Совершенствование клонального микроразмножения крыжовника

Размещено на http://www.allbest.ru/

Совершенствование клонального микроразмножения крыжовника

Д.Н. Сковородников

Аннотация

Оптимизированы основные этапы клонального микроразмножения крыжовника. Увеличение приживаемости и регенерации побегов крыжовника в культуре in vitro достигается за счет введения в состав питательной среды CPPU в концентрации 0,2 мг/л. На этапе размножения при использовании среды МС в сочетании с 6-БАП в концентрации 1 мг/л у четырех сортов крыжовника в среднем образовывалось 3,4 дополнительных побега на эксплант, с высотой до 1 см в течение 3 недель. Увеличение высоты растений достигается за счет введения в состав питательной среды гибберелловой кислоты в концентрации 0,5-1 мг/л. Микрочеренки крыжовника эффективно укореняются непосредственно в нестерильном торфяном грунте при обработке базальной части побегов ауксинсодержащим препаратом "Корневин".

Ключевые слова: ягодные культуры, Ribes, крыжовник, культура растительной ткани, клональное микроразмножение, регуляторы роста растений, цитокинины, ауксины, гиббереллины, питательная среда, регенерация, органогенез.

The basic stages of clonal micropropagation of gooseberry were optimized. The increase survival rate and regenerations of gooseberry shoots in culture in vitro is reached at the expense of introduction in structure of nutrient medium CPPU in concentration of 0,2 mg/l. At a proliferation stage at MS environment use in a combination with 6-BAP in concentration of 1 mg/l at four studied gooseberry varieties of 3,4 additional shoot on explant, with height less than 1 cm within 3 weeks on the average were formed. The increase of plants height is reached at the expense of introduction in nutrient medium structure gibberellic acid in concentration of 0,5-1 mg/l. Gooseberry shoots effectively root directly in an unsterile peat ground using a treatment of basal parts of cuttings with growth regulator "Kornevin".

Key words: Berry crops, Ribes, gooseberry, plant tissue culture, clonal micropropagation, plant growth regulators, cytokinins, auxins, gibberellins, nutrient media, regeneration, organogenesis.

Целью настоящего являлась оптимизация процесса клонального микроразмножения крыжовника.

Крыжовник в народе издавна называют "северным виноградом" за высокую продуктивность и вкусовые качества ягод. В зависимости от условий выращивания в ягодах накапливается большое количество витаминов, антоцианов, органических кислот, солей.

Традиционные способы размножения крыжовника (горизонтальными и вертикальными отводками, зелеными и одревесневшими черенками) не всегда достаточно эффективны, что связано с низкой укореняемостью черенков отдельных сортов. Эти способы размножения не обеспечивают оздоровления посадочного материала от вирусной и грибной инфекции, а содержание маточников требует дополнительных затрат [1].

Метод клонального микроразмножения можно считать перспективным как в питомниководстве, так и в селекционном процессе, поскольку он позволяет за довольно короткий срок получать значительное количество однородного посадочного материала (исходных форм, гибридного материала, ценных сортов). Параллельно происходит частичное освобождение от патогенных микроорганизмов и во многих случаях от вирусов.

Клональное микроразмножение представляет собой вариант вегетативного размножения растений в культуре in vitro на искусственной питательной среде в контролируемых условиях. Размножение in vitro имеет целый ряд преимуществ перед традиционными способами: высокий коэффициент размножения, возможность оздоровления посадочного материала от вирусной инфекции, увеличение продуктивности растений и др. Сущность клонального микроразмножения заключается в проведении ряда последовательных операций с культурой растительных тканей и органов, которые состоят из четырех этапов: этапа введения в культуру in vitro

Методика исследования

Работа проводилась в Научно-образовательном центре биотехнологии Брянской ГСХА. Объектом исследования являлись сорта крыжовника: Северный капитан, Снежана, Асирома, Неслухнянский, Карпаты.

Заготовку черенков растений крыжовника осуществляли в октябре за несколько дней до изолирования эксплантов. Материал хранили в полиэтиленовых пакетах для предотвращения его подсыхания в холодильнике при температуре 4°С.

Перед изолированием эксплантов черенки нарезали на сегменты с одной почкой длинной 2-4 см, которые стерилизовали в 0,1% растворе мертиолята (орто-этилртутьтиосалицилат натрия) и 0,3% SDS (додецилсул фат натрия) в качестве поверхностноактивного вещества в течение 3 минут на шейкере, с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде. В качестве источников эксплантов использовали почки без нескольких кроющих чешуй.

Культивирование эксплантов осуществляли на питательной среде Мурасиге-Скуга [2] в пробирках Флоринского.

На этапе введения в культуру in vitro в качестве источника цитокинина испытывали: производные пуринового рядя - 6-бензиламинопурин (6-БАП), кинетин (Кин), изопентиладенин (2-iP) в концентрации 0,2; производные дифенилмочевины - У-(2-хлор-4-пиридил)-У-фенилмочевину (CPPU), мг/л и тидиазурон (TDZ) в концентрации 0,1 мг/л.

Размножение растений осуществляли на питательной среде МС обогащенной витаминноминеральным комплексом "Компливит" (2 г/л) и 6- БАП (1 мг/л). Штативы с пробирками помещали на стеллажи оборудованные лампами дневного света. Повторные субкул тивирования проводили по мере образования новых побегов (в среднем через 6 недель).

Для получения более крупных микрочеренков, пригодных к укоренению, при последнем субкул тивировании испытывали питател ные среды с пониженной концентрацией 6-БАП - 0.2 мг/л в сочетании с гиббереллином (ГК) в концентрациях 0.2,

0. 5 и 1 мг/л.

Укоренение растений осуществляли в минипарничках (пластиковые кассеты, вставленные в поддон и накрытые прозрачной крышкой) наполненные предварительно увлажненным готовым субстратом ("Нестеровский") смешанным с крупнозернистым речным песком в соотношении 3: 1. Для стимуляции корнеобразования базал ная част микрочеренков обрабатывалась ауксинсодержащим препаратом "Корневин". По мере отрастания растений и появления новых листочков, крышку с минипарничка снимали. Периодически проводили полив и опрыскивание растений. Через 1.5-2 месяца окрепшие растения распикировывали в пластиковые ящики, выстланные нетканым материалом и заполненные субстратом. С наступлением положительных температур в весенний период ящики переносилис в легкие теплицы, накрытые нетканым материалом типа Лутрасил для адаптации к ул трафиолетовому излучению.

Результаты и обсуждения

Крыжовник в сравнении с другими плодовоягодными кул турами обладает низкой регенерационной способностью [3, 4].

На этапе введения в культуру in vitro в состав питательной среды вводят регуляторы роста цитокининовой природы. При культивировании первичных эксплантов крыжовника применяют 6- БАП в невысоких концентрациях (0,2-0,5 мг/л) [5, 3, 6]. Положительным эффектом при введении ягодных растений в культуру in vitro обладают регуляторы роста цитокининовой природы ряда дифенилмочевины: тидиазурон и CPPU, которые увеличивали приживаемост эксплантов, количество регенерировавших побегов у ремонтантных форм малины и смородины чёрной [7, 8]. крыжовник клональный побег

Лучшая приживаемость исходных эксплантов была отмечена на питательных средах со следующими регуляторами роста - 6-БАП, CPPU и тидиазурон., Оптимальными показателями роста и развития отличались растения, кул тивируемые на среде CPPU, которые лидировали по способности регенерироват дополнител ные почки, их количеству и высоте эксплантов (табл. 1). Кинетин и 2-iP вызывали лишь распускание незначительной группы почек, без образования дополнительных побегов. В среднем отмечалась регенерация одной почки/побега на эксплант, за исключением варианта с CPPU.

Таблица 1 - Влияние регуляторов роста цитокининовой природы на эффективность введения в куль туру in vitroкрыжовника (сорт - Северный капитан)

in vitro крыжовника (CPPU 0,2 мг/л)

Отличительной особенностью регуляторов роста ряда дифенилмочевины (тидиазурон и CPPU) являлось образование каллуса в месте среза первичного экспланта. Однако при весеннем введении в культуру in vitro крыжовника сорта Северный капитан каллусообразования не наблюдалось. При проведении первого субкультивирования каллусы удалялись и их образования на среде размножения уже не происходило. Каллусы имели белесый цвет, рыхлую консистенцию, легко рассыпались при надавливании, т.е. не обладали морфогенными признаками и, следовательно, потенциал ной возможностью появления сомаклональных вариантов при регенерации растений через каллусную культуру.

После месяца культивирования первичные экспланты существенно по высоте не отличались.

Для введения в культуру in vitro четырех сортов крыжовника использовали оптимизированный состав питательной среды МС с присутствием в ней CPPU в концентрации 0,2 мг/л.

Количество эксплантов регенерировавших дополнительные почки составило 30,2-58,3%. На одном экспланте образовывалось в среднем от 1,2 (сорт Карпаты) до 1,7 дополнительных почек (сорт Неслуховский), но этот показатель не превышал 3. Высота эксплантов также существенно не отличалась по сортам и варьировала в диапазоне 4,1-5,7 мм (табл. 2).

Таким образом, удалось успешно ввести в культуру пять сортов крыжовника, которые в дальнейшем подверглись черенкованию в условиях in vitro. Оптимальным регулятором роста был CPPU в концентрации 0,2 мг/л.

В качестве источника цитокинина в питательной среде на этапе размножения крыжовника используют 6-БАП в различных концентрациях в сочетании с ИМК или без него (Приходько, 1996).

В наших исследованиях при размножении растений крыжовника на средах с концентрацией 6- БАП 1 мг/л образовывались небольшие (менее 1 см) конгломераты со средним коэффициентом размножения 3,4. Новые побеги образовывались относительно быстро - спустя 3 недели, что давало возможности при среднем коэффициенте размножения в короткий срок размножит изучаемый материал.

Установлено, что лучшей укореняемостью в культуре in vitro обладают крупные побеги (Высоцкий, 1998). Малый размер побегов крыжовника затрудняет последующий этап клонального микроразмножения (укоренение), что потребовало включения дополнительного этапа элонгации.

Предварительный эксперимент по элонгации побегов показал, что безгормональная среда, применяемая на малине в нашей лаборатории, на крыжовнике оказалась неэффективной - некоторая част растений в условиях in vitro погибла, а их вытягивание было несущественным. Введение в состав среды витаминно-минерального комплекса "Компливит" в концентрации 2 г/л в сочетании с низкой концентрацией 6-БАП (0,2 мг/л) вызывало формирование более крупных побегов. Эффективность низких концентраций 6-БАП на последнем этапе культивирования крыжовника подтверждается также и другими авторами (Приходько, 1996).

Фитогормоном, отвечающим за растяжение клеток и междоузлий растений, является гиббереллин (ГК), который рекомендуют вводить на этапе размножения в низких концентрациях. Для удлинения побегов нами был заложен эксперимент с различными концентрациями ГК в сочетании с 6-БАП в концентрации 0,2 мг/л. Результаты этого опыта представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние 6-бензиламинопурина и гибберелловой кислоты на элонгацию побегов крыжовника in vitro (Северный капитан)

В контрольном варианте на безгормональной среде высота побегов крыжовника сорта Северный капитан не увеличилась в сравнении с аналогичным показателем на этапе размножения и, кроме того, культивируемые микрочеренки обладали низким показателем приживаемости (24,1%). Оставшиеся к учетному периоду растения не ветвились и имели желтоватую окраску листьев.

Сохранность растений на среде с низкой концентрацией 6-БАП увеличилась более чем в три раза, и кроме того наблюдалась тенденция образования более крупных побегов. В отличие от контроля растения образовывали дополнительные побеги.

Включение в состав питательной среды гиббереллина вызвало увеличение длины побегов за счет растяжения междоузлий по мере возрастания концентрации регулятора роста от 0,2 до 1 мг/л.

Большинство ягодных растений при размножении на питательных средах в присутствии с цитокининами не имеют корней, поэтому, как правило, трет им этапом клонального микроразмножения является укоренение полученных микрочеренков in vitro. Индукция корнеобразования достигается за счет введения в состав а(ксинов или замачиванием черенков в ауксинсодержащих растворах с последующим культивированием на безгормональной среде. Частота укоренения и качество образовавшихся корней в первую очередь зависят от генотипа.

Существенным преимуществом перед названными способами индуцирования ризогенеза обладает укоренение растений непосредственно в грунт с предварительной обработкой базальной части концентрированным раствором ауксина. В этом случае увеличивается частота укоренения растений, образовавшиеся корешки непосредственно адаптируются к нестерильным условиям грунта и не повреждаются, как в случае с высадкой укорененных in vitro растений.

При обработке неукорененных микрочеренков крыжовника препаратом "Корневин" и высадкой в субстрат, приживаемость растений составила около 100%.

Однако в отличие от других ягодных культур крыжовник отличался самыми низкими приростами. Через 2 месяца после высадки высота растений не превышала 4-5 см, тогда как по нашим наблюдениям, растения смородины черной и малины к этому времени достигают 10-20 см. По-видимому, такая особенность роста ювенильного материала полученного in vitro соответствует ростовым характеристикам сеянцев крыжовника, которые очень медленно прорастают и продолжительное время находятся в состоянии миниатюрных проростков.

Выводы

1. Увеличение приживаемости и регенерации побегов крыжовника в культуре in vitro достигается за счет введения в состав питательной среды CPPU в концентрации 0,2 мг/л;

2. Увеличение высоты побегов достигается при введении в состав среды ГК в концентрации 0,5-1 мг/л;

3. Микрочеренки крыжовника эффективно укореняются непосредственно в нестерильном торфяном грунте при обработке базальной части побегов ауксинсодержащим препаратом "Корневин".

Литература

1. Ковалева, И.С. Особенности микроклонального размножения сортов крыжовника / И.С. Ковалева, Т.В. Данилова // Агро XXI. - 2001. - № 5. - С. 21.

2. Murashige, Т. & Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. - 1962. - V. 15. - N. 13. - P. 473-497.

3. Приходько, Ю.Н. Технология оздоровления крыжовника от вирусов / Ю.Н. Приходько // Плодоводство и ягодоводство России. - 1996. - Т.3. - С. 109-113.

4. Высоцкий, В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и селекции плодовых и ягодных растений: Автореф. дис. докт. с.-х. наук: 06.01.07 и 03.00.12 / В.А. Высоцкий; ВСТИСП. - М., 1998. - 44 с.

5. Wainright, H. The microprogation of gooseberry уRibes uva-crispa L.). 2. In vitro proliferation and in vivo establishment / H. Wainright, A.W. Flegmann // J. hortic. Sc. - 1985. - Т. 60. - №4. - p. 485-491.

6. Аладдина, O.H. Эффективность размножения красной смородины и крыжовника in vitro при обработке маточных растений ретардантами / O.H. Аладдина // Изв. Тимирязев. с.-х. акад. - 2004 - Вып. 1. - С. 62-71.

7. Вовк, В.В. Оптимизация селекционного процесса и ускоренное размножение межвидовых ремонтантных форм малины методом in vitro. Автореф. канд. дис. / В.В. Вовк - Брянск., 2000. - 18 с.

Сковородников, Д.Н. Некоторые аспекты использования цитокининов различной природы на этапе введения в культуру in vitro эксплантов смородины чёрной / Д.Н. Сковородников, И.А. Райков // Плодоводство и ягодоводство России. Сборник научных работ. T.XXII. - 4.2 - 2009. - С. 292-296.

Размещено на Allbest.ru