Модифікація методики підготовки зразків меду для визначення залишкових кількостей еритроміцину

Размещено на http://www.allbest.ru/

Модифікація методики підготовки зразків меду для визначення залишкових кількостей еритроміцину

Д.В. Янович

З.С. Засадна

С.М. Кіслова

О.М. Паздерська

Н.А. Майба

Анотації

Посилення вимог щодо визначення залишкових кількостей антибактерійних препаратів у зразках меду, які експортує Україна, сприяє розширенню лінійки аналітичних методів їх контролю. Для визначення вмісту еритроміцину у зразках меду на рівні вимог, наданих у контрактах фірм-експортерів, використано тест-набір для конкурентного імуноферментного аналізу фірми ЄвроПроксіма (Нідерланди). У процесі верифікації методики було виявлено ряд недоліків, пов'язаних зі способом підготовки зразків меду, рекомендованою виробником тест-набору. Авторами запропоновано та випробувано три інші способи екстрагування аналіту зі зразків та приведено результати їх порівняння.

Ключові слова: ЕРИТРОМІЦИН, МЕД, ЗАЛИШКОВІ КІЛЬКОСТІ, ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ.

THE MODIFICATION OF THE METHOD OF HONEY SAMPLES PREPARATION AT THE DETERMINATION OF ERYTHROMYCIN RESIDUAL AMOUNTS

B. Yanovych, Z. Zasadna, S. Kislova, O. Pazderska, N. Maiba

State Scientific-Research Control Institute of Veterinary Medicinal Products and Feed Additives,

11, Donetska str., Lviv, 79019, Ukraine

The enhancement of requirements for the determination of residual amounts of antibacterial drugs in Ukrainian exported honey samples, promotes to expanding the range of analytical methods for their control. For the determination of erythromycin content in honey samples at the concentration level required by contracts of exporting companies, a test kit for competitive immuno-enzymatic analysis of EuroProxima (the Netherlands) was used. During the verification of the method, a number of drawbacks related to the method of honey samples preparation, recommended by the manufacturer of the test kit, were identified. The authors have proposed and tested three other methods for analyte extraction from honey samples and presented the results of their comparison.

Keywords: ERYTHROMYCIN, HONEY, RESIDUES, IMMUNO-ENZYMATIC ANALYSIS.

МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДИКИ ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦОВ МЕДА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЭРИТРОМИЦИНА

Д.В. Янович, З.С. Засадная, С.М. Кислова, О.М. Паздерская, Н.А. Майба

Государственный научно-исследовательский контрольный институт ветеринарных препаратов и кормовых добавоккормових добавок,

Усиление требований к определению остаточных количеств антибактериальных препаратов в образцах меда, которые экспортирует Украина, приводит к расширению линейки аналитических методов их контроля. Для определения содержания эритромицина в образцах меда, на уровне требований предоставленных в контрактах фирм-заказчиков, использовано тест-набор для конкурентного иммуноферментного метода фирмы ЕвроПроксима (Голландия). В процессе верификации методики было выявлено ряд неточностей, связанных с процедурой подготовки образцов меда, рекомендованной изготовителем тест-набора. Авторами предложено и испытано три других способа экстрагирования аналита из образцов, приведены результаты сравнения предложенных методик.

Ключевые слова: ЭРИТРОМИЦИН, МЕД, ОСТАТОЧНЫЕ КОЛИЧЕСТВА, ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ.

Еритроміцин - антибіотик з групи макролідів для перорального, парентерального та місцевого застосування. Цей антибіотик володіє широким спектром антибактеріальної дії, порушуючи синтез білка в бактеріальних клітинах. До антибіотика чутливі такі збудники: стафілококи, стрептококи, лістерії, легіонелли, Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae, нейсерії, мікоплазми, хламідії, рикетсії, Entaemoeba hystolitica, бліда спірохета. Нечутливими до еритроміцину є Escherichia coli, шіґелли, сальмонелли та туберкульозна паличка.

Еритроміцин широко використовують для лікування нозематозу бджіл. Це хвороба полімікробної етіології, основними збудниками, якої є: Melisococcus plutonias (S. pluton), Paenibacillus larvae, Enterococcus faecalis (S. apis), Brevibacillus laterosporus (В. orpheus). Крім того, у загиблих личинок вилучають Bacterium eurydice та інші умовно патогенні мікроорганізми. Захворювання поширене в усіх країнах Європи, у яких розвинене бджільництво, завдаючи значної економічної шкоди. Оскільки бджолині сім'ї, що хворіли, дають товарного меду на 20 - 80 % менше, ніж здорові, кількість воскової сировини зменшується вдвічі, а численність сімей бджіл (рої, відводки) - зменшується в 3 - 7 рази, розплоду - на 34 - 45 % [1-3].

Однак, враховуючи дієтичні та лікувальні властивості меду, нормативними документами ЄС не передбачено МДР вмісту антимікробних препаратів у ньому. Директивою ЄС 2377/90 МДР встановлено тільки для зареєстрованих субстанцій ветеринарних препаратів, які пройшли реєстрацію EMEA (European Agency for the Evaluation of Medicinal Products - Європейська агенція з оцінки медичних препаратів). Застосування таких субстанцій, як тетрацикліни, стрептоміцин, сульфаніламіди, тилозин, еритроміцин передбачено тільки для цільових видів тварин, для яких при реєстрації було обумовлено їх застосування, та встановлені, відповідно, МДР на залишки діючої субстанції або її метаболіти у тваринницькій продукції. Для інших тварин, зокрема бджіл, для яких вищезгадані антимікробні речовини є незареєстрованими субстанціями, не існує встановлених МДР у продуктах бджільництва. Це, в свою чергу, змінює вимоги до чутливості методів контролю їх залишків в меді з метою запобігання несанкціонованому використанню антимікробних препаратів у бджільництві.

Сучасна стратегія застосування аналітичних методів для контролю за вмістом залишків ветеринарних препаратів та забруднюючих речовин, базується на застосуванні швидких та точних скринінгових методів для відсіювання з великої кількості зразків лише тих, що не відповідають вимогам [4]. мед антибактерійний аналіт

Тому, у зв'язку з розширенням вимог щодо наявності залишків антибіотиків у експортних партіях меду з України, метою нашої роботи було дослідити можливість використання тест-набору Еритроміцин фірми ЄвроПроксіма для проведення кількісного аналізу на вміст еритроміцину у зразках меду на рівні 5,0 мкг/кг, згідно з Національним планом моніторингу продуктів харчування України на 2017 р.

Матеріали і методи. У роботі використано стандартний зразок Erytromycin A dehydrate (Sigma-Aldrich, Cas 59319-72-1). Згідно із сертифікатом якості (93 %) проведено перерахунок і приготовано розчин 1 мг/мл у метанолі (99,9 %, HPLC, Lab Scan). В подальшому проведено розведення розчину стандартного зразка високоочищеною водою до концентрації 100 мкг/л, який і було використано для навантаження контрольних (чистих) зразків у концентрації 0,5; 1,0; 5,0 мкг/кг.

Для дослідження зразків меду на вміст залишків еритроміцину вибрано тест-набір для конкурентного імуноферментного аналізу Еритроміцин (Art. No.: 5151ERY) фірми ЄвроПроксіма. Згідно з даними, наданими виробником тест-набору, межа визначення для зразків меду становить 10,0 мкг/кг. Перехресна реакція для еритроміцину складає 100 %, для еритроміцин етилсукцинату - 12 %, для тилозину та спіраміцину - 0 % [5].

Результати й обговорення. Дослідження зразків меду проводились за методикою фірми-виробника за критерієм "додано-отримано". За відсутності контрольних референсних матриць, попередньо досліджено 10 зразків меду, з яких було відібрано зразки із найнижчим значенням матричного впливу. Вибрані зразки меду навантажували підготовленим стандартним розчином (концентрація 100 мкг/л) з розрахунку на вміст цільового аналіту на рівні значення, передбаченого у контрактах фірм-замовників: 1,0 та 5,0 мкг/кг. Після врівноваження навантажених зразків за кімнатної температури, аналіт екстрагували високоочищеною водою, очищали від компонентів матриці методом центрифугування та зменшували вплив матриці на остаточний результат дослідження розведенням зразків буфером, що надається в тест-наборі [5]. Підготовлені зразки досліджували відповідно до інструкції фірми виробника тест-набору. Результати представлені в таблиці 1.

Таблиця 1

Результати дослідження контрольних і навантажених стандартним розчином еритроміцину зразків меду

Як видно з представлених даних, досліджувані чисті зразки проявляли достатньо високий матричний вплив: 8,83 та 9,51 мкг/кг. Додаткове внесення стандартного розчину аналіту з розрахунку 1,0 та 5,0 мкг/кг, призвело до отримання концентраційних величин, що не відповідали кількості внесеного стандартного розчину еритроміцину. Отримані результати навели на думку про необхідність зміни способу підготовки зразків для кращого очищення аналіту від компонентів досліджуваної матриці, які екстрагуються разом із ним.

З метою зменшення впливу матриці та підвищення ступеня екстрагування аналіту зі складної матриці (у нашому випадку меду) необхідно вибрати оптимальний розчинник. Так, за Європейською Фармакопеєю, субстанція еритроміцину розчинна у водних розчинах, легко розчинна у спирті, ацетоні, хлороформі, ацетонітрилі, етилацетаті та помірно розчинна у ефірі, дихлоридетилені, амілацетаті. Розчин еритроміцину стабільний за рН 8 - 10,5 та руйнується за рН менше 4 [6].

Із урахуванням вище перелічених властивостей аналіту та за результатами пошуку в літературних джерелах, вибрано три способи підготовки зразків. Оскільки еритроміцин, як і тилозин, належить до групи макролідів та має, відповідно, подібні властивості, для проведення подальших досліджень запропоновано використати методику підготовки зразків меду для визначення залишків тилозин тартрату. Еритроміцин легко розчиняється у воді, тому екстрагування його з матриці проводили фосфатним буфером (рН 7.5) з подальшою очисткою та концентруванням твердофазним екстрагуванням на колонках Oasis HLB 3cc (за інструкцією до тест-набору Тилозин фірми ЄвроПроксіма), висушуванням та відновленням сухого залишку у 10 % розчині метанолу (Методика 1) [7]. Крім того, випробувано методику екстрагування аналіту натрій сукцинатним буфером (рН 7,3) із осадженням зайвих компонентів меду методом центрифугування (Методика 2) [8, 9]. Третьою була методика екстрагування аналіту зі зразків меду 0,1 М натрій карбонатним буфером, рН 8 та етилацетатом, з наступним концентруванням аналіту, шляхом висушування та відновленням сухого залишку у буфері для розведення зразків, що надається в наборі (Методика 3) [10, 11]. Результати досліджень представлені в таблиці 2.

Таблиця 2

Порівняльні дослідження запропонованих методик пробопідготовки для визначення еритроміцину у зразках меду

Примітка: Оригінальна - методика підготовки зразків із тест-набору Еритроміцин (фірми ЄвроПроксіма);

Методика 1* - методика підготовки зразків із тест-набору Тилозин (фірми ЄвроПроксіма);

Методика 2** - методика підготовки зразків із екстрагуванням аналіту натрій сукцинатним буфером;

Методика 3*** - методика підготовки зразків із екстрагуванням аналіту етилацетатом.

Як видно з отриманих результатів, використання методики 1 підготовки зразків (очистка екстракту на колонках) та методики 3 (екстрагування етилацетатом) дають найкращі результати. Очистка дозволяє повністю позбутись впливу матриці на результати імуноферментного аналізу, не даючи при цьому хибно-позитивного результату. За аналізування зразків, підготованих методикою 1, навантажених стандартним розчином в концентрації 0,5; 1,0; 5,0 мкг/кг, отримано наступний відсоток витягу: 90; 100; 155, відповідно. За дослідження зразків, підготованих методикою 3, за тієї ж концентрації навантаження отримано наступний відсоток витягу: 90,6; 140; 107,8, відповідно.

За дослідження навантажених зразків у концентрації 0,5; 1,0; 5,0 мкг/кг, підготованих методикою 2 (екстрагування натрій сукцинатним буфером) відсоток витягу становив: 0; 31; 25, відповідно. Для порівняння, проведено підготовку зразків за оригінальної методикою з інструкції фірми-виробника. Так, для зразка навантаженого стандартним розчином в концентрації 1,0 та 5,0 мкг/кг отримано відсоток витягу аналіту: 2790 та 766, відповідно, що не дозволяє користуватись даною методикою підготовки зразків для оцінки залишкових кількостей еритроміцину у зразках меду.

За порівняння результатів, отриманих за підготовки зразків методиками 1 і 3, показано, що обидва способи дозволяють на належному рівні проводити кількісне визначення еритроміцину у зразках меду, без впливу матриці зразка на результати аналізу. Однак, впровадження етапу очистки екстракту на колонках не тільки підвищує вартість досліджень, але й значно подовжує час підготовки зразків, що, в свою чергу, негативно впливає на швидкість проведення скринінг-досліджень. Тому для подальшого аналізу вибрано метод екстрагування зразків етилацетатом у слабо лужному середовищі з двократним концентруванням аналіту шляхом випаровування органічної фази.

За застосування методики 3, підготовки зразків проведено моніторинг зразків меду, надісланих фірмою-експортером. У десяти досліджуваних зразків виявлено присутність залишкових кількостей еритроміцину в діапазоні від 1,0 до 5,5 мкг/кг. Оскільки, згідно з Національним планом моніторингу, мінімально допустимі норми вмісту еритроміцину для меду становить 5,0 мкг/кг, то перевищення вмісту еритроміцину було відмічено тільки у трьох зразках.

Висновки

Запропоновано простий метод очистки та концентрування аналіту, що дозволяє значно зменшити вплив матриці зразка на отримані результати, а відповідно, знижує рівень визначення аналіту з 10 мкг/кг - декларованого виробником тест-набору до 5 мкг/кг - згідно з Національним планом моніторингу.

Перспективи досліджень. Отримані результати досліджень передано фірмі- виробнику тест-набору для подальшого аналізування.

Література

1. Erythromycin residue in honey from the Southern Marmara region of Turkey / Nazmiye Gunes, Recep Cibik, Mesut Ertan Gunes et al. // J. Food Addit. Contam. - 2008 - 25 (11). - P. 1313-1317.

2. Occurrence of erythromycin and its degradation products residues in honey. Validation of an analytical method / Liuwei Zhao, Weirui Cao, Xiaofeng Xue et al. // J. Separation science. - 2017. - 40 (6). - P. 1353-1360.

3. Multiclass determination of 27 antibiotics in honey / Roberta Galarini, Giorgio Saluti, Danilo Giusepponi et al. // Food Control. - 2015. - V. 48. - P. 12-24.

4. Multi-screening approach to monitor and quantify 42 antibiotic residues in honey by liquid chromatography-tandem mass spectrometry / Yves-Alex Hammel, Rayane Mohamed, Eric Gremaud et al. // J. of Chromatography A. - 2008. - 1177. - P. 58-76.

5. Янович Д. Методичні вказівки по кількісному визначенню еритроміцинуу зразках печінки, креветок, меду, молока, яєць, риби та сечі тест-набором Еритроміцин (виробництво фірми EuroProxima, Нідерланди) / Д. Янович, З. Засадна // 2016. - 9 с.

6. O'NeilM. J. The Merck Index - An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. Whitehouse Station, NJ: Merck and Co., Inc., - 2006. - Р. 690.

7. Янович Д. Методичні вказівки по кількісному визначенню тилозинуу зразках тканин, меду, молока, яєць, сироватки крові, корму та сечі тест-набором Тилозин (виробництво фірми EuroProxima, Нідерланди) / Д. Янович, З. Засадна. 2016. - 9 с.

8. Analysis of erythromycin and oleandomycin residues in food by high-performance liquid chromatography with fluorometric detection / Edder P1, Coppex L, Cominoli A. et al. // Food Addit Contam. - 2002. - Mar; 19(3) - P. 232-240.

9. Antimicrobial Drug Residues in Milk and Meat: Causes, Concerns, Prevalence, Regulations, Tests, and Test Performance / J. M. Mitchell, M. W. Griffiths, S. A. McEwen et al. // Journal of Food Protection - 1998 - Vol. 61, No.6 - P. 742-756.

10. Development and validation of a multiclass method for the quantification of veterinary drug residues in honey and royal jelly by liquid chromatography-tandem mass spectrometry / YueJin, Jinzhen Zhan, Wen Zhao et al. // Food chemistry. - 2017. - 221(15 April). - P. 1298-1307.

11. Wang J. Determination of five macrolide antibiotic residues in honey by LC-ESI-MS and LC-ESI-MS/MS // J. Agric. Food Chem. - 2004. - V. 52. - P. 171-181.

Размещено на Allbest.ru