Диагностические гипериммунные сыворотки представляют собой сыворотки крови животных, систематически иммунизированных бактериальными или вирусными антигенами, содержащие антитела, обладающие строго специфическим действием на бактериальные токсины, патогенные бактерии и вирусы, против которых иммунизировали животных [1].

Существуют различные способы иммунизации лабораторных и сельскохозяйственных животных для постановки серологических реакций и характеристики антител против возбудителей микозов. Стандартная технология получения гипериммунных сывороток включает изготовление антигенов, предварительную грундиммунизацию и гипериммунизацию животных-продуцентов, взятие и обработку крови с последующим выделением сыворотки и её консервацией. Зачастую при изготовлении гипериммунных сывороток применяют антигены, специфическое действие которых усилено адъювантными веществами для активизации иммунного ответа. Адъюванты являются неспецифическими раздражителями и оказывают стимулирующее действие на иммуногенез. В качестве адъювантов могут использоваться гели гидроокиси алюминия, алюминиевые квасцы и другие вещества [2].

Общеизвестна стандартная схема получения специфических сывороток высокого титра от животных, иммунизированных соответствующими культурами патогенных и условно-патогенных грибов, где в качестве антигена для иммунизации служит гомогенная смесь из агаровой культуры гриба в физиологическом растворе. При этом быстрое накопление антител наблюдается при более частом введении антигена (через 3-4 дня), а наиболее высокие титры антител достигаются в результате 2-3 прививочных циклов с 10-15 дневными интервалами между ними [3].

гиперимунная сыворотка трихофития животное

В доступной литературе описаны схемы получения иммунных сывороток для выявления антигенов возбудителей трихофитии крупного рогатого скота внутривенной иммунизацией кроликов убитой и живой культурой грибов Trichophyton faviforme, T. violaceum, Microsporum ferrugineum, Achorion schцnleinii [4]; восьмикратной внутривенной иммунизацией возрастающими дозами вакцины ЛТФ-130 (T. verrucosum), антигеном, приготовленным из T. verrucosum var. autotrophycum, Ментавак (T. mentagrophytes) по Месробеану [5]; иммунизацией кроликов антигенами из эталонных штаммов T. sarkisovii 23, T. verrucosum 18 и T. verrucosum var. autotrophycum 14 [6]. Авторы получали видоспецифичные сыворотки и использовали их для постановки реакции коагглютинации (РКА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции преципитации (РП) в жидкой среде и РДП по Оухтерлони.

Об иммунизации белых мышей и телят с целью получения противотрихофитийных гипериммунных сывороток (ГИС) для исследования в РА и РСК сообщает Жарков И.И. ГИС получали иммунизацией животных в левое бедро вакциной ЛТФ-130, вакциной ТФ-130 и мицелиальным антигеном живым в дозе 0,1 мл, и при постановке РА выявляли титры антител в сыворотке крови мышей до 1: 5 - 1: 80, а у телят от 1: 80 до 1: 320 [7].

Следует отметить, что все описанные способы получения гипериммунной сыворотки применяются в научно-исследовательских целях: для выявления антигена в серологических реакциях, для иммуногенной характеристики вакцинных препаратов. К сожалению, в таком случае ГИС получают в небольших количествах; кроме того, при использовании ослабленных вакцинных штаммов сыворотки недостаточно эффективны, а при использовании живого мицелиального антигена - биологически небезопасны.

Целью нашей работы является разработка способа получения гипериммунных сывороток в больших масштабах для использования в серологической диагностике трихофитии сельскохозяйственных животных в качестве положительного контроля.

Материалы и методы. В качестве антигена для гипериммунизации использовали ЛТФ-130 - вакцинный препарат против трихофитии крупного рогатого скота (производства ФГУП "Ставропольская биофабрика", г. Ставрополь), который разводили стерильным физиологическим раствором из расчета 50 мл растворителя на 10 доз вакцины.

В качестве животных продуцентов использовали естественно восприимчивых гомологичных животных - здоровых телят черно пестрой породы. Животных предварительно выдерживали в карантине и исследовали на инфекционные заболевания, согласно действующим "Основным ветеринарным правилам при заготовке животных в биологической промышленности".

Гипериммунизацию проводили четырехкратным внутримышечным введением вакцинного препарата ЛТФ-130 в дозе 5 мл в объеме 1-2-3-4 дозы с интервалом 14 дней с одновременным введением левомизола в качестве адъюванта.

Гипериммунную сыворотку тестировали на возможность выявления специфических антител к возбудителю трихофитии крупного рогатого скота в реакции микроагглютинации, реакции гемагглютинации, реакции преципитации и иммуноферментном анализе, постановку которых осуществляли по общепринятой методике [8].

Результаты исследований. Грундиммунизацию осуществляли путем введения антигена в области крупа двукратно в дозе 5 мл в возрасте 2 месяцев с интервалом 14 дней (согласно наставления по применению вакцины ЛТФ-130 для профилактики и лечения трихофитии (стригущего лишая) крупного рогатого скота).

При проведении гипериммунизации телят черно пестрой породы возраста 6-ти месяцев, массой 300-320 кг иммунизировали антигеном, который вводили четырехкратно внутримышечно в область крупа с интервалом в 14 дней с использованием в качестве адъюванта левомизола. Через 14 дней после последнего введения антигена проводили взятие крови в дозе 10 мл/кг массы животного. Перед производственным крововзятием, за 2-3 дня до этого, проводили пробное крововзятие для определения титра сыворотки.

После крововзятия бутыли с кровью ставили в термостат на 1-2 часа при температуре 37°С, затем при комнатной температуре - на 3-4 часа (для отделения сыворотки) и помещали в холодильник при температуре 4°С на 12-16 часов.

На 2 сутки проводили слив сыворотки, и её центрифугирование при 3000 об/мин в течение 10 минут. Сыворотку консервировали 5 % -ным раствором фенола в соотношении 1: 10 и ставили на 10 дней при температуре 4°С для отстоя.

На следующем этапе проводили контроль физических свойств гипериммунной сыворотки и биологический контроль.

При контроле физических свойств ГИС установлено: полученная гипериммунная сыворотка на цвет желтоватая, слегка опалесцирующая жидкость, при хранении возможно образование незначительного беловатого осадка, легко разбивающегося при встряхивании.

Изготовленная серия сыворотки должна быть стерильной, активной и специфичной в различных серотестах при выявлении специфических антител Trichophyton verrucosum. Для проведения контроля брали пробы сыворотки из каждой бутыли и подвергали проверке на стерильность путем высевов на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро и активность в РМА, РГА, РИД и ИФА.

При проведении контроля на стерильность делали посевы сыворотки из каждой бутыли на указанные выше среды. Чашки Петри со средами МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом устанавливали в термостат при 37°С, со средой Сабуро - при 28°С. Было установлено, что сыворотка является стерильной, т.к. отсуствовал рост бактериальной и грибковой флоры на всех средах в течение наблюдения, которое составило 10 суток.

В дальнейшей работе изучали свойства гипериммунной сыворотки и оценивали её активность в различных серологических реакциях: РА в микроварианте (РМА), РИД по Оухтерлони, РГА с эритроцитами кролика и барана и непрямом варианте ТИФА.

Наличие агглютинирующих свойств у гипериммунной сыворотки выявляли в пластинчатой реакции агглютинации. Реакцию проводили на стекле путем смешивания капли исследуемой сыворотки и капли антигена. При покачивании стекла круговыми движениями происходит агрегирование антигена и наступает просветление жидкости, которое отметили через 1-2 минуты с начала постановки реакции.

Активность специфических агглютинирующих антител изучали в реакции микроагглютинации. При тестировании ГИС в РМА с корпускулярным антигеном, в качестве которого использовали цельные клетки Trichophyton verrucosum var. faviforme 130 (раствор вакцины ЛТФ-130 с концентрацией клеток 100 тыс. кл. /мл в 1 мл физиологического раствора) отмечали агглютинацию в 3-4 креста при разведении сыворотки до 1: 256.

При тестировании ГИС в РГА эритроцитами кролика и барана выявили наличие гемагглютинирующей активности. Наиболее выражен феномен гемагглютинации при применении эритроцитов кролика. При постановке РГА характерный зонтик на 4 креста регистрировали при разведении гипериммунной сыворотки до 1: 128 с эритроцитами барана, до 1: 32 768 - с эритроцитами кролика.

Наличие преципитирующих свойств выявляли в реакции иммунодиффузии в агаровом геле. При постановке РИД по Оухтерлони в сыворотке отмечали наличие преципитирующих антител, при этом регистрировали отчетливо выраженные две линии преципитации напротив родственного антигена.

При постановке непрямого варианта ИФА выявлена высокая активность гипериммунной сыворотки, которая позволила выявить трихофитийные антигены при её разведении до 1: 102 400 - 1: 204 800.

Таким образом, разведение гипериммунной сыворотки, позволяющее выявлять гомологичный антиген составил в РМА 1: 256. В РИД наличие специфичного антигена выявляют при разведении ГИС до 1: 16, напротив остальных антигенов линий преципитации не образуется. В непрямом варианте иммуноферментного анализа гипериммунная сыворотка специфически связывается с гомологичным антигеном, образую комплекс антиген + ГИС + антивидовой конъюгат + субстрат, легко выявляемый по наличию желто-коричневого окрашивания при разведении сыворотки до 1: 204 800. С остальными антигенами регистрируют отрицательный результат.

После проведения контроля сыворотку разливали в стерильные пенициллиновые флаконы по 1 мл, укупоривали резиновыми пробками и закатывали металлическими крышками.

Выводы