В статье приведены результаты по изучению состава питательной среды для культивирования бактерий рода Bacillus subtillis для получения пробиотика направленного на лечение дисбактериоза сельскохозяйственных животных. Предложена питательная среда с использованием нетрадиционных источников сырья (пивной дробины) как основного компонента.

Перспективным направлением экологизации сельского хозяйства является внедрение в практику животноводства биопрепаратов на основе различных видов микроорганизмов [1]. Одними из наиболее перспективных являются препараты на основе высокоактивных штаммов Bacillus subtilis, которые не только защищают животных от патогенных микроорганизмов [2].

Разработка и внедрение в практику ветеринарии новых высокоэффективных препаратов для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней животных представляет собой актуальную задачу. Это объясняется ростом заболеваемости животных, несвоевременной диагностикой болезней в условиях ухудшающейся эпизоотической и экологической обстановки, а также недостаточной эффективностью существующих лечебно-профилактических средств [1, 2].

В настоящее время ведется поиск дополнительных источников белка в виде новых кормовых продуктов, применение которых бы позволило повысить биологическую ценность и продуктивность действия комбикормов, а также эффективность их использования животными и птицей. Следует отметить, что отечественная наука и промышленность решают проблемы расширения ассортимента кормовых добавок с использованием нетрадиционных источников сырья [3].

Отходы пивоваренной промышленности, например пивная дробина, большая часть которых представляет собой водянистые, скоропортящиеся продукты, используются нерационально. Сырая пивная дробина в сыром виде использовалась животноводами для скармливания домашним животным как молокогонный высокобелковый корм. Как правило, пивную дробину используют как корм для жвачных животных, однако ее можно скармливать и другим животным, применяя специальные методы обработки дробины [4].

Среди таких кормовых добавок разработана комплексная добавка "Пробиоцел". Пивную дробину смешивают с отрубями и сбраживают специально выделенными микроорганизмами (Bacillussubtillis). Бактерии частично перерабатывают клетчатку в легко усваиваемые сахара. В смесь добавляют микроэлемент селен. После ферментации полученную массу высушивают, в таком виде она может храниться не меньше года. Если телята едят пищу с новой добавкой, то болеют гораздо реже животных из контрольной группы, а вес набирают быстрее (в среднем на 16%) [5].

В настоящее время для повышения биологической активности микроорганизмов все чаще используют дешевые питательные среды, на основе которых разрабатывают более совершенные технологии в целях значительного повышения продуктивности бактериальных культур [6].

Для проявления полезных свойств микроорганизмы нуждаются в определенном наборе питательных веществ. Из-за создания неблагоприятных условий среды: понижения рН, накопление вредных продуктов обмена, исчерпания запасов одного из питательных веществ, находившегося в минимуме, рост и размножение клеток могут прекратиться [7].

Микроорганизмы видов В. subtilis могут развиваться набелковых и синтетических питательных средах с аммонийными солями или нитратами. К бактериям, восстанавливающим нитраты, относят многиештаммы В. licheniformis. Основным источником азотного питания для В. subtilis и В. licheniformis, как и для других непатогенных аэробных спорообразующих бактерий, является белковое сырье, в частности: пептон, соя, казеин, горох и некоторое другое [8].

Для того чтобы при культивировании микроорганизмы получали полноценное питание (азотистые соединения, углеводы, микро - и макроэлементы и другие биологически активные вещества) необходимо на основании их индивидуальных особенностей проводить исследования по подбору питательных сред [9].

Поэтому наши исследования, при разработке глубинного способа культивирования бактериальных культур Bacillus subtilis АМК - 122 были направлены на разработку более дешевой, полноценной и сбалансированной питательной среды и создание оптимальных условий ведения процесса биосинтеза с целью усовершенствования технологии получения пробиотической добавки. Важнейшей стадией в производстве бактериальных препаратов является получение максимума биомассы их компонентов за минимальное время культивирования с достижением максимального экономического эффекта. Таким образом, вопрос оптимизации условий культивирования бактерий является актуальным.

Объектом служила спорообразующая аэробная культура Bacillus subtilis АМК - 122. Культивирование осуществляли в ферментере вместимости до 4 л, позволяющей получать требуемое количество биомассы.

Для выращивания Bacillus subtilis АМК - 122 использовали питательные среды следующего состава: стандартная среда Гаузе №2: панкреатический гидролизат соевой муки (общий азот 120-140 мг/%; аминный азот 20 мг/%); MgSO₄ - 0,1 г·дм^-3 NaCl - 1,0 г·дм^-3 CaCl - 7,5 мг/% FeSO₄ - 0,001 г·дм ^{- 3} глюкоза - 20,0 г·дм^-3 дистиллированная вода - до 1,0 дм³; жидкая питательная среда, состоящая изг/л:

Мелассы - 10-30, кукурузный экстракт 1-3, глютена 0,05-0,10, сульфата магния 0,07-0,11, двузамещенного фосфорнокислого калия 0, 20-0,24 хлористого кальция 0,12-0,22, [10];

модифицированная среда на основе пивной дробины, г/л: пивная дробина 10 - 30 кукурузный экстракт 1 - 3, меласса 10-18, сульфата магния 0,07-0,11,двузамещенного фосфорнокислого калия 0, 20-0,24 хлористого кальция 0,12-0,22

bacillus subtillis пробиотик пивная дробина

Культивирование бактериальных клеток Bacillus subtilis АМК - 122 проводили глубинным способом на качалке (120 об·мин при 37±1°С) в течение 48±4 ч. Посевной материал готовили в концентрации не менее (1-5·10 ⁹ КОЕ/см^-3). В колбы вносили питательную среду, после чего добавляли посевной материал и помещали на качалку, что соответствует окончанию стационарной фазы роста, процесс биосинтеза прекращали, культуральную жидкость охлаждали до температуры (12±3)°С.

Показано, что при культивировании Bacillus subtilis АМК - 122 на изучаемых средах различного состава бактерии проявляли различную ростовую активность. На стандартной среде Гаузе наблюдали интенсивный рост Bacillus subtilis АМК - 122. Максимальное содержание клеток в среде после 48 часов культивирования составляло 5·10 ⁹КОЕ/см^-3. Однако компоненты данной среды являются дорогостоящими для наработки биомассы в производственных условиях. Поэтому было предложено использование мелассная среды для культивирования бацилл и последующее добавление пивной дробины позволило повысить накопление клеток до 7 ?10⁹ КОЕ/см^-3.

Более оптимальной является среда мелассная с добавлением пивной дробины, которую бактерии могут использовать в качестве основного источника углерода и белка. Исследования ростовой активности Bacillussubtilis АМК - 122 на средах с различным содержанием пивной дробины (10,0; 20,0; 30,0 г/л) в течение 48 часов показали, что наибольшую удельную скорость роста Bacillussubtilis АМК - 122 (0,37 ч^-1) наблюдали после 36 часов выращивания содержащей 10,0г/л пивной дробины. При этом численность клеток составила 7 ?10⁹ КОЕ/см^-3.

Рисунок 1 - Рост Bacillussubtilis АМК-122 на питательных средах различного состава

В вариантах сред содержащих пивную дробину в концентрациях 20,0; 30,0 г/л удельная скорость роста составила соответственно 0,29 ч^-1; 0,2ч^-1, численность клеток 5 ·10⁹ КОЕ/см^-3.

Таким образом, в результате полученных данных, содержащая пивную дробину в концентрации 10,0 г/л была взята за основную для проведения дальнейших исследований.

Литература

1. Панин А.Н., Биотехнологические аспекты изготовления сухих пробиотических препаратов // Научные основы пр-ва вет. биол. препаратов. - Щелково. - ВНИТИБП, 2000. - С.343-345.

2. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол. журн. - 1992. - Т.54, № 6. - С.82-94.

3. Лиморенко А.П., Разработка технологии глубинного способа культивирования микроорганизмов B. subtilis и B. licheniformis для производства пробиотиков. Автореф. кандид. диссер., 2002. - С.124

4. Леснов А.П., Никитин С.И., Лазаревич А.Н. Современные биотехнологии переработки пивной дробины высокобелковые экологически безопасные корма. // "Природообустройство" научно-практический журнал №4 2011 г., Москва, - С.26-31.

5. Свиридов Д.А., Использование свежей пивной дробины в кормлении животных. Аграрная тема // 1 (30) 2012, - С.44-45

6. Потебня Г.П., Танасиенко О.А., Черемшенко Н.Л., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И. Закономерности биосинтеза цитотоксических лектинов культурой BacillussubtilisB - 7025 при выращивании на разных питательных средах. // Микробиол. журн. 2011, т № 9. - с.18-20.

7. КудрявцевВ.А., Сафронова Л.А., Осадчая А.И., КозачкоИ.А. Подбор состава среды для оптимизации аминосинтетической активности аэробныхбацилл // Микробиол. журн. 1991, т.53, № 4. - с.68-72.

8. ОсадчаяА.И., Прокопченко С.Ф., Михновская И.Д. Влияние некоторых минеральных солей на рост и развитие штаммаBacillusthuringiensis Н14 266/2-1 // Микробиол. журн. 1989. - т.51, № 5 - с.26-28.

9. Лиепиньш Г.К. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии /Лиепиньш Г.К., Дунце М.Э. - Рига: Технология. - 1986. - С.212

10. Равилов А.З. Микробиологические среды /Равилов А.З., Гильмудинов Р.Я., ХусаиновМ.Ш. - Казань: ФЭП. 1999. - С.87

Размещено на Allbest.ru