -- в гетерозиготном и 31 растение было гомозиготным по рецессивному аллелю. Это соответствует ожидаемому расщеплению 1:2:1 и подтверждает кодоминантность ДНК-маркера, а также его сонаследование с геном Pi-b. Рассчитанное значение ч2 = 1,74 (0,50 > P > 0,20) указывает на соответствие полученных и ожидаемых частот расщепления, что свидетельствует о достоверности данных (9).

Растения F2 с геном Pi-b в гомозиготном состоянии были включены в возвратные скрещивания в качестве отцовских форм с растениями рекуррентных сортов Хазар и Янтарь. В комбинациях сортов Янтарь Ѕ BL1 и Хазар Ѕ BL1 было получено соответственно 18 и 14 линий BC1. Последующее беккроссирование позволит создать линии риса с комплексом ценных признаков районированного сорта и эффективным геном устойчивости к пирикуляриозу.

2. Комбинации праймеров и размер ПЦР-продукта для рецессивного и доминантного аллеля гена устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-b

Таким образом, создан внутригенный кодоминантный ДНК-маркер гена устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-b. С использованием разработанной ДНК-маркерной системы получены беккроссные линии, несущие этот ген, на основе отечественных сортов риса Янтарь и Хазар. Выполненная работа также демонстрирует возможности применения ДНК-маркерных технологий в практической селекции.

Литература

1. Система рисоводства Краснодарского края: рекомендации /Под ред. Е.М. Харитонова. Краснодар, 2005.

2. Miyamoto M., Ando I., Rybka K. e.a. High resolution mapping of the indica-derived gene Pi-b. Mol. Plant-Microbe Interact., 1996, 9: 6-13.

3. Monna L., Miyao A., Zhong H.S. e.a. Saturation mapping with subclones of YACs: DNA marker production targeting the rice blast disease resistance gene, Pi-b. Theor. Appl. Gen., 1997, 94: 170-176.

4. Wang Z. X., Yano M., Yamanouchi U. e.a. The Pi-b gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes. Plant J., 1999, 19: 55-64.

5. Tsunoda Y., Jwa N.S., Akiyama K. e.a. Cloning of the rice blast resistance gene Pi-b. Adv. Rice Blast Res., 2000, 1: 9-16.

6. International Rice Genome Sequencing Project. The map-based sequence of the rice genome. Nature, 2005, 436(11): 793-800.

7. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment trough sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl. Acids Res., 1994, 22: 4673-4680.

8. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucl. Acids Res., 1980, 10: 4321-4325.

9. Лобашев М.Е. Генетика. Л., 1969.

Summary

Development of intragene DNA-marker for rice blast resistance gene Pi-b and its using in practical breeding

I.I. Suprun, E.T. Ilnitskaya, Zh.M. Mukhina

Intragene codominant DNA-marker for rice blast resistant gene Pi-b was developed. Preliminary test proved its efficiency for gene's allele's identification. Using this marker, program for Pi-b gene introgression into Russian rice varieties Khazar and Jantar now is carrying out. Backcrossing lines BC1 with Pi-b gene have been obtained.

Размещено на Allbest.ru