Розробка методу визначення залишків енраміцину у зразках м’яса птиці з використанням ультраефективної рідинної хроматографії з тандем-мас-спектрометричним детектуванням

Размещено на http://www.allbest.ru//

Розробка методу визначення залишків енраміцину у зразках м'яса птиці з використанням ультраефективної рідинної хроматографії з тандем-мас-спектрометричним детектуванням

Д. В. Янович, д-р с.-г. наук,

З. С. Засадна, канд. біол. наук,

У статті представлено результати розробки та впровадження УЕРХ-МС/МС методу для визначення залишків поліпептидного антибіотика енраміцину у м 'язових тканинах курей. Пробопідготовка зразків включає гомогенізацію, екстракцію у системі «рідина-рідина» з використанням водних та метанольних розчинів трифлуороцтової кислоти, очистку на октадецильних картриджах для твердофазного екстрагування, концентрування, перерозчинення у мобільній фазі та фільтрування. Основними перевагами розробленої методики є експресність хроматографічного розділення, висока селективність та чутливість (межа виявлення енраміцину А становить 5 мкг/кг, а енраміцину В - 4 мкг/кг). Методику апробовано при аналізі реальних та навантажених зразків м'яса птиці (СУ ~ 20 %).

Ключові слова: ПОЛІПЕПТИДИ АНТИБІОТИКИ, ЕНРАМІПИН ЗАЛИШКОВІ КІЛЬКОСТІ, УЕРХ-МС/МС, М'ЯСО ПТИЦІ.

енраміцин м'язовий курка хроматографічний

Антимікробні препарати часто застосовуються у птахівництві для лікування та профілактики різноманітних інфекційних захворювань. Іноді ці препарати додають до кормів на рівнях субтерапевтичних концентрацій, як антимікробні стимулятори росту, впродовж всього періоду зростання птиці [1], що може спричиняти появу антибіотикорезистетних штамів патогенних бактерій і знижувати ефективність відомих антибіотиків, призначених для лікування людини. З цієї причини стимулятори росту, такі як поліпептидні антибіотики: бацитрацин, колістин, вірджиніаміцин, енраміцин [2], заборонені для використання в якості кормових добавок, зокрема, у країнах Європейського Союзу [3]. Це, у свою чергу, зумовлює необхідність розробки та проведення суворого контролю продукції тваринного походження стосовно залишкових кількостей поліпептидних антибіотиків. Так, в країнах ЄС встановлено їх максимально допустимі рівні (МДР): для бацитрацину (сумарний вміст бацитрацину А, В і С) - 150 мкг/кг у м'ясі та 100 мкг/кг у молоці, для колістину (сумарний вміст колістину А і В) - 150 мкг/кг у м'ясі та 50 мкг/кг у молоці [4]. Оскільки вірджиніаміцин та енраміцин заборонені в європейських країнах, то їх максимально допустимі рівні законодавчо не встановлені [2]. Однак, в Японії та Кореї встановлено МДР для енраміцину в курячому м'ясі та субпродуктах на рівні 30 мкг/кг [1].

Енраміцин (ендурацидин) - поліпептидний антибіотик, що складається з 17 амінокислотних залишків та продукується бактеріями 8їгерїотусез/пщісШіст [1, 5]. Вперше виділений в Японії зі зразка ґрунту в 1967 р. [6]; ефективний щодо грам-позитивних бактерій,

має ростостимулюючий ефект стосовно поросят, курчат, в тому числі бройлерів [5, 7, 8]. Основними компонентами енраміцину є гомологи енраміцин А та енраміцин В, які відрізняються між собою тільки одним замісником (рис. 1) [1, 9]. Склад цього антибіотика може відрізнятися за співвідношенням його компонентів: переважно вміст енраміцину А становить ~ 45-70 %, а енраміцину В ~ 30 %. Енраміцин стабільний у сухій формі, а також у водних розчинах за рН 3,5-7,5 [10]. Добре розчинний у розведених розчинах хлоридної кислоти та диметилформаміді, слабо розчинний у воді та метанолі, мало розчинний в ацетоні, етанолі, хлороформі, бензені.

З огляду літературних джерел виявлено відносно небагато досліджень стосовно аналізу залишків поліпептидних антибіотиків, зокрема енраміцину, у продуктах харчування тваринного походження. Так, в 1985 році опубліковано роботу щодо кількісного визначення енраміцину у м'язовій тканині курчат і поросят методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) з УФ-детектуванням з межею детектування 200 мкг/кг [11]. Описано також методику одночасного визначення залишків ряду поліпептидних антибіотиків, в тому числі, енраміцину, у продуктах тваринного походження методом тонкошарової хроматографії [12]. Перший опублікований метод підтвердження залишків енраміцину А та енраміцину В у м'язах курчат наведено у статті Бойсона та ін. 2015 р. [1]. У роботі описано розроблену методику одночасного кількісного визначення семи поліпептидних антибіотиків методом ультраефективної рідинної хроматографії з тандем-масспектрометричним детектуванням (УЕРХ-МС/МС) після рідинної екстракції розчином трифлуороцтової кислоти та очистки шляхом твердофазного екстрагування (ТФЕ) на октадецильних картриджах. Авторам вдалося досягнути межі детектування енраміцину А на рівні 20 мкг/кг, енраміцину В - 15 мкг/кг; межа кількісного визначення відповідно становила 66 та 50 мкг/кг, відповідно. Опубліковано також застосування ВЕРХ-МС/МС методики для визначення бацитрацину, колістину, поліміксину В, вірджиніаміцину і енраміцину (межа визначення енраміцину А 42 мкг/кг) у м'ясі та молоці за попередньої очистки зразків на іонообмінних картриджах для ТФЕ [2].

Тому, у зв'язку з поширенням проблеми антибіотикорезистеності, а також з підвищенням вимог до контролю безпечності продукції тваринного походження, зокрема, м'яса птиці, нами розроблено та впроваджено метод одночасного кількісного визначення енраміцину А та енраміцину В у м'язових тканинах курчат експресним високочутливим та високоселективним методом УЕРХ-МС/МС.

Матеріали і методи. Реактиви. Метанол (for HPLC, Sigma-Aldrich), вода високоочищена бідистильована (система Milli-Q, Millipore), форміатна кислота (Riedel-de- Шё^, хлоридна кислота (Riedel-de-H^n), трифлуороцтова кислота (Fluka Analytical), ацетонітрил (for HPLC, Sigma-Aldrich), етилацетат (for HPLC, Sigma-Aldrich), гексан (for HPLC, Lab-Scan).

Стандарти. Стандарт енраміцину (TOKU-E, E006, Enramycin A / Enramycin B ~ 70/30). Основний стандартний розчин енраміцину готували з первинною концентрацією 1 мг/мл у 0,1 % форміатній кислоті у метанолі. Наступні розчини стандарту енраміцину з концентрацією 100, 10,0 та 1,0 мкг/кг готували послідовними розведеннями в 0,1 % форміатній кислоті у метанолі, а 100 нг/мл енраміцину та нижчі концентрації - у 0,1% форміатній кислоті в 30 % розчині метанолу. Розчини зберігали впродовж місяця у щільно закритому посуді в темному місці за температури 2-4 °С.

Обладнання. Рідинний хроматограф Waters ACQUITY UPLC H-Class з тандемним квадрупольним мас-спектрометричним детектором Waters Xevo TQ-S Micro, обладнаний колонкою ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 |im, 50 mm х 2,1 mm) із передколонкою ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard (1,7 |im, 5 mm х 2,1 mm) фірми Waters (США).

Приготування зразків. Зважували 5 г гомогенізованого м'яса птиці у 50 мл поліпропіленову центрифужну пробірку, додавали 10 мл 1 % трифлуороцтової кислоти у метанолі, струшували на роторному шейкері впродовж 20 хв (програма F4 90 rpm) та центрифугували впродовж 10 хв за 4700 rpm і температури 4°C. Надосадову рідину переносили в іншу 50 мл поліпропіленову центрифужну пробірку. До залишку послідовно вносили 5 мл 1 % трифлуороцтової кислоти в метанолі та 15 мл 1 % трифлуороцтової кислоти у воді, струшували на роторному шейкері впродовж 20 хв (програма С3 80 rpm) та центрифугували впродовж 10 хв за 4700 rpm і температури 4 °C. Отримані екстракти об'єднували, вносили 15 мл 1 % трифлуороцтової кислоти у воді, струшували на роторному шейкері впродовж 5 хв (програма С3 80 rpm) та центрифугували впродовж 10 хв за 4700 rpm і температури 4 °C. Надосадову рідину пропускали через паперовий фільтр («біла стрічка») в конічну колбу об'ємом 10 мл і додавали до фільтрату 15 мл 0,1 М хлоридної кислоти.

Для очистки і концентрування отриманого екстракту використовували твердофазне екстрагування на картриджах UCT C18 CEC 200 мг / 3 мл. Для цього кондиціонували картридж послідовно 3 мл метанолу, 3 мл води та 3 мл 0,1 М HCl, наносили підготований екстракт зі швидкістю приблизно 1 кр./с. Залишків рідини з картриджа позбувалися вакуумом впродовж 20 хв. Картридж послідовно промивали 9 мл етилацетату, 15 мл 1 % форміатної кислоти в етилацетаті та 9 мл гексану і сушили у вакуумі 2 хв. Елюювання енраміцину проводили у скляні центрифужні пробірки двома порціями по 2 мл розчину 80 % метанолу / 20 % ацетонітрилу (об. / об.).

Отриманий елюат випаровували до сухого залишку на роторному випарювачі, перерозчиняли у 300 мкл 0,1 % форміатної кислоти в метанолі, екстрагували аналіт на вортексі 20 с та витримували в ультразвуковій бані впродовж 5 хв за кімнатної температури. Додавали 700 мкл 0,1 % форміатної кислоти у воді, перемішували на вортексі 20 с та продовжували екстрагування в ультразвуковій бані впродовж 5 хв. Після цього розчин фільтрували через політетрафлуоретиленовий шприцевий фільтр (розмір пор 0,2 мкм) у віалу для хроматографічного аналізу. Фактор концентрування - 5.

Побудова калібрувального графіка. Для побудови калібрувального графіка використовували робочі розчини стандарту енраміцину, концентрації енраміцину А та енраміцину В обчислювали згідно із сертифікатом стандартного зразка енраміцину, а саме: вміст енраміцину А - 70 %, а енраміцину В - 30 % (табл. 1).

Таблиця 1

Схема побудови калібрувального графіка на стандартних розчинах енраміцину для визначення його залишків у м'ясі птиці

Хроматографічний аналіз.

Параметри хроматографічної системи:

Мобільна фаза А - 0,1 % розчин форміатної кислоти у воді; Мобільна фаза В - 0,1 % розчин форміатної кислоти у метанолі. Швидкість потоку - 0,6

мл/хв.

Об'єм зразка - 10 мкл.

Промивна рідина - метанол / вода 70 %/30 % (об./об.). Температура колонки - 40 °С.

Час проведення розділення - 6 хв.

Розділення проводять за таким градієнтом:

Час виходу енраміцину А - 3,30 хв; енраміцину В - 3,63 хв.

Параметри роботи мас-спекрометричного детектора.

Час інтегрування - 5 хв.

Іонне джерело - електророзпилювач (ESI).

Температура джерела (Source Temperature) - 150 °C. Температура висушування (Desolvation Temperature) - 600 °C. Газ зіткнення (Collision Gas) - аргон.

Тиск аргону - 3,8*10"3 mbar.

Газ висушування (Desolvation Gas) - азот.

Потік газу висушування - 1000 L/hr Газ розпилення (Nebulisation Gas) - азот.

Потік газу розпилення - 50 L/hr Час сканування (Dwell) - 0,025 с.

Іонізація - ES+ (позитивна)

Режим сканування мас - МЯМ (режим моніторингу множинних реакцій) (табл. 2).

Параметри сканування мас (МКМ) для УЕРХ-МС/МС визначення для визначення залишків енраміцину у м'ясі птиці

Таблиця 2

Визначення вмісту енраміцину (сумарно енраміцину А та енраміцину В) в досліджуваних зразках м'яса птиці (мкг/кг) проводили згідно з калібрувальними графіками, використовуючи програмне забезпечення MassLynx V4.1.

Результати й обговорення. Як видно з рисунка 1, енраміцин складається з двох основних компонентів - енраміцину А та енраміцину В, які відрізняються на одну групу - СН2-. Оскільки їх молекулярні маси досить великі, - 2355 та 2369 г/моль, то відповідно, за умов позитивної іонізації ES+ ці поліпептиди здатні утворювати дво-, три- та чотиризарядні молекулярні батьківські іони (прекурсор-іони) [1, 2, 10] (табл. 3).

Таблиця 3

Прекурсор-іони основних складових енраміцину, що утворюються в режимі іонізації Е8+

Як правило, найінтенсивнішими в мас-спектрі поліпептидів є тризарядні іони [М+3Н]3+ [10], тому для кількісного визначення залишків енраміцину ми використовували по чотири МБ/МБ переходи кожного з тризарядних батьківських іонів 789 т^ (енраміцин А) та 791 ш/2 (енраміцин В) (табл. 2).

Для визначення вмісту енраміцину (сумарно енраміцину А та енраміцину В) у м'язових тканинах птиці за основу нами було взято методику пробопідготовки зразків, описану у роботі Бойсона та ін. [1], оскільки вважаємо доречним використовувати іон-парний реагент, а саме - трифлуороцтову кислоту. Проте замість вносити цей реагент до мобільної фази, змінюючи звичний її склад, ми застосовували трифлуороцтову кислоту під час екстракції енраміцину з гомогенізованих зразків м'яса у системі «рідина-рідина», як пропонують автори. Для додаткової очистки екстракту застосовували ТФЕ на картриджах зі стаціонарною октадецильною фазою, які хоча і не є високоселективними, але забезпечують суттєву очистку екстракту від матричного впливу компонентів м'яса. Так, аналітичні сигнали від енраміцину А та енраміцину В (сумарна концентрація 10 нг/мл енраміцину), приготованих на мобільній фазі та зразок, підготовлений відповідно до процедури пробопідготовки на екстракті чистого зразка м'яса птиці, практично не відрізнялися за характером піку, абсолютними площами, співвідношенням «сигнал/шум» та співвідношенням іонів. Це свідчить про відсутність пригнічення іонізації аналітів складовими матриці та підтверджує ефективність вибраної пробопідготовки для визначення залишків енраміцину.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

На рис. 2 і 3 наведено калібрувальні графіки, побудовані на стандартних розчинах енраміцину, для його визначення в діапазоні концентрацій від 0 до 100 мкг/кг, тобто від 0 до 70,0 мкг/кг для енраміцину А (Рис. 2) та від 0 до 30,0 мкг/кг для енраміцину В (рис. 3).

Оцінку придатності запропонованої методики для аналізу зразків м'язових тканин курей проводили за критерієм “додано-отримано” з використанням контрольних (чистих) матриць. Результати представлені в таблиці 4.

Таблиця 4

Метрологічні характеристики методики УЕРХ-МС/МС визначення енраміцину у м'язових тканинах курей

Згідно з отриманими даними, межа детектування енраміцину А при визначенні залишкових кількостей енраміцину у зразках м'язових тканинах курей, становить 5 мкг/кг, а межа кількісного визначення - 15 мкг/кг. Для визначення енраміцину В ці величини становлять 4 мкг/кг та 10 мкг/кг, відповідно. Отже, за чутливістю розроблена методика цілком конкурентна з попередньо опублікованими ВЕРХ-МС/МС методиками визначення поліпептидних антибіотиків у м'язах тварин.

Розроблену методику УЕРХ-МС/МС визначення залишків енраміцину у м'ясі птиці апробовано при аналізі реальних та навантажених зразків. На рисунку 4 представлено хроматограми екстрактів відповідно підготованих чистих зразків м'язової тканини курчат та чистих зразків, навантажених енраміцином. Як видно з наведених даних, запропонований градієнт хроматографічного розділення дозволяє надійно відокремити сигнали аналітів від сигналів матричних компонентів та забезпечити високочутливий та експресний аналіз зразків на вміст залишків енраміцину (тривалість хроматографічного розділення - 6 хв) без додавання іон-парного реагента до мобільної фази.

Рис. 4. Хроматограми екстрактів чистих зразків м'язової тканини курчат (1, 2) та чистих зразків, навантажених енраміцином на рівні 100 мкг/кг (3, 4).

Отже, за результатами проведених досліджень, розроблений та впроваджений підтверджуючий метод УЕРХ-МС/МС визначення залишкових кількостей поліпептидного антибіотика енраміцину є високоспецифічним та високочутливим, що дозволяє належним чином забезпечувати необхідний контроль експортних та імпортних партій м'яса птиці.

Висновки

Для контролю безпечності зразків м'яса птиці, а також зважаючи на проблему антибіотикорезистентності, нами розроблено та впроваджено підтверджуючий метод визначення залишкових кількостей поліпептидного антибіотика енраміцину високочутливим, високоселективним та експресним методом УЕРХ-МС/МС. Запропонована методика дозволяє на належному рівні проводити контроль та моніторинг безпечності зразків м'яса птиці, в тому числі, експортних партій, на вміст залишків енраміцину А та енраміцину В.

Перспективи досліджень. Модифікація процедури пробопідготовки зразків м'яса птиці для УЕРХ-МС/МС визначення залишкових кількостей енраміцину з метою покращення експресності та чутливості методики.

Размещено на Allbest.ru