Теоретические и практические аспекты диссертации используются в учебной работе при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий и научных исследований в ФГОУ ВПО КГАВМ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

Кровь у морских свинок для постановки теста - ППН брали через 15 и 30 дней после заражения микобактериями туберкулеза из краевой ушной вены в стерильные мини пробирки с добавлением антикоагулянта. Затем в лунки стерильного планшета добавляли по 40 мкл цитрированной крови и в эти же лунки приливали соответствующие аллергены (из расчета 4:1).

Кроликов (12 голов) разделили также на 4 группы по 3 животного в каждом. Первую группу кроликов, заражали культурой микобактерии туберкулеза бычьего вида в дозе 0,55 мг, вторую группу по 0,60 мг и третью группу по 0,65 мг микробной массы на голову. Всем кроликам опытных групп вводили культуру M. bovis в 1,5 мл физиологическом растворе подкожно в область паха. Четвертая группа животных из трех кроликов служила контролем. Для постановки теста - ППН брали кровь у всех кроликов до и через 15-30-60 суток после заражения микобактериями туберкулеза из краевой ушной вены в стерильные минипробирки с добавлением 5%-ного цитрата натрия из расчета 9:1.

Для изучения специфичности аллергического состояния организма у морских свинок, зараженных атипичными микобактериями из штамма М. smegmatis в тесте ППН был проведен опыт на 12 морских свинках, весом 300-320 грамм. Их также разделили на 3 группы по 4 животного, из которых образовали три опытных, и одну группу контроля. Опытных животных заражали культурой атипичных микобактерий из штамма М. smegmatis, Культуру атипичных микобактерии вводили животным подкожно в область паха в 0,5 мл физиологического раствора из расчета по 0,10 мг в первой группе, 0,15 мг во второй и по 0,20 мг в третей группу. Четвертая группа животных служила контролем.

Гематологические исследования проводили общепринятыми методами (А.А. Кудрявцев и др., 1969; В.В. Меньшиков, 1987). Подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов производили в камере Гаряева, а содержание гемоглабина определяли гемометром Сали (Л.П. Жаворонков, В.М. Зяблицкий, 1980).

Биохимические исследования сывороток крови у животных проводили с помощью аппарата ФП-901 в режиме полуавтомат с использованием реактива «Эколап» (производство Россия).

Динамику аллергического статуса организма изучали на ранних стадиях туберкулеза на лабораторных животных (морских свинках, кроликах) и на крупном рогатом скоте путем подсчета повреждения нейтрофилов (ППН) в присутствии специфического аллергена in vitro по методу В.А. Фрадкина, 1985 год. Животных для опытов подбирали по принципу аналогов, с учётом пола, породы, возраста и живой массы.

Убой морских свинок производили через 30 суток, а кроликов спустя 60 суток после заражения. Туши и внутренние органы лабораторных животных подвергали тщательному патологоанатомическому осмотру, а биоматериал от них исследовали общепринятыми лабораторными методами (бактериоскопической, бактериологической, гистологической и биопробой на морских свинках). Для лабораторных исследований использовали паренхиматозные органы (кусочки печени, легких, почек, селезенки) и лимфатические узлы (предлопаточные, средостенные, бронхиальные, заглоточные, брыжеечные и паховые).

Для уточнения диагноза на туберкулез у морских свинок и кроликов, а также для постановки прижизненного диагноза и дифференциальной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота проводили ПЦР (полимеразную цепную реакцию) в отделе молекулярной генетических исследований ФГУ ВПО ФТЦРБ совместно с профессором Т.Х. Фаизовым.

В качестве материала для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) от коров, реагирующих на внутрикожное введение туберкулина, брали молоко и кровь, а при контрольном убое животных брали и лимфатические узлы (заглоточные, предлопаточные, средостенные, бронхиальные, брыжеечные). ПЦР проводили с праймером, входящими в состав набора тест - систем, «Амплисенс» (ЦНИИ эпидемиология) для диагностики Mycobacterium tuberculosis, bovis, которые амплифицируют фрагмент ДНК с размером 357 пар нуклеотидов, определяемый фрагмент последовательности гена МПБ 64 Mycobacterium tuberculosis, bovis. Амплифицированную ДНК разделяли методом горизонтального электрофореза в 2% - ном агарозном геле.

Патоморфологические исследования проводили по методике описанной А.И. Яковлевой (Г.Н. Першин, 1971).

Аллергические исследования морских свинок, кроликов, а также бактериоскопические и бактериологические исследования патологического материала от зараженных животных проводили в соответствии с «Рекомендациями по лабораторной диагностике туберкулеза» Всесоюзного научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (1988).

Для выяснения эпизоотической ситуации по туберкулезу и эхинококкозу крупного рогатого скота в республике Татарстан нами были изучены и обобщены результаты отчетов ГУВ КМ РТ и 10 мясокомбинатов республики за 2001 - 2006 годы, с ежегодным охватом 43 районов, в том числе более тысячи ферм крупного рогатого скота.

Изучение эпизоотической ситуации по эхинококкозу в РТ, а также изготовление и испытание аллергена из эхинококкового пузыря были проведены совместно с доцентом кафедры паразитологии ФГОУ ВПО КГАВМ им. Баумана Д.Г. Латыповым.

Для постановки теста - ППН, ПЦР от коров в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве «ОАО Клементейкино» Альметьевского района РТ брали кровь и молоко, кусочки лимфатических узлов и паренхиматозные органы для лабораторных исследований. Аналогичные исследования проводили и в 14 благополучных хозяйствах республики: (КП им. Горбунова, им. Рахимова, « Апас » Апастовского района; Учхоз КГАВМ, «Битаман», «Айбаш», Высокогорского района, им. Вахитова, «Кургузи», им. Ленина, «Овощевод», «Колос-Синтез», «Маевка», «Уразла», «Ключи» Зеленодольского района).

Статистическую обработку цифровых данных проводили по разработанным программам в Microsoft Excel. Достоверность устанавливали по методу Стьюдента - Фишера (И.А. Плохинский, 1970).

Показатели повреждения нейтрофилов (тест - ППН) у морских свинок, зараженных микобактериями туберкулеза бычьего вида. В качестве специфического аллергена использовали очищенный ППД туберкулин для млекопитающих. Для контроля специфичности аллергического состояния организма путем повреждения лейкоцитов крови (нейтрофилов), применяли также разные гетерогенные аллергены: бруцеллезный антиген для РА, РСК, РДСК, паратуберкулезный антиген для РСК, эхинококковый аллерген, а также стерильный физиологический раствор.

ППН у всех морских свинок до заражения микобактериями туберкулеза колебался в пределах от 2,6±0,7% до 5,7±0,7%. Через 15 суток после заражения результаты ППН при инкубировании крови с ППД туберкулином составили: в первой группе морских свинок 42,2±1,2%, во второй - 38,4±1,0%, а в третьей группе - 50,7±1,4%.

При инкубации бруцеллезным, паратуберкулезными антигенами, эхинококковым аллергенами и физиологическим раствором показатели повреждения нейтрофилов не превышали 4,5±0,5%.

Через 30 суток после заражения процент поврежденных нейтрофилов с ППД туберкулином составил в первой группе - 63,6±1,3%, во второй - 67,2±0,2%, в третьей группе животных 69,8±1,2%. При инкубации с гетерогенными аллергенами показатели теста - ППН также не превышали 5%.

В результате проведенных исследований установили, что у зараженных туберкулезом животных наиболее значительные изменения повреждения нейтрофилов отмечаются при инкубации с ППД туберкулином. При этом процент поврежденных нейтрофилов в нашем опыте колебался через 15 дней после заражения от 38,4±1,0% до 50,7±1,4%, а через 30 дней от 63,6±1,3% до 69,8±1,2%.

Специфичность аллергического состояния организма у морских свинок, зараженных микобактериями туберкулеза, определяли инкубированием крови с бруцеллезным, паратуберкулезным антигенами, эхинококковым аллергеном, а также стерильным физиологическим раствором. С гетерогенными аллергенами показатели повреждения нейтрофилов теста - ППН у зараженных животных было в пределах - от 2,1±0,3% до 5,1 ±0,5%.

Показатели повреждения нейтрофилов у морских свинок, зараженных атипичными микобактериями из штамма М. smegmatis. Для постановки теста - ППН кровь у морских свинок брали через 15 и 30 дней после заражения по вышеуказанной методике.

Во всех трех группах у морских свинок показатели повреждения нейтрофилов до заражения колебались в пределах от 2,1±0,1% до 5,4±0,6%.

Спустя 15 суток после заражения в первой опытной группе морских свинок показатели теста - ППН при инкубации с ППД туберкулином в среднем составили 4,2±1,2%, во второй опытной группе 2,8±0,6% а в третей контрольной группе 2,5±0,3%. Показатели повреждении нейтрофилов при инкубировании крови бруцеллезным, паратуберкулезным антигенами, эхинококковым аллергеном, а также при контроле с физиологическим раствором варьировали от 2,7±0,1%. до 5,1±0,1%.

Процент поврежденных нейтрофилов у зараженных атипичными микобактериями животных при инкубировании с ППД туберкулином спустя 30 суток составил: в первой группе - 4,4±0,1%, во второй -5,7±0,3%, в третьей контрольной группе -3,2±0,7%. В свою очередь с другими гетерогенными аллергенами показатели теста - ППН колебались от 1,6±0,2% до 5,5±0,3%.

Проведенные исследования показали, что морские свинки зараженные атипичными микобактериями из штамма М. smegmatis показывают отрицательные результаты теста - ППН, при этом процент поврежденных нейтрофилов, как со специфичным, так и с гетерогенными аллергенами, а также физиологическим раствором колеблется в пределах от 1,7±0,5% до 4,7±0,9%.

Патоморфологические изменения в органах и тканях морских свинок, инфицированных атипичными микобактериями из штамма М. smegmatis. Легкие у морских свинок были не спавшиеся, бледно красного цвета, наполнены воздухом. Легочная ткань не была изменена, обнаруживали фокусы дистеликтаза и ателектазы с утолщением межальвеолярных перегородок. В местах утолщения отмечается инфильтрация - гистеоцитарных клеток, а также расширение и кровенаполнение капилляров. Макроскопически лимфатические узлы в объеме не увеличены, округлой формы и эластичны.

Проведенные исследования показали, что при инфицировании животных атипичным штаммом микобактерий (М. smegmatis) образование специфичных эпителиоидно - клеточных гранулем, характерных для туберкулеза, не происходит.

Показатели повреждения нейтрофилов (ППН - тест) у кроликов, зараженных микобактериями туберкулеза бычьего вида. До заражения у всех опытных и контрольных групп животных, как со специфичным, так и с гетерогенными аллергенами показатели теста - ППН не превышали 5 %.

Спустя 15 суток после заражения кроликов из опытных групп показатели повреждения полиморфно - ядерных лейкоцитов (нейтрофилов) при инкубировании со специфическим аллергеном (ППД туберкулином) составили в первой группе 39,6±2,8%, во второй - 41,2±2,0%, а в третьей 46,7±1,7%. При инкубировании крови с бруцеллезным, паратуберкулезными антигенами, и с эхинококковым аллергеном, а также с физиологическим раствором показатели повреждения нейтрофилов не превышали 5%.

Патоморфологические изменения в органах кроликов зараженных M. bovis. При патологоанатомическом вскрытии трупов кроликов, зараженных M. bovis, через 60 суток после заражения, отмечали выраженные туберкулезные очаги в области легких, увеличенные в размере. На поверхности разреза ткани легкого видна желтоватая масса плотной консистенции.

У кроликов из контрольной группы в легких характерные для туберкулеза изменения не были обнаружены.

Регионарные к месту заражения (левые паховые лимфатические узлы) были плотной консистенции, приводящие в следствии к увеличению органа в несколько раз. При разрезе лимфатических узлов выделялась зловонная масса творожистой консистенции желтовато - серого цвета.

Результаты комплексных исследований крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах. Нами были проведены исследования 95 голов крупного рогатого скота по изучению этиологии аллергических реакций на туберкулин в 14 благополучных по туберкулезу населенных пунктах 3-х районов республики. Во многих ранее благополучных хозяйствах появляется крупный рогатый скот, реагирующий на туберкулин, а при убое этих животных при лабораторных исследованиях туберкулез у них не подтверждался, поэтому эти реакции были отнесены к неспецифическим. Лабораторные исследования патологического материала проводили в бактериологическом отделе ветеринарной лаборатории РТ.

Проведенные исследования показали, что тест - ППН и ПЦР были отрицательными у всех исследованных животных.

При убое не реагирующих на тест - ППН животных и при патологоанатомическом исследовании их внутренних органов изменения характерные для туберкулеза, не были обнаружены. При посеве биоматериала на искусственные питательные среды и при постановке биопробы на морских свинках, во всех случаях туберкулез был исключен. В результате комплексных исследований показатели аллергических реакций на ППД туберкулина у всех животных оценивались как неспецифические.

Полученные нами данные указывают, что у крупного рогатого скота, не инфицированного микобактериями туберкулеза, нейтрофилы крови при инкубации со специфичным аллергеном не повреждаются и поэтому показатели теста - ППН в этом случае могут служить прижизненным экспресс методом диагностики болезни и дифференциации неспецифических реакций на туберкулин.

Результаты комплексных исследований крупного рогатого скота в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве. Исследования проводилось в неблагополучном по туберкулезу крупного рогатого скота ОАО «Климинтейкино» Альметьевского района РТ.

Для изучения показателей повреждения нейтрофилов теста - ППН, использовали кровь, от всех 40 животных, реагировавших на ППД туберкулин. Кровь, взятая от 3-х коров, не реагирующих на туберкулин, служила контролем.

У 36 коров показатели теста - ППН варьировали от 21 до 59% поврежденных нейтрофилов. В контроле со стерильным физиологическим раствором показатели теста колебались в пределах от 1 до 4 %. У животных контрольной группы (3головы) результаты теста - ППН варьировали от 2 до 5% поврежденных нейтрофилов.

Из 40 реагировавших на ППД туберкулин животных, положительный результат ПЦР нами был получен в 36 случаях по крови и в 28 случаях по молоку. При контрольном убое 26 животных из отобранного патологического материала были сделаны посевы на питательные среды. В посевах через 45 суток наблюдали обильный рост микобактерий туберкулеза. Результаты биопробы также были положительными у всех животных, у которых была выделена культура микобактерии туберкулеза.

Из анализа проведенных исследований видно, что из 40 голов крупного рогатого скота, реагировавших на ППД туберкулин, у 36 животных нами был установлен туберкулез. Вероятно, у 4-х животных аллергические реакции были неспецифическими, так как тест - ППН, а также ПЦР показывали отрицательные результаты.

При контрольном убое 26 коров, реагирующих на ППД туберкулин, позитивные результаты теста - ППН совпали с положительными показателями ПЦР и результатами лабораторных исследований на туберкулез.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами было установлено, что тест - ППН при инкубировании крови с ППД туберкулином для млекопитающих может служить дополнительным прижизненным диагностическим тестом при туберкулезе крупного рогатого скота и результаты теста - ППН совпадают с показателями ПЦР.

Применение теста - ППН в ветеринарной практике позволяет также дифференцировать неспецифические реакции на введение ППД туберкулина и избежать неоправданного убоя высокопродуктивных и племенных животных.

Изучение этиологии неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота. Реагировавших на туберкулин животных в 2006 году было зарегистрированы в 336 хозяйствах РТ. По количеству реагирующих животных это был самый высокий показатель по сравнению с остальными годами и составил 4832 головы, из которых 2928 были сданы на убой. Для лабораторных исследований на туберкулез было отобрано 1175 проб биоматериала.

Таким образом, за последние шесть лет из 1116 имеющихся в республике различных форм хозяйств в 346 (31%) выявлено реагирующих на внутрикожное введение туберкулина 24580 животных, или в среднем по 4146 голов ежегодно. Из числа реагирующих на туберкулин 16219 животных (65,9%) было подвергнуто контрольно - диагностическому убою. От убитых 4635 животных (25%) пробы биоматериала подвергались лабораторным исследованиям на туберкулез. При этом в 120 случаях (2,5%) патологоанатомическим, бактериологическим методами и биопробой был выделен возбудитель туберкулеза.

Неоправданный убой животных с неспецифическими реакциями на туберкулин за один год в среднем равен количеству коров целого района республики.

Изучение туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота, пораженного гельминтами. По распространению ларвального эхинококкоза крупного рогатого скота республику можно разделить условно на три зоны. Это зоны слабой, умеренной и сильной инвазированности.

Выводы

1. Применение теста - ППН позволяет правильно оценить эпизоотическую ситуацию по туберкулезу и дифференцировать неспецифические туберкулиновые реакции у крупного рогатого скота;

- у морских свинок, кроликов и сельскохозяйственных животных, зараженных микобактериями туберкулеза бычьего вида, тест - ППН при инкубировании крови со специфичным аллергеном (ППД туберкулином) дает положительный результат (процент поврежденных нейтрофилов от 20 до 69,8%);

- у здоровых животных этот показатель не превышает 5%;

- у животных, зараженных микобактериями туберкулеза бычьего вида, тест-ППН при инкубировании крови с бруцеллезным и паратуберкулезными антигенами, эхинококковым аллергеном, а также с физиологическим раствором дает отрицательный результат;

- у морских свинок, зараженных атипичными микобактериями штамма М. smegmatis, тест - ППН при инкубировании крови со специфичным аллергеном и гетерогенными антигенами и аллергенами дает отрицательный результат.

2. Тест - ППН дает 100%-ную корреляцию результатов исследования зараженного и здорового крупного рогатого скота с таковыми при молекулярно-генетических исследованиях (ПЦР). При этом тест-ППН не требует дорогостоящей аппаратуры и выполним в любой ветеринарной лаборатории.

3. Наибольшее число неспецифических реакций у крупного рогатого скота, инвазированного гельминтами (фасциолами, дикроцелиумами, личинками эхинококков и другими) в РТ регистрируется при ларвальном эхинококкозе (50,6%).

4. Для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций успешно может быть применена модифицированная реакция Кацони с эхинококковым аллергеном, приготовленным по модифицированной нами технологии.

5. Экономическая эффективность на один рубль затрат при применении теста - ППН для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций составляет 37,28 руб.

Практические предложения

1. По результатам исследований разработаны и внедрены методические рекомендации «Показатели повреждении нейтрофилов (тест - ППН) для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота», утвержденные ГУВ КМ РТ от 6 апреля 2007 года.

2. По материалам исследований получено удостоверение на рационализаторское предложение № 444 от 30.06.03 г., которое может быть использовано для выявления животных, пораженных ларвальным эхинококкозом, а также для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота.

3. Теоретические и практические аспекты диссертации используются в учебной работе при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий и научных исследований в ФГОУ ВПО КГАВМ.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Латыпов, Ф.Р. Неспецифические туберкулиновые реакции у крупного рогатого скота / Ф.Р. Латыпов, Д.Г Латыпов.// Материалы конференции молодых ученых и специалистов Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. Казань, 2004. -С.35- 36.

2. Латыпов, Ф.Р. Неспецифические позитивные реакции на туберкулин при эхинококкозе крупного рогатого скота / Ф.Р. Латыпов, Д.Г. Латыпов, А.М. Идрисов, М.Х. Лутфуллин // Часть 2 материалах международного симпозиума ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний. Казань, 2005. - C. 217- 220.

3. Латыпов, Ф.Р. Показатели повреждения нейтрофилов (ППН) при экспериментальном туберкулезе морских свинок / Ф.Р. Латыпов, М.А.Сафин, Д.Г. Латыпов // «Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 450 - летию вхождения Удмуртии в состав России». Молодые ученые в реализации национальных проектов. 3 том. - Ижевск, 2006. - С.61-64.

4. Латыпов, Ф.Р. Показатель повреждения нейтрофилов (ППН тест) у кроликов, зараженных микобактериями туберкулеза. / Ф.Р. Латыпов // Сборник статей выпуск 3 ассоциации практикующих ветеринарных врачей Татарстана, Казанская государственная академия ветеринарной медицины. Ветеринарная медицина домашних животных. Казань, 2006. - С.65-68.

5. Латыпов, Ф.Р. Изучение теста ППН для диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве / Ф.Р. Латыпов // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана том 188. Казань, 2006. - С.145-150.

6. Латыпов, Ф.Р. Показатели повреждения нейтрофилов у морских свинок, зараженных атипичной штаммом микобактерии туберкулеза M. smegmatis /Ф.Р. Латыпов, М.А.Сафин, Д.Г. Латыпов // Материалы Всероссийской научно - практической конференции. - Казань, 2007. - С. 25-27.

7. Латыпов Ф.Р. Показатели повреждения нейтрофилов (тест - ППН) при экспериментальном туберкулезе на морских свинках /Ф.Р. Латыпов, М.А.Сафин, Д.Г. Латыпов // «Материалы Всероссийской научно - практической конференции. Казань, 2007. - С. 27 - 29.

Размещено на Allbest.ru