Размещено на http://www.allbest.ru/

1

Научный журнал КубГАУ, №158(04), 2020 год

Оценка исходного материала с целью создания гетерозисных гибридов томата для пленочных теплиц

06.01.05 - Селекция и семеноводство (сельскохозяйственные науки)

Гиш Руслан

Создание селекционного материала с заданными свойствами является ключевой проблемой, успешное решение которой стало возможном с появлением технологии генной инженерии. На ее основе проведена оценка исходного материала по выявлению образцов, пригодных к созданию гетерозисных гибридов, обладающих комплексом хозяйственно-ценных признаков, в том числе устойчивостью к вирусу скручивания листьев томата (TYLCV)

Ключевые слова: ЖЕЛТАЯ КУРЧАВОСТЬ ЛИСТЬЕВ ТОМАТА, МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА, БИОМЕТРИЯ

The creation of breeding material with desired properties is a principal problem, the successful solution of which is now possible with the introduction of genetic engineering technology. We have carried out an evaluation of the source material on its basis to identify samples suitable for creating heterotic hybrids with a set of economically valuable traits, including resistance to the tomato leaf curl virus (TYLCV)

Keywords: YELLOW CURLINESS OF TOMATO LEAVES, MOLECULAR GENETIC ASSESSMENT, BIOMETRY

Введение

Актуальной проблемой в селекции томата является создание селекционного материала с заданными свойствами. Создание такого материала до сих пор остается сложной и трудновыполнимой задачей. С одной стороны с появлением технологий генной инженерии стало возможным создание таких растений. Однако, несовершенство этих технологий и возможность генетической модификации только единичных признаков не всегда позволяет применять их на практике. С другой стороны классическими методами селекции создано огромное количество ценного селекционного материала. Применение и интеграция новых технологий молекулярно-генетической оценки этого материала в селекционный процесс позволит значительно сократить время создания генотипов с заданными свойствами. За последние два десятилетия использование молекулярно-генетических методов позволило исследовать физическую и функциональную организацию геномов многих сельскохозяйственных культур [4, 5, 6, 7]. Одним из основных понятий, объединяющих эти методы, является понятие «молекулярно-генетический маркер». Внедрение ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому. В настоящее время разработано большое количество молекулярно-генетических маркеров, которые основаны на различных классах последовательностей геномной ДНК. Они позволяют выявлять генетическое разнообразие на молекулярном уровне организации ДНК, что является базисом, на котором основаны все дальнейшие теоретические (филогения, изучение организации генома) и прикладные (картирование, маркирование генов, генотипирование) исследования [8, 9]. Отбор нужных селекционеру генотипов в расщепляющихся популяциях сопряжен с рядом проблем, главными из которых являются:

1] Для отбора генотипа по заданному признаку необходима большая расщепляющаяся популяция;

2] Необходимо дождаться нужного поколения [F5, F6];

3] Становится достаточно сложно проводить отбор в популяции по нужному признаку, если его проявление зависит от условий окружающей среды;

4]Необходимость ожидания поздних этапов онтогенеза растений, чтобы провести отбор по признаку;

5]Сложность проведения накопление генов, например устойчивости, так как не просто провести отбор генов в присутствии уже существующих. Решение отмеченных выше проблем возможноиспользованным близко сцепленных с признаком молекулярных маркеров, полученных различными методами. До недавнего времени в селекции сельскохозяйственных культур использовались только морфологические маркеры. Они могли проявляться на различных этапах развития растений, идентифицироваться визуально или в результате биохимических исследований. При этом проявление тех или иных признаков в значительно степени зависит от условий внешней среды. Традиционные методы селекции на устойчивость требуют создания инфекционных фонов и трудоемкую оценку каждого образца. Проведение таких работ связано со значительными затратами труда и времени. Селекционный процесс для однолетних культур затягивается до 10, а для двулетних до 20 лет. Использование ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому. Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются те, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов. Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре последовательностей ДНК локусов (генов) у форм растений отличающихся по проявлению признака, например по устойчивости к фитопатогену генотипов.

Актуальность исследований. Вирус желтого скручивания листьев томата (TYLCV), стал ограничивающим фактором в производстве по всему миру. Глобальное распространение томатов и вспышки популяции Bemisiatabaci(белокрылка табачная), привели к пандемии TYLCV. В США, потери, вызванные вирусом достигают 20% объемов урожая томата, а в Доминиканской Республике, Кубе, Мексике, Гватемале, Гондурасе, Никарагуа, Коста-Рике, Венесуэле, Бразилии- повреждений значительно больше, в диапазоне от 30% до 100% урожая. Потери в Доминиканской Республике в течение 1989-1995 гг были оценены в $ 50 млн.

Ареал распространения табачной белокрылки, распространителя TYLCV, велик и постоянно расширяется. Ее присутствие отмечено в Армении, Грузии, Азербайджане и Украине, имеющих схожий агроклимат с южными регионами нашей страны. В зону риска распространения белокрылки, и как следствие вируса желтого скручивания листа, в России попадают такие регионы, как Краснодарский край и республика Адыгея, Ставропольский край, Ростовская область, Белгородская область, Республика Крым.

Кардинального решения по подавлению вируса желтого скручивания листа нет. Лучшие решение проблемы состоит в создании устойчивых к заболеваниям гибридов. Такой подход экологически безопасен, и, как правило, экономически оправдан, т.к. он дешевле остальных.

В связи с выше изложенным цель исследований состояла в оценке исходного материала для выявления образцов, пригодных к созданию гетерозисных гибридов, обладающих комплексом хозяйственно - ценных признаков, в том числе устойчивостью к вирусу скручивания листьев томата (TYLCV).

Для достижения цели нами планировались следующие задачи:

Оценить коллекционный и селекционный материал на наличие генов устойчивости Ту-3а.

Отобрать наиболее ценные образцы томата с выраженностью необходимых генов устойчивости в гомозиготном и гетерозиготном состоянии.

Создать селекционные линии-доноров устойчивости к вирусу желтого скручивания листа томата, обладающих разнообразным набором хозяйственно-ценных признаков для создания гибридов F₁.

Проанализировать закономерности наследования необходимых генов устойчивости, выявить корреляционные зависимости между генами Ту-3а и морфобиологическими признаками.

Материал, условия и методика проведения исследований.В качестве исходного материала были использованы образцы томата отечественной и зарубежной селекции, имеющейся в лаборатории пасленовых культур ООО «НИИ овощеводства защищенного грунта» (табл. 1).

Таблица 1 - Перечень образцов томата использованных в исследованиях (ООО «Селекцентр» г.Крымск, 2017 - 2019 гг.)

Методы исследований. Исследования проводились в 2017-2019 гг. на базе ООО «НИИ овощеводства защищенного грунта» в пленочных теплицах ООО «Селекцентр» г. Крымск, Краснодарский край, РФ.

Полевые опыты были заложены согласно общепринятых методик. Агротехника в опытах была тепличной, принятой в V световой зоне. Опыт был заложен в трехкратной повторности, в каждой повторности 8 растений. Плотность посадки томата 2,25 растения на 1 м. Площадь учетной делянки 3,6 м.

Опыты проводились в пленочных, грунтовых, необогреваемых теплицах конструкции Агроитал - Сервис. Высота шпалеры 2,2 м.

Исследования проводили в соответствии с методикой полевого опыта [1, 2, 3]. В период вегетации растений проводили фенологические наблюдения, биометрические учеты и морфологическое описание растений согласно методических указаний [3].

Статистическая обработка экспериментальных данных проведена на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exсel.

Методика молекулярно-генетического анализа.Используемый нами метод, определяющий одну нуклеотидную замену в геномной ДНК (SNP - singlenucleotidepolymorphism), позволяет не только точнейшим образом оценить изменчивость растения, но и так же позволяет изучить аллели генов. К настоящему моменту известно большое количество SNP локусов различных растений. Выявление таких точных мутации в цепи ДНК требует знаний о нуклеотидной последовательности генома изучаемого объекта.

Сбор растительного материала проводился в разные фазы развития растений от рассады до плодоносящего растения. Для чего использовализаранее пронумерованные пробирки, пластиковые планшеты для них, пинцет, дистиллированная вода и клеенчатые этикетки, пронумерованные аналогично пробиркам. Пинцетом отщипывали фрагмент растительной ткани и помещали в отдельную пробирку и навешивали этикетку согласно номеру на пробирке.

Выделение растительной ДНК производилось в лаборатории по ранее созданному и отработанному протоколу.

Результаты исследований.Проводившиеся в течение 3-х лет испытания образцов на одного естественного заражения вирусом желтой курчавости листьев томата способствовали выявлению устойчивых экземпляров к комплексу патогенов с сохранением хозяйственно ценных признаков (табл. 2)

Таблица 2 - Результаты молеклярно-генетического анализа по выявлению устойчивости образцов к болезням (ООО НИИ овощеводства защищенного грунта, 2017-2019 гг.)

Результатом эксперимента было получение графиков четко выраженными пиками устойчивых к болезням гомозиготных (R) и гетерозиготных (Н) форм, а так же неустойчивых гомозиготных форм - (S) (рис. 1).

Рисунок 1 - Сигнатуры устойчивости генов к болезням

На основе молекулярно-генетической оценки, внешнего вида растений, индивидуальных характеристик нами были произведены индивидуальные отборы с каждого изучаемого образца -36 шт, несущие в себе лишь только гомозиготный генотип по максимальному числу генов устойчивости.

С высокой степенью уверенности можно предположить, что данные образцы являются ценным исходным материалом при создании гибридов томата для пленочных теплиц стран Ближнего Востока и Юга Российской Федерации.

Биометрия исследуемых образцов коллекции НИОЗГ (г. Крымск, (2017 - 2019 гг.))

Анализ биометрических данных, полученных в Крымском селекционном центре показал, что исследуемые образцы по количественным показателям были достаточно близки (табл. 3).

Таблица 3 - Биометрические показатели растений томата изучаемых образцов (пленочная теплица ООО «Селекцентр» г. Крымск, 2017-2019 гг.

Из приводимых в таблице сведений важным показателем в морфологическом строении томата является показатель «длина междоузлий», способствующий заложению большого количества соцветий на 1 погонный метр или до шпалеры. Оптимальные параметры растений для пленочных теплиц имеют F1 Vuslat 2,9 см, F1 Cеren, F1 Nesma 3,8 см, F1 Montenegro 3,9см, F1 Maximoos - 4,0 превосходящие стандарты F1 Dafnis (4,1) по этому показателю.

По количеству соцветий большого разброса среди образцов не наблюдается, за исключением экземпляров F1 m - 333, F1 Cаlidora, имеющих 8 штук, против 10 у контроля. гетерозисный гибрид томат скручивание

Аналогичная картина складывается и по количеству листьев. Варьирование количество листьев на растениях, за исключением образцов F1 m - 333, F1 Cаlidora, F1 Maximoos, F1 Disten имеющих, соответственно 33 и 34 листьев против 37 - 38 у стандартов. Абсолютное большинство образцов (12) формируют 35 - 36 листьев.Установлено, что 8 образцов из 24 исследуемых (33%) закладывали первое соцветие над 10 листом; 11 - над 9 листом, 5 - над 8-ым листом. Таким образом, согласно косвенного показателя скороплодности образцов можно рассматривать как скороспелыеF₁Arzum, F₁Lamia,F₁ CV-3, F₁Matatu(табл. 4).

Таблица 4 - Особенности закладки соцветий исследуемыми образцами и их характеристики (ООО «Селекцентр» г. Крымск, 2017 - 2019 гг.)

Относительно средней длины соцветия, оказалось, что разброс величин от самой короткой до самой длинной составляет от 16,0 до 28,5 или 28,3 см. Самые короткие соцветия формируют F1 Tayfun, F1 Dafnis (стандарт) - 16,2 см. Средней длины соцветия (22,3 - 22,9 см) формируют F1 Yigit, F₁Nesma, F1Maximoos. Самые длинные соцветия зафиксированы у F₁Torry - 28,2 см и F₁Kanka - 28,5 см.

Анализ средней завязываемости плодов показывает, что на формирование урожайности данный показатель, как не странно, оказывает не существенное влияние. Покажем это на нескольких образцах. У образца F₁Torry средняя завязываемость плодов с 1 по 4 соцветие составляет 37%, а сформированная урожайность равна 10,9 кг/м. В то же время у стандарта F₁Dafnisпри средней завязываемости 72,5%, формируется урожайность всего 8,5кг/м. По образцу F₁Arzum имеем 72,3% завязываемости, а формируемой урожайности 10,0 кг/м, что ниже продуктивностиF₁Yigit - 11,0 кг/м при завязываемости 63,5%. Возможно что эта разница компенсируется из - за длины соцветия, которая уF₁Torry равна 28,2 см, в то время, как у образцаF₁Dafnis - 16,2 см.

В наших наблюдениях не отмечено четких корреляционных связей между закладкой первого плодового соцветия и общей урожайностью. Так у образца F1 Matatu первое соцветие появилось над 8 листом, что не позволило получить высокого результата по общей урожайности - 7,9 кг/м2. В сравнении с образцом F1 Maximoos первое соцветие которого образовалось над 10 листом имел урожайность в 11,8 кг/м2. Также необходимо отметить что большинство образцов растения обладающих большим потенциалом при закладке соцветий, лишь на половину реализуют их в плоды (табл. 5).

Не стабильная завязываемость объясняется экстремальными температурами, приводящими к стерилизации пыльцевых зерен и нарушению процесса опыления.

Таблица 5 - Хозяйственно-ценные показатели изучаемых образцов (пленочная теплица ООО «Селекцентр», г. Крымск), 2017-2019 гг.

Большинство изучаемых образцов по срокам созревания относятся к среднеспелым томатам. Изучаемые образцы гибридов томата показали общую урожайность на среднем уровне и варьировала в пределах 7,9-12,5 кг/м2. Наибольшую урожайность показал образец F1 GV-2 - 12,5 кг/м2, превысив достоверно тем самым лишь один из стандартов - F1 Dafnis - 8,5 кг/м2. Также необходимо отметить у образца F1 GV-2 низкая стандартность плодов -58% по сравнению с F1 Dafnis -84%, что в переводе на урожайность стандартных плодов равносоответственно 7,2 и 7,1 кг/м2.

Наименьший показатель урожайности отмечен у образца F1 Matatu - 7,9 кг/м2 и отличающийся низким качеством плодов - 33%-ная стандартность и средний размер плода 79 г.

Наследование устойчивости к комплексу болезней исследуемыми образцами в F2

В продолжение наблюдений за установлением генетической ценности и фенотипической оценки нами были отобраны 5 гибридов (F₂Panda, F₂Torry, F₂Montenegro, F₂m-333, F₂Lavinya).

Было высеяно по 100 шт. семян каждого образца. С каждого сеянца был отобран растительный материал для ПЦР-анализа на наличие и состояние интересующих генов устойчивости (Tm 2.2, Sw-5, Ty-3a, Ve, I, Mi).

Молекулярно - генетический анализ образцов показал, что F₂Panda, F₂Montenegro, F₂m-333 обладают генами устойчивости к вирусу табачной мозаики (Тm. 2.2). У образца F₁Torry49,3% гетерозиготных, 15,9% гомозиготных и 34,7% неустойчивых растений, у F₁ Lavinya - 46,3% гетерозиготных, 32% гомозиготных и 21% неустойчивых растений.

Устойчивостью к вирусу бронзовости томата (Sw-5) обладал лишь один из представленных образцов Torry - 51,4% гетерозиготных, 21,4% гомозиготных и 27,1% неустойчивых растений.

Таблица 6 - Результаты молекулярно-генетического анализа изучаемых образцов томата (пленочная теплица ООО «Селекцентр», г. Крымск), 2017-2019 гг.

К вирусу желтой курчавости листьев томата (Ty-3a) устойчивы все представленные образцы и соотношение гетерозиготных, гомозиготных и неустойчивых растений примерно одинаково 2:1:1, за исключение образца Montenegro, у которого 30,7% гетерозиготных, 15,4% гомозиготных и 53,8% неустойчивых растений.

К вертецилезу (Ve) устойчивым оказались все представленные образцы-100% гомозиготных растений, за исключением Panda -100% неустойчивых генотипов.

К фузариозу (I2) устойчивы 100% растений изучаемых образцов томатов.

К нематоде (Mi1.2) соотношение гетерозиготных, гомозиготных и неустойчивых растений примерно одинаково 2:1:1, за исключение образца Montenegro - 40,0% гетерозиготных, 46,7% гомозиготных и 13,3 % неустойчивых растений. В тоже самое время 100 % растений образца Montenegro обладали гомозиготой по гену устойчивости к кладоспориозу (Cf-9), в остальных образцах данной устойчивости не было обнаружено.

Таким образом, на основании проведенных биометрических исследований, молекулярно-генетического анализа коллекции сортообразцов, а так же выявления их устойчивости к комплексу болезней можем сделать следующие заключение.

ВЫВОДЫ

1. В 2017-2019 гг. был изучен коллекционный материал из 27 образцов томата зарубежной и отечественной селекции 4 оценен по типу расщепления их потомств и закономерностей наследования изучаемых генов устойчивости.

2. Выделено 36 образцов-суперэлит томата по хозяйственно-ценным признакам, представляющим интерес для создания перспективного линейного материала.

3. Лучшим по урожайности из исследованных образцов был F₁ GV-2 формирующий за I оборот 11,4 кг/м2.

4. К вирусу желтой курчавости листьев томата (Ty-3a) устойчивы все представленные образцы и соотношение гетерозиготных, гомозиготных и неустойчивых растений примерно одинаково 2:1:1, за исключение образца Montenegro - 30,7% гетерозиготных, 15,4% гомозиготных и 53,8% неустойчивых растений.

5. По гену устойчивости к ВТМ (Tm-2.2) все представленные образцы обладали устойчивостью к данному патогену. Расщепление в F2 показало, что лишь у образцов F1 Torry - 49,3% гетерозиготных, 15% гомозиготных и 34,7% неустойчивых растений и F1 Lavinya - 46,3% гетерозиготных, 32% гомозиготных и 21% неустойчивых растений.

6. Устойчивостью к вирусу бронзовости томата (Sw-5) обладал лишь один из представленных образцов Torry - 51,4% гетерозиготных, 21,4% гомозиготных и 27,1% неустойчивых растений.

7. К вертецилезу (Ve) устойчивым оказались все представленные образцы-100% гомозиготных растений, за исключением Panda -100% неустойчивых генотипов.

8. К фузариозу (I-2) устойчивы 100% растений изучаемых образцов томатов.

9. К нематоде (Mi-1.2) соотношение гетерозиготных, гомозиготных и неустойчивых растений примерно одинаково 2:1:1, за исключение образца Montenegro - 40,0% гетерозиготных, 46,7% гомозиготных и 13,3 % неустойчивых растений. В тоже самое время 100 % растений образца Montenegro обладали гомозиготой по гену устойчивости к кладоспориозу (Cf-9), в остальных образцах данной устойчивости не было обнаружено.

10. Самый высокий уровень изменчивости проявился в таких показателях как длина и место закладки плодового соцветия (1-4 соцветие) 30,1-72,9%, за исключением первого соцветия имеющий средний по стабильности показатель 8,3-14,5%.

Список литературы

1. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта/Б. А //Доспехов.-М.: агропромиздат. - 1985.

2. Литвинов С. С. Методика полевого опыта в овощеводстве. - 2011.

3. Методические указания по селекции сортов и гибридов томата для открытого и защищенного грунта. - М. : ВАСХНИЛ, 1986. - 112 с

4. Малышев С.В., Бабак О.Г., Некрашевич Н.А., Кильчевский А.В. Разработка методов ДНК-типирования генов rin, nor, и alc, используемых для повышения лежкости плодов томата // Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты: материалы междунар. науч. конф., 3-6 дек. 2008 г., Минск.Изд. Центр БГУ. 2008. С. 126-128.

5. Календарь Р.Н., Глазко В.И. Типы молекулярно -генетических маркеров и их применение // Физиология и биохимия культ. растений, 2002. Т. 34. №4. 19 с.

6. Кармен де Висенте М., Фултон Т . Использование технологии молекулярных маркеров в изучении генетического разнообразия растений: учебный модуль / Международный институт генетических ресурсов растений (IPGRI) и Институт разнообразия геномов (IGD) Корнельского Университета. 2003. 372 с.

7. Хлесткина Е.К. Молекулярные маркеры в генетических исследованиях и в селекции // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. Т . 17. №4/2. С. 1044-1054.

8. Tanksley S.D., Nelson J.C. Advanced backcross QTL analysis: a method for the simultancous discovery and transfer of valuable QTLs from unadaptep germplasm into elite breeding lines// Theor. Appl. Genet. - 1996. - V.92. - 191-203 P.

9. KuklevM.Y.,I.A .Fesenko,G.I.Karlov Fluorescence targeting of Verticillium dahliae resistance gene (Ve) in tomato with molecular beacons. Abstracts of Proceedings of the 4th International Iran and Russian Conference in Agriculture and Natural Resources.2004,P.94-95.

Размещено на Allbest.ru