Клональное размножение растений красной малины (Rubusidaeus L.) in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Клональное размножение растений красной малины (Rubusidaeus L.) in vitro

Оразбаева Г.К.

Аннотация

Клональное размножение растений красной малины (Rubusidaeus L.) in vitro

Оразбаева Г.К., магистр, с.н.с., Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина, e-mail: gulzadao@bk.ru.

На севере Казахстана освоение технологии клонального размножения малины красной in vitro, имеет большое значение в плане создания высококачественного посадочного материала для промышленного садоводства.

В данной работе рассмотрены и оптимизированы основные этапы клонального размножения in vitro растений красной малины сортов - Новость Кузьмина и Барнаульская. Предложен эффективный способ стерилизации побегов данной культуры при введении эксплантов in vitro. Для микроклонального размножения и регенерации растений из меристем изучаемых сортов малины подобраны питательные среды Мурасиге и Скуг. Для микропобегов красной малины в условиях in vitro изучена корнеобразующая способность. Подобран оптимальный субстрат на этапе адаптации пробирочных растений малины к нестерильным условиям.

Ключевые слова: малина, in vitro, меристема, микроклональное размножение, укоренение, адаптация, субстрат.

Введение

Для того чтобы получить высококачественный посадочный материал свободный от вирусных, грибных и бактериальных заболеваний применяется клональное размножение растений плодовых и ягодных культур in vitro. У трудно размножаемых в обычных условиях видов растений, при использовании данного способа размножения имеется реальная возможность производить в больших количествах вегетативное потомство [1-7]. Это особенно актуально в отношении ремонтантных сортов малины, полученных с использованием межвидовой и внутривидовой гибридизации, имеющих низкие коэффициенты размножения при традиционном вегетативном размножении из-за малого образования корневой поросли [8].

Клональное микроразмножение малины включает в себя несколько этапов: введение эксплантов в культуру, собственно микроразмножение, укоренение растений in vitro и адаптацию размножаемых растений к нестерильным условиям произрастания.

Данные исследования направлены в основном на освоение и оптимизацию существующих методик микроклонального размножения растений малины красной (Rubusidaeus L.)^* на искусственно питательных средах.

Материалы и методы исследования. Растения сортов малины красной - Барнаульская и Новость Кузьмина, послужили исходным материалом для проведения исследований. По общепринятым методикам осуществляли приготовление питательных сред и культивирование растений данных сортов in vitro [3,9] Минеральную основу по прописи Мурасиге-Скуг использовали в качестве питательной среды [12].

На стандартную, искусственную, агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуг (МС), в состав которой были включены 0,1 мг/л 6-БАП и 0,2 мг/л ГК переносили изолированные меристемы растений красной малины [10].

С помощью бинокулярного микроскопа МС-2 ZOOM при увеличении Ч 20 и специального набора инструментов (препаровальная игла, скальпель, пинцет), изолировали апексы побегов размером 0,1-0,2 мм из асептических почек растений.

Для культивирования и регенерации меристем, микроклонального размножения и укоренения растений красной малины in vitro приведен состав питательных сред. (табл.1)

В факторостатной комнате при освещенности - 3-5 тыс. лк., фотопериоде - 16/8 ч, температуре - 24-26? С, относительной влажности воздуха - 60-80 %. Осуществляли культивирование изолированных тканей in vitro растений сортов малины - Барнаульская и Новость Кузьмина (рис. 1).

Таблица 1 - Состав питательных сред по Мурасиге и Скуг для культивирования и регенерации меристем, клонального размножения и укоренения растений-регенерантов красной малины in vitro

В соответствии с общепринятой методикой проводили выращивание акклиматизированных растений в нестерильных условиях [9].

Результаты и обсуждение полученных данных

Подбор растения-донора, введение in vitro и получение хорошо растущей стерильной культуры включает в себя первый этап клонального размножения.

Для введения в культуру ткани растений у представителей рода Rubus в качестве исходного экспланта, различные исследователи рекомендуют использовать апикальные и латеральные почки, неодревесневших (в июле) или одревесневших (август - сентябрь) побегов. Для стерилизации вводимых эксплантов in vitro применяются различные способы их обработки. [11].

На начальном этапе почки одревесневших побегов растений сортов красной малины - Барнаульская и Новость Кузьмина промывали проточной водой с добавлением моющих средств, в течение 15-20 минут, затем почки очищали от кроющих листьев чешуй и листьев. Основную стерилизацию проводили тремя способами (табл. 2). После стерильный материал помещали на искусственную питательную среду МС для введения эксплантов.

Таблица 2 - Эффективность способов стерилизации при введении почек малины красной сортов Барнаульская и Новость Кузьмина in vitro

В результате стерилизации эксплантов растений красной малины различными способами показали их различную эффективность. Так, в первом и втором варианте опыта выход стерильных эксплантов in vitro у растений сорта малины Барнаульская находился в пределах 5-15 % процентов. В третьем же варианте опыта выход стерильных эксплантов у данного сорта составлял 80 %.

Аналогичная ситуация наблюдалась и при стерилизации эксплантов и у растений сорта красной малины Новость Кузьмина. В данном случае выход стерильных эксплантов в первом и втором варианте опыта составлял 58-60 %, в третьем варианте 91 %. (табл. 2)

В настоящее время отдельные исследователи рекомендуют с целью снижения вредного влияния продуктов окисления фенолов на экспланты, добавлять в питательную среду Мурасиге и Скуга аскорбиновую кислоту (750-100 мкМ) или глутатион восстановленный (100-250 мкМ). Согласно, литературным источникам, добавление данных веществ в питательную среду повышает выход побегов малины in vitro на 34 %.

В качестве антиоксиданта проводимых нами исследованиях для снижения действия фенолов использовалась аскорбиновая кислота в концентрации 1мг/л. После помещения почек на искусственную питательную среду, на 20-30-е сутки, у тронувшихся in vitro в рост стерильных почек, для освобождения красной малины от вирусной инфекции, вычленяли экспланты, состоящие из меристематического купола, одного или двух листовых примордиев и некоторого количества субапикальной ткани. Изолированные меристемы, помещали на питательные среды для регенерации меристем in vitro.

Рисунок 1 - Культивирование растений малины в факторостатной комнате

В первом варианте опыта (В-1) приживаемость меристем in vitro у сорта малины красной Новость Кузьмина составляла 34,1 %, у сорта Барнаульская данный показатель находился в пределах 31,0 %. Во втором варианте опыта (В-2) приживаемость меристем у сорта красной малины Новость Кузьмина находилась в пределах 73,8 %, у сорта Барнаульская 57,0 %. (табл. 3)

Таблица 3 - Приживаемость меристем растений красной малины 15-е сутки после помещения их на различные питательные среды

Приживаемость меристемных эксплантов растений красной малины сорта Новость Кузьмина на питательной среде, содержащей 1,0 мг/л 6-БАП + 30 000 мг/л сахарозы была более чем в 2 раза выше, чем приживаемость меристем на питательной среде, содержащей 0,1 мг/л 6-БАП + 0,2 мг/л ГК + 30 000 мг/л сахарозы. У сорта малины Барнаульская отмечалось несколько меньшее значение данного показателя.

На втором этапе - собственно микроразмножение, некоторые исследователи для лучшего роста микропобегов малины in vitro рекомендуют различные концентрации 6-БАП - в пределах 0,5-1,0 мг/л. [10,13,1].

Введенные в культуру in vitro и начавшие рост растения, через 7-10 дней, пересаживали на питательные среды для микроклонального размножения с минеральным составом, сахарозой и витаминами по прописи MС. Используемые в наших исследованиях среды отличались различным содержанием 6-БАП (0,5 мг/л и 1,0 мг/л). (табл. 4).

Таблица 4 - Коэффициент размножения растений красной малины на питательной среде МС с различным соотношением фитогормонов

Вариант среды, включающий 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л в комбинации с 0,1 мг/л ИМК, оказался оптимальным вариантом для увеличения коэффициента размножения малины in vitro.

При использование данной концентрации, получали достаточно крупные микропобеги длиной 1,5-3см. (рис. 2). Увеличение же концентрации в среде 6-БАП до 1,0 мг/л приводило к увеличению коэффициента размножения, в тоже время растения становились более мелкими, и снижалась интенсивность ризогенеза на этапе укоренения. Кроме того, отмечались признаки хлороза через 2-3 недели культивирования растений на данной питательной среде.

Рисунок 3 - Микроклональное размножение растений малины красной в стеклянных стаканчиках

Укоренение размноженных побегов in vitro с последующей адаптацией их к почвенным условиям искусственного климата включает в себя третий и четвертый этап. микроклональное размножение регенерация малина

От типа и концентрации используемого ауксина, на этапе укоренения растений in vitro, согласно литературным данным, зависит эффективность корнеобразования у микропобегов малины [10,1]. Одни исследователи считают, что индукция ризогенеза у изучаемых сортов малины наилучшим образом удается на среде MС, содержащей уменьшенное вдвое количество макросолей, 20 г/л сахарозы и 0,5-1,0 мг/л в-индолил - 3-масляной кислоты (ИМК). [1]. Другие исследователи с целью укоренения предлагают применять питательные среды с половинным составом солей по МС, дополненные 1 мг/л ИУК. [14].

При культивировании пробирочных растений красной малины на питательной среде для укоренения, у сорта Барнаульская лишь на 40-е сутки наблюдался единичный рост корней (табл. 5).

В проводимых исследованиях к эффективному ризогенезу культивируемых пробирочных растений, приводила предварительная 16-часовая экспозиция микропобегов в растворе ИМК в концентрации 25 мг/л. Применение данного способа корнеобразующая способность изучаемых сортов красной малины было в пределах 75-92 %.

Таблица 5 - Процент укоренения растений красной малины in vitro

На этапе укоренения, побеги изучаемых сортов красной малины заметно увеличивались в высоту, что в дальнейшем облегчало перевод их на адаптацию к почвенному грунту.

Использование различных типов субстратов, при адаптации растений к условиям in vivo, состоящие из торфа, песка, перлита в соотношении 1:1:1; торфа и песка в отношении 31; смесь торфа, дерновой почвы, перлита в соотношении 1:1:1; торф, коры сосны и песка в соотношении 3:1:1, в настоящее время рекомендуют некоторые исследователи. [9]

Отдельные исследователи на этапе адаптации микрорастений малины используют пропаренные в сушильном шкафу и проавтоклавированные стерильные субстраты [13]. Другие исследователи применяют искусственный субстрат, содержащий свежие стабилизированные осадки городских сточных вод (ОГСВ) и нейтрализованный верховой торф (1:4). Благодаря оптимальным физико-химическим, асептическим свойствам и высокой гормональной активности субстрат оказывает положительное влияние на приживаемость микрорастений, их рост и развитие. [1].

Растения изучаемых сортов красной малины пересаживали в горшочки с различными типами субстрата для адаптации к условиям in vivo, после развития корневой системы пробирочные. Стерильные растения высаживали в субстрат. В качестве субстрата использовались: почвоґрунт (контроль); торф, песок в соотношении (3:1); торф, дерновая почва, перлит (1:1:1); готовый к применению универсальный питательный ґрунт "Садовник" (табл.6).

Укорененные в субстрате пробирочные растения красной малины культивировались в камере искусственного климата. Лучшая приживаемость пробирочных растений малины сорта Новость Кузьмина и Барнаульская наблюдалась на варианте с торфоґрунтом "Садовник". По приживаемости растений малины все изучаемые типы субстрата превышали контрольный вариант опыта.

Таблица 6 - Результаты приживаемости пробирочных растений малины, выращиваемых на различных типах субстрата на 30-е сутки

Следует отметить, что приживаемость растений малины сорта Новость Кузьмина несколько превышала значение данного показателя сорта Барнаульская.

Заключение и выводы

в результате проведенных исследований изучены оптимальные этапы клонального размножения in vitro растений красной малины сортов Новость Кузьмина и Барнаульская. Наиболее эффективным способом на первом этапе - введения эксплантов в культуру ткани растений основным методом стерилизации побегов являлся вариант, содержащий 0,025 % раствор мертиолята Na в сочетании с 7 % белизной в экспозиции 10 минут. Выход стерильных растений на данном варианте варьировал от 80 % до 91 %. Оптимальной питательной средой, для малины красной in vitro была среда МС, включающая 1 мг/л 6-БАП и 3 % сахарозы. Приживаемость меристем на данной питательной среде у изучаемых сортов красной малины находилась в пределах от 57,0 до 73,8 %. Для увеличения коэффициента размножения малины красной in vitro наилучшим был вариант среды, включающий 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л в комбинации с 0,1 мг/л ИМК. Культивируемые пробирочные растения после предварительной 16-часовой экспозиции микропобегов в растворе ИМК в концентрации 25 мг/л в течение 16 часов показали наибольший процент ризогенеза (75-92 %).

Максимальная приживаемость пробирочных растений (86-93 %) у изучаемых сортов красной малины в почвенном грунте (камера искусственного климата) отмечена на варианте опыта, который содержал торфоґрунт "Садовник".

Список литературы

1. Аладина О.Н., Акимова С. В., Ковалева И.С., и др. Способ доращивания in vitro растений ягодных и декоративных кустарников в нестерильных условиях Патент РФ на изобретение №2366153, бюл. №, г., опубл.10.09.2009 г.

2. Бутенко Р.Г. Клеточная технология в сельскохозяйственной науке / Основы сельскохозяйственной биологии. - М.: Агропромиздат, 1990. - Гл. 2. - С. 154-235.

3. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. Москва 1964, 272 с.

4. Вовк, В.В. Оптимизация селекционного процесса и ускоренное размножение межвидовых ремонтантных форм малины методом in vitro: автореф. дис. …канд. с. -х. наук: 06.01.05. - Брянск, 2000. - 20 с.

5. Высоцкий В.А. Использование биотехнологических методов при оздоровлении посадочного материала / Актуальные вопросы теории и практики защиты плодовых и ягодных культур от вредных организмов в условиях многоукладности сельского хозяйства: тезисы докладов Всероссийского совещания. - Москва, 1998. - С. 74-76.

6. Джигадло М.И. Микроклональное размножение и производство посадочного материала плодовых и ягодных культур высших категорий качества. - Саратов, 2003. - С. 108-109.

7. Кашин В.И. Перспективы использования биотехнологических приемов в создании новых высокоадаптивных форм плодовых и ягодных растений / Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем: сборник докладов и сообщений XVIII Мичуринских чтений. - Мичуринск, 1998. - С. 8-14.

8. Казаков И.В., Заякин В.В., Нам Казаков И.Я. Оптимизация метода клонального микроразмножения для ускоренной селекции ремонтантных форм малины // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем: сборник докладов и сообщений XVIII Мичуринских чтений. - Мичуринск, 1998. - С. 16-19.

9. Калашникова Е.А., Родин А.Р. Получение посадочного материала древесных, цветочных и травянистых растений с использованием методов клеточной и генной инженерии. Учебное пособие, Москва,2001 г., 71 с.

10. Кушнаренко С.В., Ковальчук И.Ю., Ромаданова Н.В. и др. Криосохранение апекальных меристем плодовых и ягодных культур. Методические рекомендации, Алматы, 2011, 43с.

11. Ковальчук И.Ю., Мухитдинова З.Р., Турдиев Т.Т., Успанова Г.К. Микроклональное размножение малины, как метод сохранения биоразнообразия растений в Казахстане//Материалы 2-ой Всероссийской научно-практической конференции Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира (19-21 августа 2008 г., Волгоград). http:// botanicblog.ru/public/biotech-20086 Семина Н.П., Лукьянова Е.А., Цуканова Е.М. Вирусные болезни плодовых и ягодных культур в ЦЧО и методы их идентификации // Современные проблемы плодоводства: тез. докл. междунар. научн. конф. - Самохваловичи, 1995. - С. 40-41.

12. Murashige T.& Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures// Physiologia Plantarium, 1962, v.15, p. 473.

13. Соловых Н.В., Муратова С. А., Янковская М.Б. Микрокланальное размножение ягодных культур in vitro / ГНУ Всероссийский НИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина, Россия, г. Мичуринс, E-mail: natalyasolovykh@yandex.ru.

14.Сковородников Д.Н. Особености клонального микроразмножения in vitro и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины. Автореферат, дис. на соиск. уч. степ. Канд.с.- х.наук, Брянск,2004 г., 19 с.

Размещено на Allbest.ru