Разработка мультиплексных наборов SSR-маркеров для генотипирования сортов абрикоса

Размещено на http://www.allbest.ru/

Разработка мультиплексных наборов SSR-маркеров для генотипирования сортов абрикоса

SSR-маркеры, в настоящее время являются наиболее востребованным методом генотипирования плодовых культур, в том числе и косточковых. Перспективность использования SSR-генотипирования в исследовательской практике во многом обусловлена целым перечнем полезных в практике характеристик данного метода.

Одна из наиболее важных положительных характеристик SSR-маркирования это высокая степень воспроизводимости результатов генотипирования, позволяющая проводить сопоставление ДНК-фингерпринтов полученных в разных лабораториях. Этот факт делает данный метод более надежным и стабильным источником информации, нежели такие методы ДНК-маркирования к RAPD, ISSR, AFLP, IRAP.

Во многом это связано с высокой восприимчивостью перечисленных мультилокусных типов ДНК-маркеров к изменениям условий проведения ПЦР. В связи с этим сопоставление ДНК-фингерпринтов полученных с применением данных методов в различных лабораториях сильно затруднено и зачастую на практике не осуществляется. Применение же SSR маркеров позволяет избежать этого при оценке результатов анализа. В ходе установления размера амплифицированных областей SSR-маркеров ошибки в оценке данных незначительны и зависят от точности метода визуализации результатов ПЦР. Применение наиболее эффективных методов для этих целей, включая анализ с использованием автоматических генетических анализаторов, позволяет получить наиболее точные и достоверные данные.

Высокий уровень полиморфизма является также одним из важных преимуществ микросателлитных ДНК-маркеров. Он обусловлен тем, что мутации происходят в микросателлитах на порядок чаще, чем в структурных генах, что связано с уникальным процессом вставки и выпадения тандемных повторов в микросателлитных последовательностях. Благодаря данной особенности, для большинства микросателлитных локусов свойственно значительное аллельное разнообразие. Кодоминантность является еще одной ключевой характеристикой SSR-маркеров. Для проверки достоверности родословной с помощью ДНК-маркеров это немаловажно, так как позволяет отслеживать вклад каждого и родителей в генотип потомка [1].

В настоящее время актуальной задачей в прикладной генетике растений остается разработка микросателлитных маркеров и апробация их на близкородственных видов для проведения дальнейших генетических исследований.

В первых работах, направленных на изучение генетического разнообразия абрикоса с применением SSR-маркеров [2; 3; 4], были задействованы наборы маркеров, предназначенных главным образом для персика и других видов Prunus [5; 6; 7]. В целом, 50-60% SSR-маркеров, разработанных для персика дали успешную амплификацию [5; 3] и выявили значительные уровни генетическое разнообразие в абрикосе [2; 4; 3; 8]. Позднее были получены наборы праймеров с использованием информации о последовательности абрикоса [9; 10]. Первая значительная работа по генотипированию крупной выборки сортов была осуществлена коллективом Maghuly et al. [11]. Данный исследовательский коллектив представил результаты, полученные с применением 10 полиморфных абрикосовых SSR-маркеров на коллекции из 133 сортов абрикоса. Так же оценка генетического разнообразия абрикоса и характеристики генплазмы абрикоса были выполнены с использованием молекулярных маркеров и в других работах [8; 12, 13; 14; 15]. Крупное исследование, в ходе которого было изучено генетическое разнообразие 183 генотипов абрикоса североафриканского происхождения (Алжир, Марокко и Тунис) с использованием 24 ядерных микросателлитных маркеров, было проведено в 2013 году [16].

Очевидно, что выявление эффективных микросателлитных маркеров для абрикоса обыкновенного, из перечня ДНК- маркеров, разработанных для других видов рода Prunus, является эффективным подходом в исследовательской практике. Это позволяет сократить время и финансовые издержки, необходимые для идентификации микросателлитных локусов в геноме de novo и создания эффективных праймерных пар, позволяющих получать продукты амплификации с данных SSR-последовательностей.

Исходя из актуальности вопроса пополнения базы эффективных SSR маркеров для использования в генетических исследования абрикоса обыкновенного, нами были поставлены следующие задачи:

- Провести апробацию SSR-маркеры, разработанные ранее для абрикоса сибирского и миндаля обыкновенного, на представителях вида абрикос обыкновенный;

- Сформировать мультиплексные наборы SSR-маркеров, позволяющие генотипировать образцы абрикоса обыкновенного одновременно по трем-четырем SSR-маркерам, в рамках одной ПЦР.

Материал и методы исследования Проведена апробация микросателлитных маркеров на трех сортах абрикоса, относящихся к разным эколого-географическим группам: Шалах (Ирано-Кавказская группа), Изцюй (Китайская группа), Краснощекий (Европейская группа). Экстракцию проб ДНК проводили методом ЦТАБ [17] из тканей листа в фазу распускания. Для осуществления ПЦР был произведен подбор оптимальных параметров, таких как концентрация компонентов и температурного режима реакции. В результате был определен следующий оптимальный протокол: в общий объем ПЦР смеси 25 µL входили 50 нг ДНК, 0,25мМ dNTPs, 0,2 µМ каждого праймера; 2,5 µL 10-х буфера (ООО «Сибэнзим»), 1 u Taq-полимеразы. Проводилась ПЦР по следующей программе: начальная денатурации - 3 минут при 94єС, далее 35 циклов: денатурация при 94єС - 45 секунд, этап отжига при 58єС - 45 секунд, элонгация при 72єС - 45 секунд; заключительный этап - элонгация 4 минуты 30 секунд при 72єС. На приборе ABI prism 3130 была осуществлена оценка размеров ПЦР продуктов. Полученные результаты были обработаны в программе Gene Mapper 4.1. В работе апробировали 16 SSR-маркеров, разработанных на абрикосе сибирском: A3-72, A1-63, H2-22, A3-7-1, H2-5, A1-7, A3-9, H2-45 и на миндале обыкновенном: PdUnchar2, PdSLD1, PdGMGT1, PdTrTFGT1, PdUnchar2, PdSLD1, PdGMGT1, PdTrTFGT1 [19, 20].

Результаты. При формировании мультиплексных наборов, размер ПЦР-продуктов SSR-маркеров является базовой характеристикой, учет которой позволяет подобрать оптимальные комбинации маркеров. В мультиплексный набор желательно включать микросателлитные маркеры с различающимися по размерам диапазонами аллелей. В ситуации, когда продукты ДНК-амплификации включенные в мультиплексную смесь обладают сходными размерами, достоверная интерпретация полученных результатов затруднена из-за эффекта наложения сигналов от флоурофорных меток. Единая температура отжига праймеров, маркеров из мультиплексного набора, является необходимым условием качественного прохождения ПЦР в мультиплексной смеси.

Каждый SSR-маркер, включенный в мультиплексный набор, имеет характерный флуоресцентный краситель: 6-карбоксиродамин (R6G), карбоксифлуоресцеин (FAM), тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA), карбокси-Х-родамин (ROX), с разной длиной волн флуоресценции. Каждый из выше приведенных флуоресцентных красителей обладает своим уникальным оптическим спектром, отличным от остальных красителей задействованных в наборе. В работе были применены 16 SSR маркеров, которые были сформированы в 4 мультиплексных набора каждый по четыре маркера. В первый мультиплексный набор вошли маркеры A3-72, A1-63, H2-22, A3-7-1; ко второму мультиплексному набору отнесены маркеры H2-5 A1-7 A3-9 H2-45; третий мультиплексный набор включает SSR маркеры PdUnchar2, PdSLD1, PdGMGT1, PdTrTFGT1; четвертый мультиплексный набор состоит из маркеров PdBSL3, PdshkC, PdPER, PdUnchar3. Перечисленные мультиплексные наборы отражены в таблице 1.

Для всех SSR-маркеров, приведенных в таблице, указана информация о типе флуоресцентного красителя и диапазоне размеров продуктов амплификации, полученных в нашей работе. Видно, что в большинстве случаев диапазоны размеров ПЦР продуктов по отдельным маркерам, входящим в один мультиплексный набор, не перекрывается. Это обеспечивает надежную интерпретацию данных по генотипированию образцов. Только по одному маркеру (PdUnchar2) из общей выборки не прошла амплификация.

Таблица 1 Мультиплексные наборы SSR маркеров.

абрикос маркер сорт

Пять маркеров дали мономорфный продукт амплификации по трем сортам абрикоса (A3-72, H2-5, PdTrTFGT1, PdBSL3, PdshkC). Однако, можно предположить, что данные маркеры могут проявить себя как полиморфные в случае расширения количества исследованных сортов.

Рисунок 1 Генотипирование сорта Шалах с применением мультиплексной смесь №1 включающей маркеры A3-72, A1-63, H2-22, A3-7-1.

На представленной электрофореграмме видно, что для всех микросателлитных маркеров, включенных в данный мультиплексный набор, идентифицируются ПЦР-продукты, которые не перекрываются по размерам. Они отображенные в виде пиков характерных цветов. Для всех трех сортов в ходе генотипирования были получены достоверно идентифицируемые ПЦР-продукты, что определено наличием четки, дискретных пиков на электрофореграмме. Видно, что по маркеру A1-63 детектировано одновременно два пика. Это соответствует гетерозиготности по данному микросателлитному локусу.

Как видно из представленных результатов мультиплексного фрагментного анализа, оптимальное сочетание ДНК-маркеров в мультиплексных наборах, а также использование оптимизированных экспериментальных параметров (режим ПЦР - программы, концентрации праймеров, уровень разведения ПЦР - проб при проведении денатурации в ходе пробоподготовки для выполнения анализа на приборе ABIprism3130), позволило безошибочно идентифицировать целевые пики на электрофореграммах. Очевидно, что применение мультиплексного анализа дало возможность провести генотипирование одновременно по нескольким маркерам.

В ходе работы для сортов-объектов исследования были получены SSR-фингерпринты, представленные в таблице 2. Указан размер амплифицированных фрагментов в парах нуклеотидов. Два одинаковых значения характеризуют гомозиготность по искомому локусу, два разных значения - гетерозиготность.

Таблица 2. SSR-фингерпринты 3 сортов абрикоса по 16 маркерам

Из результатов, представленных в таблице, видно, что каждый сорт обладает уникальным SSR-фингерпринтом.

Таким образом, сформированные и апробированные в работе мультиплексные наборы могут быть в дальнейшем применены в генетических исследованиях абрикоса обыкновенного. О высоком уровне кросс-воспроизводимости микросателлитных ДНК-маркеров, разработанных на виде абрикос сибирский и миндаль обыкновенный, при их использовании для генотипирования вида абрикос обыкновенный свидетельствует то факт, что из 16 апробированных ДНК-маркеров только один не дал амплификацию - PdUnchar2. Это позволяет говорить о перспективности использования такой стратегии поиска новых, информативных SSR-маркеров, перспективных для генотипирования сортов абрикоса. SSR-фингерпринты сортов, полученные в ходе работы, могут быть использованы в дальнейшем при необходимости уточнения родословных сортов, полученных с участием сортов Шалах, Краснощекий и Hong Yu в качестве одной из родительских форм, а также при возникновении спорных вопросов о сортовой принадлежности образцов.

абрикос маркер сорт

Литература

абрикос маркер сорт

1. Глазко В. И. ДНК-технологии в генетике и селекции: Курс лекций / В. И. Глазко, Т. Т. Глазко. // Краснодар: ВНИИ риса 2006 - 399 с.

2 .Hormaza, J.I. Molecular characterization and similarity relationships among apricot (Prunus armeniaca L.) genotypes using simple sequence repeats. Theor. Appl. Genet., 2002. - 104, 321-328.

3. Zhebentyayeva, T.N. Simple sequence repeat (SSR) analysis for assessment of genetic similarity in apricot germplasm. / T.N. Zhebentyayeva, G.L. Reighard, V.M. Gorina et al // Theor. Appl. Genet. 2003. - №106, - P.435-444.

4. Romero, C. Genetic diversity of different apricot geographical groups determined by SSR markers. / C. Romero, A. Pedryc, V. Munoz et al // Genome 2003. - №46, - P.244-252.

5 .Cipriani, G AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach [Prunus persica (L.) Batsch]: isolation, characterisation and cross-species amplification in Prunus. / G. Cipriani, G. Lot, W-G Huang, et al // Theor Appl Genet, - 1999 - №99 P.65-72.

Размещено на Allbest.ru