Современные методы оценки иммунного статуса животного, их характеристика, особенности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Кафедра иммунологии

Реферативная работа

На тему:

Современные методы оценки иммунного статуса животного, их характеристика, особенности

Работа выполнена студенткой

4 курса 12 группы

Факультета ветеринарной медицины

Сухачёвой О.К.

Преподаватель: Доцент

Марзанова Саида Нурбиевна

Содержание

Введение

Оценка иммунного статуса

Оценка иммунного статуса при иммунодефицитах

Методы клинико-иммунологической диагностики

Определение Т-клеточных дефицитов

Определение В-клеточных дефицитов

Определение дефицитов нейтрофилов

Определение дефицита комплемента

Заключение

Библиографический список

Введение

Иммунный статус - это комплексный показатель состояния иммунной системы. Необходимость в исследовании иммунного статуса возникает, когда у ветеринарного врача появляются подозрения на несостоятельность иммунной системы, и решается вопрос, какого она характера, насколько глубока, и как провести ее коррекцию.

Важность своевременного выявления неблагоприятных изменений иммунного статуса в том, что они влекут за собой опасность возникновения широкого круга заболеваний (инфекционных процессов, аллергии, опухолей, аутоиммунных расстройств и др.).

Для определения иммунного статуса проводится иммунограмма. Так как иммунный статус зависит от двух больших взаимосвязанных систем - гуморального и клеточного иммунитета, именно их состояние отражает ряд иммунологических тестов, входящих в иммунограмму.

В результате становится понятно, насколько полноценными являются разные звенья иммунного статуса. А важны они все, так как только их совместные действия способны осуществить общую цель - защитить организм от чужеродного вторжения.

иммунный клеточный дефицит нейтрофил

Оценка иммунного статуса

Наиболее распространенные тесты оценки иммунного статуса:

Общий анализ крови; определение соотношении нейтрофилы/лимфоциты/моноциты. СОЭ, СРБ, белковые фракции сыворотки крови (g-глобулины).

Определение количества Т-лимфоцитов (процент и абсолютное число) методами с моноклональными антителами (мАТ) антителами к CD2, CD3, CD4, CD8, CD25. Отношения CD4/CD8.

Определение В-лимфоцитов -- CD19, CD21, CD22, CD72 или Ig+B.

Определение иммуноглобулинов классов G, М, А, Е в сыворотке крови и sIgA слюне. Соотношения их количества (G/M/A).

Поглотительная активность нейтрофилов крови, частиц латекса и/или стафилококков, кандид (фагоцитарное число, фагоцитарный индекс); оценка киллинга кандид, бактерий.

НСТ-тест.

Определение циркулирующих иммунных комплексов (методом ПЭГ-осаждения). Другие тесты по показаниям.

Антитела против стрептококка, дифтерийного токсина, гемофильной палочки, столбнячного токсоида, стафилококка, его токсина и вирусов (кори, гриппа).

Определение гемолитической активности комплемента (С50) и/или его компонентов.

Внутрикожные пробы (после забора крови!) с распространенными антигенами (туберкулин, стрептокиназа-стрептодерназа, антигены бактерий и грибов).

По показаниям-определение ферментов, отсутствующих при первичных иммунодефицитах (АДА, пуриннуклеозидфосфорилазы, альфафетопротеин при атаксии; гранулы лейкоцитов при гранулематозной болезни).

Оценка интерферонового статуса: концентрация интерферона в сыворотке крови; уровень интерферонa а и g в культуре лимфоцитов крови после стимуляции вирусом болезни Ньюкастла и стафилококковым энтеротоксином соответственно.

HLA-типирование (при необходимости).

Выявление цитокинов (по показаниям), в крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) и в клетках системы иммунитета (СИ) методами проточной цитометрии.

Определение общей g-цепи рецепторов цитокинов при тяжелом комбинированном иммунодефиците (ТКИД) методом проточной цитометрии.

Оценка иммунного статуса при иммунодефицитах

Количество методов, необходимых для полноценной характеристики состояния системы иммунитета, быстро увеличивается параллельно сложности их выполнения. Поэтому применение тестов I и даже II уровня для оценки иммунного статуса недостаточно эффективно. Концепция иммунологического образа болезни, обосновывающая существование для каждого заболевания и его вариантов своих измененных параметров, а также ориентировка на вид и вариант иммунного статуса, позволяет использовать небольшую группу главных диагностических показателей в каждом конкретном случае.

Лабораторная диагностика иммунодефицита (ИД) основывается на определенной последовательности, алгоритме действий, используемых при оценке иммунного статуса.

1. Анамнез и осмотр. Заполнение анкет. Их анализ, формирование групп риска с предварительным диагнозом по основным синдромам.

2. Клинико-лабораторное обследование. Основные показатели крови и биохимический статус (объем по показаниям). Предварительный диагноз иммунопатологии (вариант иммунного статуса). Рекомендации по набору тестов для оценки иммунного статуса.

3. Оценка иммунного статуса

Выявление ИД проводят в двух ситуациях:

1) при скрининге контингентов населения определенных регионов и рабочих коллективов на предмет наличия ИД;

2) при обследовании больных с целью уточнения предварительного диагноза. Для некоторых генетических обусловленных иммунодефицитов возможна пренатальная диагностика на основании ультразвукового обследования, хромосомного и биохимического анализов.

Методы клинико-иммунологической диагностики

Для оценки иммунного статуса Р.В. Петровым с соавторами разработан системно-функциональный комплекс стандартных и унифицированных тестов первого и второго уровней.

На первом этапе выявляются обобщенные характеристики или грубые дефекты в системе клеточного и гуморального иммунитета и фагоцитоза:

Определение относительного и абсолютного числа лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови;

Тесты Е- и ЕАС-розеткообразования для определения абсолютного и относительного числа Т- и В-лимфоцитов;

Определение концентрации сывороточных иммуноглобулинов основных классов (IgM, IgG, IgA);

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов.

Второй этап проводится при отклонении данных ориентирующих тестов или при наличии специальных показаний:

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперы, Т-супрессоры);

Прямой тест определения спонтанной миграции лейкоцитов и торможения их миграции в присутствии ФГА;

Постановка кожных тестов гиперчувствительности замедленного и немедленного типов на туберкулин, грибковые антигены, ДНХБ, искомые аллергены;

Оценка пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов в реакции бласттрансформации на митогены, антигены, аллогенные клетки;

Определение В-лимфоцитов, несущих поверхностные иммуноглобулины разных классов;

Оценка синтеза иммуноглобулинов в культуре В-лимфоцитов;

Оценка активности киллерных лимфоцитов (К- и НК-клетки);

Тесты на оценку наиболее значимых медиаторов иммунной системы (интерлейкинпродуцирующая активность клетки);

Выявление иммунных комплексов;

Определение различных компонентов комплемента;

Оценка различных этапов фагоцитоза.

Иммунологическими методами можно определять иммунный статус животных в норме и при патологии, осуществлять контроль за восстановлением иммунологической компетентности организма в процессе лечения методами иммунотерапии.

Для определения первичного или вторичного иммунодефицита необходимо использовать лабораторные методы, которые позволяют определить количество и функциональную активность Т-, В-клеток и нейтрофилов. Кроме того, проводится количественное определение компонентов комплемента в сыворотке крови для установления их роли в иммунной дисфункции.

Определение Т-клеточных дефицитов

Для определения количества или функциональной активности Т-клеток обычно используется следующие лабораторные тесты:

Дифференциальный подсчет количества лейкоцитов(лейкограмма);

Реакция гиперчувствительности замедленного типа(кожный тест)

Спонтанное розеткообразование лимфоцитов с эритроцитами барана;

Реакция бласттрансформации лимфоцитов.

Лимфопения, обнаруженная с помощью обычной лейкограммы, часто отражает уменьшение числа Т-клеток, поскольку у большинства видов животных Т-клетки составляют около 75% лимфоцитов крови. Поэтому, уменьшение общего количества лимфоцитов обычно связано с уменьшением Т-клеток.

Реакция гиперчувствительности замедленного типа, определяемая с помощью кожного теста, используется у некоторых видов животных для оценки функциональной активности Т-клеток. Например, когда жеребятам с комбинированным иммунодефицитом вводят внутрикожно фитогемагглютинин, то у них не развивается положительная реакция. У собак наблюдается слабая реакция гиперчувствительности замедленного типа на введение большинства антигенов и митогенов, поэтому использование этого метода для оценки Т-клеточного дефицита у этого вида требует осторожной интерпретации результатов.

Способность лимфоцитов in vitro отвечать на некоторые митогены клеточным делением и пролиферацией лежит в основе реакции бласттрансформации, используемой для оценки функций Т-клеток. В этом методе наиболее часто используются такие митогены как конкавалин А и фитогемагглютинин. Использование В-клеточного митогена позволяет оценивать функцию В-клеток. Различные виды животных отличаются по чувствительности к митогенам, поэтому необходим тщательный выбор митогена и схемы его применения.

Определение В-клеточных дефицитов

Для определения количества функционально активных В-клеток в крови используются:

Метод иммунофлюоресценции

Основан на выявлении молекул иммуноглобулина, находящихся на поверхности В-клеток с использованием конъюгированных антител к IgG, IgA, IgM соответствующего вида животных;

Метод комплементарного розеткообразования

(ЕАС) основан на образовании розеток с эритроцитами барана, сенсибилизированных антителами к эритроцитам барана и комплементом. Метод недостаточно стандартизирован для рутинного использования в ветеринарии;

Метод гемолитических бляшек

Используется для идентификации антителопродуцирующих В-лимфоцитов и включает химическое связывание антигена с эритроцитами барана, использование плат с кровяным агаром, куда добавляется суспензия лимфоцитов. Иммуноглобулины, секретируемые В-клетками, связываются с эритроцитами, покрытыми антигеном. При добавлении раствора, содержащего комплемент, происходит лизис сенсибилизированных эритроцитов с образованием зоны гемолиза вокруг каждой функционально активной В-клетки.

Число В-клеток определяется подсчетом количества гемолитических бляшек. Вариации этого теста (прямой, непрямой, обратный) используются для идентификации таких состояний как селективная субкласс-специфическая агаммаглобулинемия (например, селективный IgA-дефицит). В этом случае используется обратный вариант метода, который включает в себя взаимодействие эритроцитов барана с анти-IgA-антителами;

Метод радиальной иммунодиффузии

(РИД) для количественного определения уровня иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA) в сыворотке крови, по результатам которого можно судить о функциональных свойствах В-клеток. При постановке РИД моноспецифическую антисыворотку (или моноклональные антитела, обладающие преципитирующей активностью) к отдельным классам иммуноглобулинов диспергируют в агаровый гель, смесь наносят на стекло и в застывшем агаре вырезают лунки, в которые вносят испытуемые сыворотки. Антиген (IgG, IgM, IgA) диффундирует в гель, и, взаимодействуя с антителами, образует вокруг лунки кольцо преципитации, диаметр которого прямо пропорционален концентрации иммуноглобулина в испытуемой пробе. Наряду с исследуемым материалом в другие лунки вносят раствор антигена уже известной концентрации (стандартная сы-воротка). Диаметр кольца преципитации, измеренный через 24-48 часов, сравнивают со стандартом. Количество Ig определяется по измерению диаметра кольца преципитации относительно калибровочной кривой, которая строится с использованием стандартной сыворотки.

Метод ракетного иммуноэлектрофореза (или электроим-мунодиффузии)

Метод является модификацией РИД и может также широко применяться для количественного определения Igв исследуемых сыворотках. Метод основан на соединении техники электрофореза и основных принципов РИД (феномен преципитации, определение концентрации антигена по стандартной кривой). При этой модификации антиген, внесенный в лунки агара, смешанного с антителами, подвергают электрофоретическому разделению до формирования пика преципитата в форме ракеты. Высота полосы преципитации пропорциональна концентрации антигена. Метод более чувствителен и менее продолжителен, чем РИД. Кроме вышеперечисленных методов, для определения В-клеточных иммунодефицитов также используются турбидимет-рический тест (основан на измерении оптической плотности смеси сыворотка - Na2SO4 для крупного рогатого скота, сыворотка -(NH4) 2SO4 для свиней, сыворотка - ZnSO4 для лошадей), реакция бласттрансформации лимфоцитов, реакция латекс-агглютинации, а также иммуноферментный (ИФА) и радиоиммунный (РИА) методы.

Определение дефицитов нейтрофилов

Наиболее распространенным методом количественного определения и характеристики морфологических дефектов нейтрофилов является лейкограмма и цитологические исследования с использованием световой и электронной микроскопии.

Для определения хемотаксической активности нейтрофилов применяют метод исследования миграции лейкоцитов с использованием камеры Бойдена.

Метод основан на разделении микропористым фильтром в растворе двух реагирующих компонентов: нейтрофилов и хемотаксических агентов (например, C5a-des Arg.), которые помещаются в нижнюю камеру и создают концентрационный градиент. Помещенные в верхнюю камеру ней-трофилы мигрируют вдоль градиента и собираются на нижней поверхности фильтра. После стандартной инкубации фильтры извлекают, окрашивают и подсчитывают количество клеток.

Метод довольно прост и отличается весьма высокой воспроизводи-мостью. Этот же принцип лежит в основе метода клеточной миграции под агарозным гелем, который используется для определения хемотаксического индекса. Фагоцитарный индекс нейтрофилов определяется путем подсчета количества поглощенных бактерий одной клеткой после инкубации клеток пациента со стандартными препаратами St.aureus или E.coli и окраски полученных мазков. Модификацией этого теста является метод определения бактерицидной активности, при котором отмытая суспензия клеток инкубируется с бактериальной суспензией, затем смесь наносится на поверхность кровяного агара и через определенное время подсчитывается ко-личество выросших бактериальных колоний. Оба метода требуют стандартизации для использования в каждой конкретной лаборатории и сведений об антибиотиковой терапии, которая может быть причиной недостоверных результатов или ошибок в их интерпретации. Для определения фагоцитарной метаболической (кислородозависимой) активности нейтрофилов используется реакция восстановления нитросинеготетразолия (НСТ). Тест включает в себя инкубацию нейтрофилов с НСТ in vitro, и по формированию нерастворимых окрашенных зерен формазана можно судить о восстановлении НСТ супероксидным радикалом, образующимся при активации фагоцитов. Отсутствие осадка свидетельствует о неспособности клеточной популяции фагоцитов к метаболизму. Очень важным при получении проб клеток крови животных является отсутствие гепарина в антикоагулянте, так как высокая концентрация гепарина может негативно влиять на результаты этого теста.

Другим методом оценки "респираторного взрыва" в фагоцитах является измерение спонтанной и индуцированной хемилюминесценции. Феномен респираторного (или метаболического) взрыва связан со значительным увеличением кислорода, поглощаемого лейкоцитами при фагоцитозе, в результате чего происходит образование супероксидного радикала (Оз-) и перекиси водорода. Все эти соединения обладают микробоцидными свойствами, и их идентификация представляет собой важный этап в оценке функциональной активности фагоцитарных клеток.

Определение дефицита комплемента

Количественное определение компонентов системы комплемента (главным образом С3) проводят с использованием специфических антисывороток методом радиальной иммунодиффузии.

Уменьшение количества СЗ в крови отмечается при лим-фоцитарном тиреоидите и гломерулонефрите, связанным с образованием иммунных комплексов у собак. При ревматоидном артрите наблюдается значительное снижение концентрации комплемента в суставной жидкости собак. В будущем рутинное использование РИД для определения уровня С3 у животных несомненно будет полезным для диагностики иммунодефицитов и других болезней, связанных с иммунной системой.

Для определения уровня комплемента в крови используется метод определения гемолитической активности комплемента. Принцип метода заключается в том, что иммунные комплексы активируют систему комплемен-та с образованием мембраноатакующего компонента. Исследуемую сыворотку крови инкубируют с эритроцитами барана, нагруженными антителами, в результате чего происходит лизис эритроцитов за счет присутствия комплемента в испытуемой пробе. Активность комплемента выражают в условных гемолитических единицах (CH50). За CH50 принимают последнее разведение сыворотки, которое вызывает 50% гемолиз стандартного числа сенсибилизированных эритроцитов. Этот метод может быть использован для определения всех компонентов системы комплемента.

Заключение

Иммунный статус организма - это показатели работы иммунной системы, определяющие состояние иммунной системы по количественным и функциональным показателям на определенном этапе развития организма или на определенной стадии развития заболевания.

Оценка иммунного статуса животных должна проводиться комплексно с учетом индивидуальных, генетических, видовых, физиологических, возрастных особенностей, клинического их состояния, пола, условий выращивания, биологических и технологических факторов воздействия на организм. Значительную информацию о состоянии иммунитета дает изучение того или иного показателя в динамике индивидуально у каждого животного и в группе. Чем полнее представлена информация о животных и условиях их существования, тем точнее будет дана оценка иммунного статуса и выявлены отклонения в иммунной системе.

Исследования иммунологического статуса необходимы при любом подозрение на сбой работы иммунной системы - тяжелое течение инфекционных болезней, хронические или часто рецидивирующие инфекционные заболевания, наличие очагов хронического воспаления, заболевания соединительной ткани, аутоиммунные процессы и др.

Оценка иммунного статуса помогает уточнить диагноз заболевания, определить лечебную тактику. При отклонениях в работе иммунной системы больному могут быть назначены иммунотропные препараты такие как иммуностимуляторы, иммуномодуляторы или иммуносупрессоры, так же может быть проведена заместительная терапия с помощью введения иммунных сывороток, иммуноглобулинов, лейкоцитарной массы, препаратов интерферонов.

Библиографический список

1. «Иммунологический мониторинг в ветеринарии. Тенденции развития, возможности и реальность» Федоров Ю.Н. Научная статья в журнале «С/Х биология» №2 , 2012г. 3-9стр.

2. Хаитов Рахим Мусаевич: Иммунология. Издательство: ГЭОТАР-Медиа. 2013г -528 стр.

3. Кисленко Виктор Никифорович, Колычев Николай Матвеевич, Госманов Рауис Госманович: Ветеринарная микробиология и иммунология. Учебник. Гриф Министерства сельского хозяйства. Издательство: ГЭОТАР-Медиа. 2012-752 стр.

4. Ефанова Л. И., Сайдулдин Е. Т. Защитные механизмы организма, иммунодиагностика и иммунопрофилактика инфекционных болезней животных /Л. И. Ефанова, Е. Т. Сайдулдин. - Воронеж, 2004,стр. 322-323.

5. Методические рекомендации по оценке и коррекции иммун-ного статуса животных / А.Г.Шахов и др.- Воронеж, 2005, 113с.

Размещено на Allbest.ru