Получение антигенов различной химической природы из дерматомицета T. sarkisovii

Размещено на http://www.allbest.ru/

Казахский агротехнический университет имени С. Сейфуллина

ЗКФ ТОО Казахский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства

ГУ «Национальный центр мониторинга, референции, лабораторной диагностики и методологии в ветеринарии» МСХ РК

Получение антигенов различной химической природы из дерматомицета T. sarkisovii

Е.В. Кухар, кандидат вет. наук, доцент

Б. А. Курманов, доктор вет. наук

Н. Х. Жакупбаев, кандидат вет. наук

М. Е. Пак, соискатель

Аннотация

антиген дерматомицет верблюд трихофития

В статье раскрывается ход работы по получению и характеристике полных, полисахаридных и белковых антигенов из дерматомицета T. sarkisovii - возбудителя трихофитии верблюдов. Выделены антигены по методу Westphal-Jann (1965), по методу Табатабай (1979), по Буавену-Месробеану и аутогидролизом. Полученные антигены отличаются наличием преципитирующих свойств и достаточной активностью в непрямом варианте иммуноферментного анализа (ИФА).

Annotation

The work process on reception and characteristic of full, polisaharids and albuminous antigenes from dermatomicet T. sarkisovii - the activator of Trichophyton at camels is revealed in the article. Antigenes according to Westphal-Jann's method (1965), Tabatabaj's method (1979), Buavenu-Mesrobeanu and autogedrolis are allocated. The received antigenes differ in presence of precipiti properties and sufficient activity in indirect variant of IFA.

Основная часть

Трихофития верблюдов - инфекционное заболевание, наносящее огромный экономический ущерб развитию этой отрасли животноводства в Республике Казахстан. В верблюдоводстве дерматофития наносит весомый ущерб, вызывая истощение и смертельные исходы больных верблюжат. Верблюды с клиникой трихофитии отстают в росте и развитии, снижают производство молока, мяса и привес, ухудшается качество выделываемых шкур, нарушается племенная работа и планы продажи верблюдов, ценная верблюжья шерсть утилизируется [1].

Согласно эпизоотическим данным, в отдельных областях, таких как Западно-Казахстанская, Мангистауская, Актюбинская областях заболеваемость составляет от 20 до 36 % с преобладанием в этиологической структуре возбудителя трихофитии T. sarkisovii. Клиническая диагностика и борьба с заболеванием затруднены вследствие густого шерстного покрова у животных, особенностей содержания, отсутствием лечебно-профилактических препаратов [2]. Соответственно, весьма актуальной остается проблема своевременного выявления трихофитии верблюдов, что требует наличия активных и специфичных компонентов для постановки серологических реакций, в том числе антигенных препаратов.

Целью работы является приготовление и характеристика антигенов дерматомицета T. sarkisovii различной химической природы.

Материалы и методы. В работе использованы биомасса дерматофита T. sarkisovii, выращенная на жидкой среде Сабуро погруженным способом [3], стеклянная посуда и реактивы для получения антигенов, соответствующее оборудование.

Антигены различной химической природы получали: полисахаридные - по методу Westphal и Jann (1965) [4]; белковые - по методу Табатабай (1979) в нашей модификации [5]; полные - по Буавену-Месробеану [6]; полисахариды - аутогидролизом [7].

Определение концентрации белка проводили по методу Бредфорда и концентрации углеводов - серно-фенольным методом по Молишу [8, 9].

Результаты исследований

Полученная ранее [3] в результате глубинного культивирования и инактивированная автоклавированием биомасса дерматомицетов отделялась от жидкой питательной среды фильтрованием через бумажный фильтр и трижды отмывалась физиологическим раствором с целью максимального освобождения от культуральной жидкости. Сырой мицелий взвешивался для определения выхода биомассы со 100 мл питательной среды. Выход биомассы гриба T. sarkisovii с каждых 100 мл среды при глубинном культивировании в колбах на 250 мл составил в каждом конкретном случае: 10,0 г; 14,0 г; 15,8 г; 12,0 г; 13,8 г; а с каждых 200 мл при культивировании в колбах на 500 мл - 22,4 и 47,8 г. Анализ выхода биомассы с колб на 250 мл показал, что в среднем на каждые 100 мл питательной среды можно получить 13,12 ± 1,7 г.

Всего было получено 135,8 г сырого мицелия. В среднем выход мицелиальной массы составляет 15,1 ± 4,07 г со 100 мл питательной среды. Более высокие средние показатели выхода урожая биомассы гриба в целом связаны с высоким выходом мицелия при культивировании в колбах бульшего объема (на 500 мл), который составил от 22,4 до 47,9 г.

На следующем этапе из отмытой биомассы гриба получали антигены по методам L.Tabatabai (1979) и Westphal О. и Jann К. (1965), Буавену-Месробеану. Очищенные полисахариды получали из полисахаридного антигена по Westphal О. и Jann К. (1965) аутогидролизом.

Получали полисахаридные антигены по методу Westphal и Jann: отфильтрованную грибную массу тщательно суспендировали в дистиллированной воде при t? + 65-68 °С, выдерживали при температуре + 68 °С в течение 30 минут, затем добавляли 90 % фенол до 45 % концентрации. Снова выдерживали смесь в течение 30 минут, периодически встряхивая, и охлаждали до + 4 °С. Охлажденную смесь центрифугировали при 3500 оборотах 15 мин, отбирали верхний слой (без промежуточной фазы), т.к. полисахарид переходит в жидкую водную фазу. Добавляли два объёма этанола (95°), охлажденного до минус 20 °С и тщательно перемешивали.

При добавлении этанола к водной фазе отмечали переход полисахарида их растворимого состояния в коллоидное, что проявлялось в виде появления гелеобразного сгустка (рисунок 1), который в дальнейшем исчезал при тщательном перемешивании водной и спиртовой фазы.

Затем смесь выдерживали 16-18 часов при минус 60 °С, после чего осаждали полисахарид центрифугированием при 3500 оборотов в течение 25 минут. Этанол сливали, осадок подсушивали в 1 мл дистиллированной воды. Нерастворимые частицы осаждали с помощью низкоскоростного центрифугирования 2000 оборотов в течение 10 минут.

На рисунке показано образование геля полисахарида при добавлении двойного объема 96є спирта в водную фазу супернатанта

Рисунок 1 Получение антигена по методу Westphal-Jann (1965)

Из полисахаридного антигена (по методу Westphal и Jann) с концентрацией 0,750 мг/мл получали очищенные полисахариды аутогидролизом в запаянных стеклянных ампулах при 100 °С в течение 4 ч.

При получении полных антигенов по методу Буавену-Месробеану клетки грибов, выращенных на жидких питательных средах, отмывали от среды физиологическим раствором при трехкратном взбалтывании и отстаивании, подсушивали в термостате до получения сухой массы колоний. Одну часть грибной массы заливали 20 частями 0,5 % раствора ТХУ. Смесь выдерживали в течение 18 часов при 4 С, периодически встряхивая, затем центрифугировали. Надосадочную жидкость собирали, нейтрализовали 0,25 %-ным раствором NaOH до рН 7,2. К этой жидкости прибавляли 4Чкратный объём этилового спирта и выдерживали до выпадения хлопьев полисахарида. Антиген осаждали центрифугированием при 3000 оборотов в течение 30 минут. Осадок ресуспендировали в 1 см³ дистиллированной воды.

Выделение растворимых белков клеточной стенки по методу L Tabatabai (1975) проводили экстракцией цитратным буфером биомассы гриба T. sarkisovii после обработки 45 % фенолом, которая проводилась ранее в целях выделения полисахаридов методом Westphal-Jann (рисунок 2). Биомассу предварительно трижды отмывали от фенола в дистиллированной воде. Белки экстрагировали при непрерывном перемешивании и дальнейшем центрифугировании через сутки. Полученный супернатант центрифугировали повторно 20 мин при 3000 об/мин.

Очищали антигены методами диализа, низкоскоростного центрифугирования, гель-фильтрационной хроматографии на сефадексе G-75.

Низкоскоростное центрифугирование, для удаления осадка разрушенных клеток и примесей, во всех случаях проводили при 2000 об./мин в течение 30 минут. Диализ проводили в течение 24 часов в дистиллированной воде при температуре 4 °С с целью удаления из растворов антигенов трихлоруксусной кислоты, фенола и других реактивов, использованных при их получении, а также иных низкомолекулярных веществ.

Рисунок 2 Биомасса дерматомицета T. sarkisovii после выделения поверхностных полисахаридов 45 % фенолом

При хроматографической очистке белкового и полисахаридных антигенов дерматомицета компоненты антигенных растворов разделялись на две фракции, причем выход первой фракции регистрировался сразу за свободным объёмом колонки, а выход второй фракции - через два свободных объема сразу после выхода первой фракции.

Стандартизировали антигены по содержанию основного вещества (белковые антигены - по белку, полисахаридные - по концентрации углеводов). Концентрацию белков определяли по методу Бредфорда, углеводов - по Молишу. Учет результатов проводили визуально (таблица 1).

Следует отметить, что монокомпонентный антиген получен только в одном случае - при дальнейшей обработке полисахаридов клеточной стенки T. sarkisovii, выделенных методом Вестфаль-Яна, аутогидролизом, во время которого, по-видимому, происходит полная денатурация белка и переход его в нерастворимое состояние.

Таблица 1

Характеристика антигенов дерматомицета T. sarkisovii

Как видно из таблицы 1, наибольшая концентрация углеводов содержится в полисахаридных антигенах, полученных по методу Вестфаль-Яна, наибольшая концентрация белка - в белковых антигенах, полученных по методу Табатабай. Концентрация белков и углеводов в достаточной мере характеризует полученные антигены как полисахаридный (метод Вестфаль-Яна) и белковый (метод Табатабай).

Полученные антигены исследовали в реакции иммунодиффузии (РИД) с сыворотками крови верблюдов, полученных от здоровых верблюжат и от верблюдов с клиническими признаками трихофитии, доставленными из различных хозяйств Западно-Казахстанской области. Сыворотки крови верблюдов предварительно протестированы в реакции агглютинации (РА) на наличие титров специфических антител. По результатам РА отобраны явно отрицательная и явно положительная сыворотки, которые были использованы в качестве положительного и отрицательного контроля в дальнейшей работе.

Постановку РИД осуществляли по O. Оuchterlony (1958) на 1 % агаре. Учет результатов реакции проводили через 24-48-72 часа.

По результатам РИД установлено наличие преципитирующих свойств у полисахаридных антигенов, полученных по методу Westphal-Jann и по Буавену-Месробеану, что регистрировалось в виде явно выраженной линии преципитации между антигеном и положительной сывороткой (рисунок 3). У белкового антигена дерматомицета наличие преципитирующих свойств в реакции преципитации (РП) выражены слабее, линия преципитации еле заметна. Следует отметить, что линия преципитации у неочищенных антигенов выражена слабее, чем у антигенов, очищенных методом диализа. Считаем, что отсутствие активности в РИД у белкового антигена можно объяснить низким содержанием полисахарида, обеспечивающим антигенность полученных компонентов клеточной стенки грибов, т.к. именно они являются антигенными детерминантами у дерматомицетов, хотя согласно литературным данным, белки микроорганизмов обладают более выраженными антигенными и иммуногенными свойствами.

Рисунок 3 Результаты тестирования полисахаридного антигена по Westphal-Jann (А) и полного антигена по Буавену-Месробеану (Б) в РИД с сыворотками крови верблюдов

В дальнейшей работе проводили изучение активности белкового и полисахаридного антигенов, полученных по методу L. Tabatabai (1975) и по методу Westphal-Jann, в непрямом варианте ИФА.

Полученными антигенами иммунизировали мышей по методу Фридляндской И. И. Для этого были подобраны по методу пар-аналогов 4 белые мышки, иммунизированные по следующей схеме: в 1 день 100 мкл антигена + 100 мкл полного адъюванта Фрейнда, на 7 день 100 мкл антигена + 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда, на 11, 12, 13 дни вводили по 100 мкл антигена + 100 мкл физиологического раствора. На 17 сутки иммунизации отбирали сыворотки крови у иммунизированных мышей. Контроль активности выработанного иммунного ответа проверяли в непрямом варианте иммуноферментного анализа.

Средний титр антител в крови мышей иммунизированных белковым антигеном составил 1:1400 ± 0,38, средний титр антител в крови мышей, иммунизированных полисахаридным антигеном Westphal-Jann, составил 1:3200 ± 0,5.

Анализ результатов тестирования активности и специфичности полисахаридного антигена против сывороток крови белых мышей, иммунизированных полисахаридным антигеном по Westphal О., Jann K., показал, что полисахаридные антигены грибов T. sarkisovii обладают достаточной активностью, но слабой специфичностью, вступая в перекрестную реакцию с родственными антителами, хотя и в невысоких титрах (до 1:400). Полученные результаты можно объяснить особенностями строения клеточной стенки грибов, состоящей в основном из полисахаридов, которые входят в состав клеточных стенок представителей различных видов, родов и даже семейств микромицетов.

Белки дерматомицета имеют меньшую активность в ИФА, а их специфичность аналогична полисахаридным антигенам, что также вполне объяснимо, т.к. они связаны с полисахаридами и входят в состав комплексов полисахарид-белок в виде пептидогликанов, галактоманнана и т.д.

Таким образом, в результате исследований нами отработана методика получения антигенов различной химической природы из дерматомицетa T. sarkisovii, определена концентрация белка и углеводов в полученных антигенах, выявлена достаточная антигенная активность и специфичность белковых и полисахаридных препаратов дерматофита - возбудителя трихофитии верблюдов, что позволяет надеяться на возможность их использования в качестве антигенов-диагностикума в иммуноферментном анализе и других серологических реакциях.

Литература

1. Саркисов, А. Х. Победа над трихофитией / А. Х. Саркисов. В кн.: Наука и человечество, 1984: Доступно и точно о главном в мировой науке. Междунар. ежегодник - М.: Знание. 1984. С. 142-152.

2. Толеутаева, С. Т. Трихофития животных и методы борьбы с ней в Республике Казахстан / С. Т. Толеутаева: автореф. … докт. вет. наук. 16.00.03. Алматы: КазНИВИ. 2008. 48 с.

3. Пак, М. Е. Технологические параметры получения биомассы дерматомицетов для изготовления антигенов-диагностикумов при трихофитии верблюдов / М. Е. Пак, Ш. Ж. Турсункулов // Вестник науки КазАТУ им. С. Сейфуллина. Спец. выпуск (мат. межд. конф.) - Астана. 2008. С. 282-291.

4. Кухар, Е. А. Получение клеточно-ассоциированного поверхностного липополисахаридного антигена гриба Trichophyton sarkisovii - возбудителя трихофитии верблюдов / Е. А. Кухар, К. К. Муканов, Б. К. Сейткасымов // Мат. научно-практ. конф. АкмолГМА. Астана. 1998. С. 189-193.

5. С?раншиев, Ж.?. Brucella-ны? сырт?ы мембрана белоктарын сиыр бруцеллезін балауда ?олдану / Ж. ?. С?раншиев. Вет. ?ыл. кан.... диссертациясы. Астана ?.2003 ж. Б. 115.

6. Курасова, В. В. Методы исследования в ветеринарной микологии / В. В. Курасова, В. В. Костин, Л. С. Малиновская. М.: Колос. 1971. с. 312.

7. Командрова, Н. А. Строение О-специфической полисахаридной цепи липополисахарида Yersinia pseudotuberculosis серовара VII. / Н. А. Командрова, Р. П. Горшкова, В. А. Зубков и др. // Биоорг. химия. Т. 15. 1989. № 1. С. 104-110.

8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive mehtod for the quantitation of microgram quantities of protein utilising the principle of protein-due binding / M. M. Bradford. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

9. Методы общей бактериологии. / Под ред. Ф. Герхардта. Т. 2. Москва.: Мир. 1984. С. 221-334.

Размещено на Allbest.ru