Трансплантация ранних эмбрионов кроликов – важный этап получения трансгенных особей

Размещено на http://www.allbest.ru/

трансплантация ранних эмбрионов кроликов - важный этап получения трансгенных особей

Козикова Лариса Васильевна

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных»

Санкт-Петербург, Пушкин

Аннотация

Были сформированы две группы кроликов, у которых были получены зиготы и двухбластомерные эмбрионы после обычного спаривания и кролики-доноры, спаренные после гормональной обработки. Несмотря на то, что после суперовуляции получено значительно большее количество донорских эмбрионов, чем после обычного спаривания, эффективность их трансплантации была ниже, чем в группе эмбрионов, полученных после спаривания с самцом.

Ключевые слова: трансплантация ранних эмбрионов кроликов

TRANSPLANTATION OF EARLY EMBRYOS RABBITS - ARE AN IMPORTANT STAGE IN THE PRODUCTION OF TRANSGENIC ANIMALS

Kozikova Larisa Vasilievna

Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding

St. Petersburg, Pushkin

Abstract

Two groups of rabbits were formed, one-after normal mating and two - rabbits paired after hormonal treatment. Despite the fact that after superovulation significantly more donor embryos were produced the efficiency of transplantation in this group of embryos were lower than in group with normal mating.

В настоящее время пересадка, как ранних эмбрионов, так и морул-бластоцист широко применяется в животноводстве [1]. Именно трансплантация позволяет полнее использовать, и увеличивать важные и ценные генотипы выдающихся животных по продуктивным качествам, особей, устойчивых к разным заболеваниям или редких, вымирающих индивидуумов. Одним из хорошо изученных и удобных объектов для экспериментов служит кролик [2]. Трансплантация является также важным и промежуточным звеном в разработках инновационных клеточных технологий, таких как получение трансгенных и клонированных животных [3,4]. Как известно, различают ауто-, гомо- и гетеротрансплантацию. Для получения трансгенных животных аутотрансплантации используется в крайне редких случаях, т.к. этот вид трансплантация хуже переносится животными имеет методические сложности, не всегда приводит к рождению потомства. Самым распространенным видом трансплантации в технологии получения генетически модифицированных животных является гомотрансплантация, когда донором и реципиентом служат разные самки одной породы. Первые успешные попытки трансплантации эмбрионов кроликов были проведены еще в конце девятнадцатого века и в первой декаде двадцатого столетия. Следует отметить, что в этом случае необходимо подготовить самку-реципиента и вызвать у нее ложную беременность либо за свет введения хорионического гонадотропина, либо при спаривании с вазектомированном самцом. Как правило, в случае пересадки эмбрионов разных пород применяют гетеротрансплантацию. Если животные отличаются по фенотипическим признакам (например, по окраске), то самку-реципиента удобнее спаривать с плодовитым самцом, что повышает количество и количество полученных эмбрионов. Целью настоящего исследования явилось проведение анализа качества эмбрионов и эффективности получения трансплантированных эмбрионов у кроликов.

Материал и методы исследований. Работа проводилась на молодых кроликах в возрасте до года, причем использовали животных разных пород, таких как белый великан, шиншилла и новозеландская. К 4-5 месяцам кролики достигают половой зрелости. Продолжительность беременности составляет 27-32 дня. У крольчих, в отличие от других животных, яйцеклетки выходят из яичников только после покрытия ее самцом. В этот период времени в кровь самки поступают гонадоторопные гормоны гипофиза, под влиянием которых происходит дозревание, разрыв фолликулов и овуляция яйцеклеток. Через 10-12 часов после спаривания наступает овуляция. У кроликов оплодотворение яйцеклеток наступает в ампуле яйцевода. Животные находились в стандартных условиях кормления и содержания [5]. Для получения в качестве реципиентов псевдобеременных самок с датированным сроком беременности удобно использовать вазектомированных самцов. С этой целью операционный бокс стерилизовали ультрафиолетовым излучением. У животных выбривали операционное поле, обрабатывали 5% раствором йода проводили местную анастезию вдоль будущего разреза. В месте изгиба обоих семяпроводов отпрепарировали проходящие рядом кровеносные сосуды, перевязывали семяпроводы тонким шелком в двух местах и их перерезали. Брюшину зашивали кетгутом матрасным швом, кожу и подкожную клетчатку зашивали шелком. С целью получения зигот самок спаривали на стадии эструса. Для извлечения большого количества предимплантационных эмбрионов была проведена суперовуляция за счет введения гонадотропина PMSG (гонадотропин сыворотки жеребой кобылы) и гормона hCG (человеческий хорионический гонадотропин). Далее животным давали общий наркоз и проводили лапоротомию со вскрытием брюшной полости. Операцию осуществляли путем рассечения вначале кожи, подкожной клетчатки, белой линии апоневроза живота и наконец, пристеночной брюшины. По наличию желтых тел в яичниках определяли количество зародышей в яйцеводах, которые затем промывали буфером PBS с добавлением 5%-го раствора фетальной сыворотки. По окончании операции брюшину зашивали кетгутом, кожу - шелковой нитью. Полученные ранние эмбрионы трансплантировали псевдобеременным самкам, которые предварительно были спарены с вазектомированным самцом или реципиентов обрабатывали гормонально. Трансплантацию проводили операционным путем с учетом желтых тел. Животным внутримышечно вводили антибиотики.

Результаты исследований и обсуждение. Учитывая, что спаривание у этих животных провоцирует овуляцию можно точно определить сроки беременности, а в случае ложной беременности удобно получать синхронизацию сроков беременности при гомотрансплантации ранних эмбрионов. В технологии трансгенеза первым и важным этапом является получение ранних эмбрионов (зиготы, двухбластомерные эмбрионы) хорошего качества. В этот период необходимо провести морфологическую оценку эмбрионов с целью выбраковки аномальных форм развития, таких как неоплодотворенные яйцеклетки, эмбрионы с фрагментацией цитоплазмы, с увеличенным перивителлиновым пространством, с видимыми геномными нарушениями (рис. 1). Применение оптики дифференцианального интерференционного контраста по Номарскому позволило выявить эмбрионы с триплоидным и тетраплоидным набором хромосом.

На первом этапе была проведена гетеротрансплантация. Донором была оплодотворенная самка породы шиншилла, от которой операционным путем было получено 6 зигот хорошего качества. Реципиентом служила оплодотворенная самка белый великан, от которой получили 7 зигот. Этой самке было пересажено 4 эмбриона породы шиншилла и 4 эмбриона от белого великана (с учетом желтых тел). После окрола было получено потомство в виде двух серых крольчат (порода шиншилла) и двух белых (порода белый великан). Таким образом, эффективность гетеротрансплантации составила 50%. В дальнейшем была использована только гомотрансплантация, причем в качестве доноров выступали две группы животных: крольчихи которым проводили суперовуляцию и самки после обычного спаривания. Как показали дальнейшие исследования гормональная суперовуляция позволяет получать большое количество ранних эмбрионов (более 30), однако, среди эмбрионов встречается большое количество неоплодотворенных яйцеклеток и морфологически аномальные эмбрионы. Кроме того, не у каждой крольчихи гормональная стимуляция вызывала эффект суперовуляции, тогда как такие явления у эмбрионов, полученных после обычного спаривания с половозрелых самцов, наблюдались в незначительной степени (табл.1).

Таблица 1. Оценка донорских ранних эмбрионов кроликов

В среднем в первой группе животных получено 8,3 эмбриона на самку, а во второй группе (после суперовуляции) - 19,8. Проведенный морфологический анализ зигот и 2-х бластомерных эмбрионов показал, что в первой группе наблюдали только 3% аномальных эмбрионов, из которых одна яйцеклетка была не оплодотворена, у двух зигот наблюдали увеличенное перивителлиновое пространство и у одного эмбриона фрагментация цитоплазмы. Все остальные эмбрионы были хорошего качества. Анализ эмбрионов кроликов, полученных после суперовуляции, показал другую картину. Более половины из аномальных яйцеклеток оказались неоплодотворенными (55,5%). Три эмбриона были триплоидные, два - тетраплоидные, остальные имели фрагментацию цитоплазмы. Эти результаты убеждают в необходимости тщательного анализа эмбрионов перед трансплантацией.

После детального анализа ранних эмбрионов проводили трансплантацию донорских эмбрионов. При выборе места пересадки учитывали стадию развития эмбрионов и подсчитывали количество желтых тел в яичниках реципиентов. Зиготы и двухбластомерные эмбрионы вводили в ампульную часто яйцевода. Важным моментом является гормональная синхронизация доноров и реципиентов, т.к. только в этом случае после трансплантации можно получить потомство. В таблице 2 представлены результаты пересадки эмбрионов реципиентам.

Таблица 2. Результаты гомотрансплантации ранних эмбрионов кроликов реципинтам

эмбрион трансплантация генетический модифицированный

Таким образом, эффективность трансплантации в группе эмбрионов, полученных после спаривания с самцом, оказалась выше, чем пересадка эмбрионов, полученных после гормональной стимуляции доноров. В первом случае в среднем одному реципиенту было пересажено 10,7 эмбриона, а во втором - 14,1. Возможно, эти различия могут быть связаны как с качеством эмбрионов, так и с разбалансировкой гормонального статуса доноров и реципиентов. Следует отметить, что после микроинъекции генов в ранние эмбрионы (для получения трансгенных особей), эффективность трансплантации падает до 9-15%, при этом наряду с живыми крольчатами рождаются мертворожденные [3]. Довольно часто используют репортерные гены для селекции эмбрионов [6], что повышает эффективность трансплантации и процесса трансгенеза. Следует также учитывать, что экспрессия репортерных генов не нарушает развитие клеток и их физиологию. Тем не менее, довольно часто можно наблюдать мозаицизм интеграции и экспрессии трансгенов, когда не во всех клетках организма интегрированы трансгены [7]. В настоящее время прогресс в области соматического клонирования, основанного за счет пересадки ядер, позволяет получать модифицированные геномы без эффекта мозаицизма [8]. Кролики издавна используются как биомедицинские модели для изучения репродуктивных нарушений, процессов оплодотворения, органогенеза и многих других заболеваний у человека [9]. В дальнейшем представленная методика получения ранних эмбрионов была использована в наших исследования для получения трансгенных кроликов [3].

Библиографический список

1. Никиткина Е.В., Пестунович Е.М. Егиазарян А.В. Актуальность трансплантации эмбрионов. // Сельскохозяйственные вести. 2011. №2. С.2-3.

2. The Biology of the Laboratory Rabbit. Ed.by S.H. Weisbroth, R.E. Flatt, A.L. Kraus. Acad. Press. INC. New York, San Francisco. 1974.

3. Козикова Л.В. Трансгенные животные. СПб.: Проспект Науки. 2017.

4. Li F., Li Y., Liu H., Zhang H., Liu C., Zhang X.,Dou H., Yang W., Du Y. Production of GHR double-allelic knockout Bama pig by TALENs and handmade cloning. //Yi Chuan. 2014. V.36. №9. P.903-911.

5. Сысоев В.С., Александров В.Н. Кролиководство. М. 1975.Агропромиздат.

6. Duszewska A.M., Cybulska M., Korwin-Kossakowski M., Was B., Poloszynowicz J., Wicinska K., Rosochacki S.J., Kozikova L. The use of green fluorescent protein (GFP) to select bovin embryos. // J. of Animal and Feed Sciences 2003. T.12. №1. C.71-81.

7. Makarova IV, Kazakov AA, Makarova AV, Khaidarova NV, Kozikova LV, Nenasheva V.V., Gening L.V., Tarantul V., Andreeva L.E. Transient expression and activity of human DNA polymerase iota in loach embryos. //Biotechnol Lett. 2012. V.34. №2. Р. 205-12.

8. Xiujing Feng, Shaoxian Cao, Huili Wang., Chunhua Meng, Jingxin Li et al. . Production of Transgenic dairy goat expressing human a-lactolbumin by somatic cell nuclear transfer. //Transgenic Res. 2015. V.24. P. 365-372.

9. Bernd Pьschel, Nathalie Daniel, Eva Bitzer, Martin Blum,Jean-Paul Renard and Christoph Viebahn. The Rabbit (Oryctolagus cuniculus): a model for mammalian reproduction and early embryology. Cold Spring Harb Protoc; published online January 27, 2010. doi:10.1101/pdb.emo139

Размещено на Allbest.ru