Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Молекулярно-генетическая идентификация хламидий, выделенных от животных

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

03.00.07. - Микробиология

Бакиров Ильяс Хасанович

Казань - 2007

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана» и ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности» (г. Казань)

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Равилов Рустам Хаметович

Научный консультант: кандидат биологических наук,

Вафин Рамиль Ришадович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Хазипов Нариман Залилович

доктор ветеринарных наук, профессор

Фаизов Тагир Хадиевич

Ведущее учреждение: ФГОУ ВПО «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита состоится 30 мая 2007 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д-220.034.01 при ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана» (420074 г. Казань, ул. Сибирский тракт, 35)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана» (420074 г. Казань, ул. Сибирский тракт, 35).

Автореферат разослан 26 апреля 2007 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета

профессор Ежкова М.С.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хламидиоз - контагиозная болезнь человека и животных, которая характеризуется широким спектром клинических проявлений заболевания - абортами, мертворождениями, рождением нежизнеспособного приплода, пневмониями, конъюнктивитами, энтеритами, артритами, энцефалитами, уретритами и другими клиническими признаками. Частое латентное, стертое или хроническое течение инфекционного процесса при хламидиозе, значительно усложняет контроль хламидийных энзоотий. Лабораторные методы диагностики хламидиоза, основанные на обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, выделении инфекционного агента на куриных эмбрионах, выявлении в сыворотках крови больных и переболевших животных специфических антител, имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа. Кроме того, возбудитель хламидиоза - внутриклеточный паразит со своеобразным циклом развития, геномика которого в настоящее время является перспективным объектом исследований микробиологов [Rasmussen S.J., Тimms P., 1992].

Исходя из этого, ведущим направлением в исследовании хламидиоза является молекулярно-биологические методы индикации и идентификации хламидий - ПЦР, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, секвенирование ДНК и другие [Grayston J.T., 1989, Kaltenboeck B. et al., 1992; Everett K.D. et al., 1999; Hartley J.C., 2001].

На сегодняшний день таксономия и классификация хламидий постоянно совершенствуется, главным образом благодаря анализу генома микроорганизма [Kaltenboeck B. et al., 1992; Everett K.D. et al., 1999]. По мнению некоторых исследователей в настоящее время изучаются штаммы, которые являются кандидатами на регистрацию новых видов хламидий.

Современная таксономия хламидий базируется на нуклеотидной последовательности консервативных видоспецифичных генетических маркеров - 16S и 23S фрагментов РНК, хотя для классификации видов хламидий также пригодны гены, кодирующие белки наружной мембраны (omp1 и omp2) хламидий [Zummerman P.A., 1989; Kaltenboeck B. et al., 1992; Everett K.D. et al., 1999; Hartley J.C., 2001], что позволяет более точно характеризовать виды хламидий по генетическому признаку.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлись молекулярно-генетические исследования штаммов хламидий на предмет их таксономической принадлежности, на основании сравнительного анализа участков генов, кодирующих синтез белков наружной мембраны (omp1 и omp2) возбудителя.

В соответствии с целью работы для решения были поставлены следующие задачи:

протестировать протоколы ПЦР-амплификации фрагментов omp1- и omp2-генов хламидий с использованием электрофоретического анализа продуктов реакции, при выделении ДНК возбудителя из клинических образцов;

определить нуклеотидную последовательность амплифицируемых фрагментов omp1- и omp2-генов у хламидий штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»;

произвести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей участков генов, кодирующих синтез белков наружной мембраны (omp1 и omp2) у разных штаммов хламидий;

провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков генома хламидий штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»;

изолировать новый штамм хламидий от кошек, изучить его биологические свойства.

Научная новизна. Подобран регламент выполнения полимеразной цепной реакции с препаратами ДНК хламидий для праймеров: Ch1 и Ch2, 5GPF и 3GPB.

Показана возможность дифференциации хламидий внутри вида путем электрофортического разделения продуктов рестрикции амплификатов в агарозном геле.

Впервые определены нуклеотидные последовательности амплифицируемых фрагментов omp1- и omp2-генов у хламидий штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93».

Впервые проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов хламидий («Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»).

Изолирован новый штамм хламидий от кошек при конъюнктивите, а также изучены его биологические свойства.

Практическая ценность. Апробированы молекулярно-генетические методы, позволяющие дифференцировать хламидий как внутри рода, так и внутри вида.

Полученные результаты могут быть использованы для определения видовой принадлежности штаммов хламидий в медицинских и ветеринарных лабораториях. Данные опубликованы в глобальной электронной базе данных European Bioinformatics Institute (EMBLE-EBI), Англия; GenBank (NCBI), США; DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Япония.

Результаты исследований позволили подтвердить хламидийную природу коньюнктивитов среди поголовья кошек в г. Казани. Изолированый при этом штамм возбудителя хламидиоза обладает выраженными антигенными и иммуногеными свойствами.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

Научно-практической конференции “Ветеринарная медицина домашних животных” (Казань, 2005 и 2006 гг.);

Ежегодных итоговых заседаниях проблемных советов ФГОУ ВПО “Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана” (2004-2006 гг.);

Научно-практической конференции молодых ученых ФГОУ ВПО “Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана” (Казань, 2006 г.);

XIV Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2006 г.).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

Основные положения, выдвигаемые для защиты:

протоколы полимеразной цепной реакции со специфичными праймерами для эффективной индикации и идентификации хламидий;

рестрикционная картина и нуклеотидная последовательность фрагментов генома хламидий штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»;

филограммы хламидий, построенные на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов omp1- и omp2-генов;

характерные биологические свойства нового штамма хламидий, изолированного от кошек.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста (текстовый редактор “Microsoft Word 2003”, стиль “Times New Roman”, размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (4 главы), обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 220 источников, в том числе 208 иностранных и 12 ссылок на сайты Internet). Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 9 рисунками. Прилагаются документы, подтверждающие научно-практическую ценность работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводились в 2004-2007 гг. на кафедре эпизоотологии с/х животных, кафедре патологии мелких животных и оперативной хирургии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана», лабораториях вирусологии и биохимии ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности».

На отдельных этапах работы исследования проводили совместно со старшим научным сотрудником, к.в.н. Евстифеевым В.В. и старшим научным сотрудником, к.в.н. Ахмадеевым Р.М., за что выражаем им свою искреннюю благодарность.

В работе были использованы имеющиеся в нашем распоряжении 4 штамма хламидий: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», выделенные соответственно от овцы, коровы, песца и собаки. Также в нашей работе был использован вновь выделенный нами штамм хламидий от кошки при конъюнктивите - «КК-05». Все штаммы адаптированы к размножению в куриных эмбрионах.

В работе в качестве лабораторных моделей были использованы: 6-7 дневные развивающиеся куриные эмбрионы - 200 шт., белые мыши массой 10-25 гр - 320 гол., морские свинки массой 150-350 гр - 25 гол., котята 2-3-месячного возраста - 7 гол.

Для амплификации фрагмента omp2-гена хламидий использовали семействоспецифичные праймеры, сконструированные Hartley J.С. с соавт. [2001]. Для амплификации фрагмента omp1-гена хламидий использовали специфичные праймеры, сконструированные Kaltenboeck B. с соавт. [1992].

Секвенирование продуктов амплификации omp2-гена с праймерами Ch1 и Ch2 и omp1-гена с праймерами 5GPF и 3GPB штаммов хламидий «Ростиново-70», «250» «ПП-87» и «КС-93» выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим».

Секвенированные последовательности исследованных штаммов хламидий omp2- и omp1 генов были проанализированы в сравнении с опубликованными геномами штаммов 6 видов рода Chlamydophila: psittaci, abortus, felis, caviae, pneumoniae и pecorum, используя программу CLUSTAL W (v.1,83) Multiple Sequence Alignments. При построении филограмм использовали алгоритм NJ.

Код входа в базы данных Генбанка (англ. GenBank accession number- A/N): последовательности оmp1- гена соответственно - X56980, M73037, AF269282, NC_000922, M73034; последовательности omp2-гена соответственно - М61116, U76760, AF367407, U41759, U76761, X53511.

Выделение, идентификацию и изучение биологических свойств (патогенность, токсичность, антигенность и иммуногенность) нового штамма хламидий проводили общепринятыми методами. В качестве серологических тестов использовали РСК, РИФ и ИФА.

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1 Индикация хламидий в ПЦР по локусу omp1-гена с праймерами 5GPF и 3GPB и их идентификация путем анализа ПДРФ

После проведения ПЦР, используя праймеры 5GPF и 3GPB, с экстрактами ДНК штаммов хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» у всех 4 штаммов были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона длиной 1378 пн. При последующем эндонуклеазном расщеплении продуктов амплификации ферментом HaeIII были получены 2 дискретных фрагмента длиной 1070 и 308 пн.

Результаты анализа ПДРФ ПЦР-продуктов (с праймерами 5GPF и 3GPB) имеющихся в нашем распоряжении штаммов хламидий показывают, что они отличаются от других микроорганизмов рода Chlamydophila (таблица 1).

1. Результаты ПЦР участка omp1-гена представителей рода Chlamydophila и анализа ПДРФ после обработки ампликонов ферментом HaeIII

шт. Ростиново-70	C. abortus шт. B577	C. psittaci шт. 6BC	C. felis шт. FEPN	C. caviae шт. GPIC
-	HaeIII	-	HaeIII	-	HaeIII	-	HaeIII	-	HaeIII
1378	1070 308	1372	1372	1411	987 424	1381	1073 257 51	1372	642 302 201 197 30

2.2.2 Индикация хламидий в ПЦР по локусу omp2-гена с праймерами Ch1 и Ch2 и их идентификация методом анализа ПДРФ

После проведения ПЦР, используя праймеры Ch1 и Ch2, с экстрактами ДНК штаммов хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» у всех 4 штаммов были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона длиной 587 пн. При последующем эндонуклеазном расщеплении продуктов амплификации ферментом AluI были получены 4 дискретных фрагмента длиной 192, 160, 140 и 95 пн.

Результаты анализа ПДРФ ПЦР-продуктов (с праймерами Ch1 и Ch2) имеющихся в нашем распоряжении штаммов хламидий показали, что они отличаются от представленных референтных штаммов микроорганизмов рода Chlamydophila (таблица 2).

2. Результаты ПЦР участка omp2-гена представителей рода Chlamydophila и анализа ПДРФ после обработки ампликонов ферментом AluI

шт. Ростиново-70	C. abortus шт. S26/3	C. psittaci шт. 6BC	C. felis шт. FEPN	C. caviae шт. GPIC	C. pneumoniae шт. IOL207	C. pecorum шт. W73
-	AluI	-	AluI	-	AluI	-	AluI	-	AluI	-	AluI	-	AluI
587	192 160 140 95	587	352 235	587	227 220 140	590	225 140 95 85 45	590	355 140 95	584	457 127	587	394 193

2.2.3 Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей секвенированных штаммов

Нуклеотидные последовательности амплифицированных участков omp1- и omp1-генов штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» имели между собой 100% гомологию. Поэтому при филогенетическом анализе были использованы полученные нами данные по сиквенированию фрагментов ДНК штамма хламидий «Ростиново-70».

Гетерогенность указанного штамма хламидий с официально зарегистрированным видам рода Chlamydophila по нуклеотидной последовательности фрагментов omp2- и omp1-генов представлены в таблице 3. Филогенетический анализ выравненных последовательностей фрагментов omp1- и omp2-генов штамма «Ростиново-70» с некоторыми штаммами официально зарегистрированных видов хламидий позволил определить его гетерогенность, которая в сравнении с ближайшим аналогом - Chlamydophila abortus - составляет соответственно 14 и 1,36%.

3. Гетерогенность изучаемых штаммов хламидий с представленными микроорганизмами рода Chlamydophila

Штамм	Ген	C. abortus	C. psittaci	C. felis	C. caviae	C. pneumoniae	C. pecorum
Ростиново-70	omp2	1,36%	3,58%	10,17%	10%	22,09%	27,77%
	omp1	14%	21%	21%	22%	30%	32%

С использованием алгоритма NJ программы CLUSTAL W (v.1,83) Multiple Sequence Alignments [http://align.genome.jp] нами были построены филограммы, которые дали родословные дендрограммы анализируемых видов рода Chlamydophila по амплифицированным фрагментам omp2- и omp1-генов (рисунок 1).

omp2 omp1

Рис. 1. Филограммы представителей рода Chlamydophila, построенные по сравнительному анализу нуклеотидных последовательностей амплифицированным фрагментов omp2- и omp1-генов.

Последовательности omp1- и omp2-генов ДНК штамма хламидий «Ростиново-70» опубликованы на сайте NCBI (GenBank, США) [http://.ncbi.nlm.nih.gov], в системе EMBLE-EBI (European Bioinformatics Institute, Англия) [http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz], а также DDBJ (DNA Data Bank of Japan, Япония) [http://srs.ddbj.nig.ac.jp/cgi-bin/wgetz].

2.2.4 Выделение нового штамма хламидий от кошек

В качестве клинического материала для выделения возбудителя хламидиоза были использованы смывы с конъюнктивы у кошки с признаками острого коньюнктивита. Хламидии были выделены на развивающихся куриных эмбрионах в первом же пассаже, штамм был назван «КК-05» («Казанский кошачий - 2005 года выделения»), специфическая гибель в первом пассаже наступала на 8-12 сутки после заражения.

Для идентификации хламидий из очищенной культуры изолята готовили комплементсвязывающий антиген, который испытывали в РСК в параллельных реакциях с иммунной сывороткой, полученной путем гиперимунизации морской свинки штаммом «КК-05», а также стандартными антигенами и позитивными сыворотками, изготовленными из возбудителя хламидиоза овец (штамм «Ростиново-70») и орнитоза (штамм «Лори») (таблица 4).

4. Результаты идентификации штамма хламидий «КК-05» в РСК

Гипериммунные сыворотки, полученные к штаммам хламидий	Антигены
	«КК-05»	«Ростиново-70»	«Лори»
«КК-05»	160 х	320	20
«Ростиново-70»	160	640	40
«Лори»	10	80	20

Обозначение: ^х - обратная величина титров антител.

Приведенные в таблице 4 данные свидетельствуют о принадлежности штамма микроорганизмов «КК-05» к хламидиям. В настоящее время штамм адаптирован к размножению в развивающихся куриных эмбрионах, прошел 15 пассажей, для длительного хранения хламидиосодержащий материал указанного штамма был подвергнут лиофилизации. Инфекционный титр нативного материала штамма «КК-05» составил 10^-5,5ЭЛД₅₀/0,3 мл.

2.2.5 Биологические свойства вновь выделенного штамма хламидий

Патогенность штамма, выделенного от кошки, для лабораторных животных изучали на белых мышах и морских свинках.

Изолят показал наибольшую вирулентность для белых мышей, при интрацеребральном, внутривенном и интраназальном заражениях. При этом гибель 100% инфицированных лабораторных животных наступала при всех трёх методах введения хламидиосодержащей суспензии. При сравнительном изучении чувствительность белых мышей к разным способам введения хламидиосодержащего материала наименьшая патогенность хламидий была выявлена при подкожной инъекции. При этом способе инфицирования у белых мышей реакция на введение суспензий хламидий составляла 40% от общего числа зараженных (таблица 5).

хламидия таксономический генетический

5. Патогенность штамма «КК-05» для лабораторных животных

Вид животных	Кол-во животных	Способ заражения	Доза заражения	Процент летальности
Морские свинки	4 4 4 4	и/н и/ц в/б п/к	0,1 0,05 2,0 2,0	0 0 0 0
Белые мыши	10 10 10 10 10	в/в и/н и/ц в/б п/к	1,0 0,05 0,03 0,5 0,5	100 100 100 50 40

Клиническая картина у белых мышей при внутривенном заражении характеризовалась: взьерошеностью шерстного покрова, нарушением координации движения (динамическая и статическая атаксия), снижением подвижности на вторые, а затем гибелью на 3-6 сутки после заражения. При вскрытии у павших обнаруживали увеличение и полнокровие печени и селезёнки. При интраназальном инфицировании белые мыши заболевали на 5-9 день. У них развивалась вялость, отсутствие пищевой возбудимости, шерсть теряла блеск, наблюдался конъюнктивит. Гибель зараженных животных наступала на 12-15 сутки после введения возбудителя. При вскрытии трупов наблюдали очаговое или генерализованое поражение легких. При интрацеребральном инфицировании заболевание наступало на 3-4 сутки и характеризовалось резким угнетением, атаксией как статической, так и динамической в начальной стадии и параличами в терминальной. Белые мыши погибали на 5-8 сутки при бурном нарастании нервных явлений. У некоторых лабораторных животных отмечали конъюнктивит. При вскрытии трупов отмечали отёк мозга, яркое проявление рисунка сосудов мозга, увеличение печении и селезенки. После внутривенного введения хламидиосодержащей суспензии у подопытных лабораторных животных развивалась типичная картина хламидиоза генерализованного характера, смерть в таком случае наступала на 3-4 сутки.

При внутрибрюшинном и подкожном инфицировании у подопытных белых мышей на 4-7 сутки отмечали развитие слабых признаков заболевания в виде угнетения, отсутствия пищевой возбудимости и других неспецифических симптомов. У некоторых животных (соответственно у 50 и 40% из числа зараженных) болезнь приобретала злокачественный характер и они погибали на 15-20 сутки. При вскрытии у павших обнаруживали скопление жидкости в брюшной полости и увеличение селезенки (при внутрибрюшинном инфицировании).

В мазках-отпечатках, приготовленных из головного мозга и паренхиматозных органов (лёгкие, печень, селезёнка и почки) белых мышей, при световой и люминесцентной микроскопии обнаружены морфологические структуры хламидий. Из патологического материала от павших белых мышей во всех случаях хламидии были реизолированы и идентифицированы.

При внутрибрюшинном и интранозальном введении 10%-ной хламидиосодержащей суспензий у морских свинок наблюдалась слабо выраженная реакция: повышение температуры тела до 39,4-39,6⁰С, угнетенное состояние, снижение пищевой возбудимости, развитие конъюнктивита на 2-3 сутки после инфицирования, однако на 4-5 сутки клиника заболевания исчезала и гибели этих лабораторных животных мы не наблюдали. Подкожное и интрацеребральное введение инфекционного материала также не вызывало гибель подопытных лабораторных животных.

Оставшиеся в живых после инфицирования морские свинки были убиты через месяц после заражения. Перед этим у них из сердца брали кровь для выявления в сыворотке специфических антител в РСК и ИФА. При внутрибрюшинном инфицировании титры антител составили: 1:5-1:40 и 1:100-1:200, при подкожном инфицировании 1:5-1:20 и 1:100 соответственно.

В мазках-отпечатках, приготовленных из головного мозга и паренхиматозных органов (лёгкие, печень, селезёнка и почки) убитых морских свинок, при световой и люминесцентной микроскопии были обнаружены соответственно морфологические структуры и специфическое свечение скопления антигена хламидий в клетках.

Возбудитель был реизолирован из тканей и органов инфицированных морских свинок. Установлено, что при интрацеребральном инфицировании возбудитель, в основном, локализовался в головном мозге и селезенке, при подкожном - в печени, селезенке и почках.

С целью изучения патогенности штамма “КК-05” для кошек были заражены шесть месячных котят, 3 из них подкожно, 3 - внутрибрюшинно. При этом у инфицированных животных наблюдали повышение температуры тела на 1-1,5⁰С, нарушение пищевой возбудимости и угнетенное состояние.

У двух котят (по одному зараженному подкожно и внутрибрюшинно) были зарегистрированы признаки одностороннего конъюнктивита.

Путём исследования в РСК и ИФА установлено накопление специфических антител в сыворотках крови зараженных котят в титрах 1:5-1:80 и 1:100-1:400 соответственно. При вскрытии вынужденно убитых животных были обнаружены: увеличение и дистрофия печени, кровоизлияния под капсулой почек и увеличение поджелудочной железы. При помощи световой и люминесцентной микроскопии были обнаружены соответственно морфологические структуры и антиген хламидий в патологическом материале.

При определении токсичности штамма изолированного от кошек на белых мышах, путем внутривенного введения 10%-ной свежеприготовленной хламидиосодержащей суспензии, было установлено, что изолят хламидий от кошек не обладает токсичностью, т.е. не наблюдается гибели белых мышей в течение первых 24 часов после введения им указанного инфекционного материала.

Результаты изучения антигенной активности штамма хламидий «КК-05» представлены в таблице 6. Данные таблицы 6 показывают, что из трех штаммов выделенных от плотоядных, наибольшую антигенную активность в перекрестных исследованиях имеют штаммы «ПП-87» и «КК-05». По этим свойствам они сравнимы с производственным штаммом «Ростиново-70», использующимся при изготовлении специфических антигенов и сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных в РСК.

6. Характеристика антигенных свойств штаммов хламидий

Гипериммунные сыворотки, полученные к штаммам	Титр антител при исследовании сывороток в РСК с антигеном из штамма
	«КК-05»	«Ростиново-70»	«250»	«ПП-87»	«КС-93»
«КК-05»	320Х	320	40	320	160
«Ростиново-70»	320	640	160	320	160
«250»	320	512	160	-	-
«ПП-87»	320	640	40	640	160
«КС-93»	20	320	-	160	160

Примечание: ^х- приведена обратная величина титров антител.

Для изучения иммуногенных свойств штамма хламидий «КС-05» были получены очищенные и сконцентрированные культуры хламидий по схеме, описанной в предыдущих главах. Затем хламидии были инактивированы 0,4%-ным (в конечной концентрации) формалином в течение 5 суток при 37⁰С. Взвесь, содержащую белок в количестве 30 мг/мл, вводили белым мышам внутрибрюшинно в дозе 0,5 мл.

Через 20 дней опытных и контрольных (интактных) белых мышей заражали 10%-ной взвесью желточных оболочек КЭ, инфицированных штаммом хламидий «КК-05», имеющей инфекционный титр 10^-5,5 ЭЛД₅₀/0,3 мл, в дозе 0,5 мл. Было проведено три серии опытов по 20 мышей в каждом. Полученные результаты представлены в таблице 7.

7. Характеристика иммуногенных свойств штамма хламидий «КК-05».

Группы белых мышей	Количество белых мышей в опыте	Количество павших животных	Эффективность иммунизации (%)
опытные контрольные	30 30	4 30	86,7 -

Проведенные исследования показывают, что однократное внутрибрюшное введение инактивированных формалином хламидий штамма «КК-05» защищает от заражения через 20 дней этим же штаммом 86,7 % белых мышей.

2.2.6 Молекулярно-генетические исследования нового штамма хламидий

Учитывая тот факт, что видоспецифические праймеры 5GPF и 3GPB, сконструированные Kaltenboeck B. с соавт. [1993], эффективно инициируют амплификацию локуса omp1-гена ДНК хламидий рода Chlamydophila, в том числе и Chlamydophila felis, мы использовали эти праймеры для идентификации указанного штамма хламидий.

При исследовании нового штамма «КК-05» методом ПЦР по фрагменту omp1-гена, с использованием праймеров 5GPF и 3GPB, нами был получен 1 ампликон размером от 1370-1390 пн.

Представленные данные указывают на его принадлежность к виду Chl. psittaci по признанной в нашей стране классификации микроорганизмов семейства Chlamydiaceae в 1992 году [Ma J.J. et al., 1987].

Более точные размеры полученного ампликона и сайты его рестрикции различными ферментами можно установить путем прямого секвенирования. Исследования в этом направлении будут продолжены.

ВЫВОДЫ

Полимеразная цепная реакция с видоспецифичными и семейственно-специфичными искусственно синтезированными олигонуклеотидными праймерами 5GPF/3GPB и Ch1/Ch2 соответственно является эффективным средством индикации и идентификации хламидий:

- ПЦР с экстрактами ДНК хламидий штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», используя праймеры 5GPF и 3GPB, дает одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона длиной 1378 пн, при последующей рестрикции которого ферментом HaeIII образуется 2 дискретных фрагмента длиной 1070 и 308 пн;

- ПЦР с экстрактами ДНК указанных штаммов хламидий, используя праймеры Ch1 и Ch2, также дает одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона длиной 587 пн, при последующей рестрикции которого ферментом AluI образуется 4 дискретных фрагмента длиной 192, 160, 140 и 95 пн.

Анализ нуклеотидных последовательностей амплифицируемых фрагментов omp1- и omp2-генов свидетельствует об их высокой внутривидовой консервативности у штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» со 100% гомологией.

Охарактеризованные нами штаммы: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» могут быть соотнесены в новый оригинальный вид хламидий, ранее системно не изученный молекулярно-биологическими методами и, соответственно, не рассмотренный юридической комиссией Международной ассоциации Микробиологических обществ:

- филогенетический анализ выравненных нуклеотидных последовательностей фрагмента omp1-гена штамма «Ростиново-70» с некоторыми штаммами официально зарегистрированных видов хламидий позволил определить его гетерогенность, которая в сравнении с ближайшим аналогом - видом Chlamydophila abortus - составляет 14%;

- филогенетический анализ выравненных нуклеотидных последовательностей фрагмента omp2-гена позволил определить его гетерогенность, которая в сравнении с ближайшим аналогом - видом Chlamydophila abortus - составляет 1,36%.

Филограммы на основе выравнивания нуклеотидных последовательностей omp1- и omp2-генов изучаемых штаммов и некоторых представителей официально зарегистрированных видов хламидий свидетельствуют, что по генетическому критерию первые занимают промежуточное положение между видами Chlamydophila abortus и Chlamydophila psittaci.

Изолирован новый штамм хламидий («КК-05») от кошек при конъюнктивите, который обладает характерными биологическими свойствами:

- инфекционный титр штамма для куриных эмбрионов составляет 10^-5,5 ЭЛД₅₀/0,3 мл;

- при интрацеребральном, внутривенном и интраназальном инфицировании белых мышей штамм вызывает гибель 100%, а при внутрибрюшном и подкожном - 50 и 40% зараженных животных;

- заражение штаммом морских свинок и котят не вызывает их гибели;

- инфицирование штаммом белых мышей, морских свинок и котят вызывает образование специфических антител, выявляемых в РСК и ИФА в диагностических титрах;

- штамм не обладает токсичностью;

- по антигенной активности штамм хламидий «КК-05» сравним с производственным штаммом «Ростиново-70»;

- однократное внутрибрюшное введение инактивированных формалином хламидий штамма «КК-05» защищает от заражения через 20 дней этим же штаммом 86,7 % иммунизированных белых мышей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Полученные данные позволят повысить уровень знаний о природе хламидий и эффективно использовать полученную информацию при научных исследованиях и в практической деятельности ветеринарных специалистов.

2. Протестированы протоколы проведения ПЦР с использованием видо- и семействоспецифичных праймеров 5GPF/3GPB и Ch1/Ch2 соответственно, которые позволяют проводить эффективную индикацию и идентификацию хламидий как в клиническом, так и в патологическом материале.

3. Материалы исследований опубликованы на интернет-сайтах GenBank (NCBI), США; European Bioinformatics Institute (EMBLE-EBI), Англия; DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Япония.

4. Полученные данные используются в учебном процессе на кафедре эпизоотологии, кафедре патологии мелких животных и оперативной хирургии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана».

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бакиров, И.Х. Индикация и идентификация хламидий в ПЦР со специфическими праймерами / Бакиров И.Х., Вафин Р.Р., Равилов Р.Х., Исхаков Г.М // Материалы научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных», Казань, 2005. - С.26-30.

2. Бакиров, И.Х. Результаты секвенирования штаммов хламидий, выделенных от сельскохозяйственных и мелких животных / Вафин Р.Р., Равилов Р.Х., Гафаров Х.З., Равилов А.З., Исхаков Г.М., Бакиров И.Х., Вафин Р.Р. // Материалы научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных», Казань,2005.-С.34-37.

3. Бакиров, И.Х. Новый штамм хламидий, изолированный от кошек при конъюнктивите/ Евстифеев В.В., Хусаинов Ф.М., Бакиров И.Х., Равилов Р.Х., Кашов В.Н., Исхаков Г.М. // Материалы научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных», Казань,2005. - С.45-47.

4. Бакиров, И.Х. Анализ результатов секвенирования штаммов хламидий / Бакиров И.Х // Материалы научно-практической конференции «Научно-практическая конференция молодых ученых», Казань, 2006.- С.7.

5. Бакиров, И.Х. Полиморфизм длины рестрикционых фрагментов продуктов амплификации хламидий / Бакиров И.Х., Вафин Р.Р. // Материалы научно-практической конференции «Научно-практическая конференция молодых ученых», Казань, 2006.- С.8.

6. Бакиров, И.Х. Выделение нового штамма хламидий при конъюнктивите у кошек / Евстифеев В.В., Хусаинов Ф.М., Бакиров И.Х., Кашов В.Н., Исхаков Г.М., Равилов Р.Х. // Материалы всероссийского ветеринарного конгресса «Международный Московский конгресс по болезням мелких домашних животных», Москва, 2006. - С.5.

7. Бакиров, И.Х. Биологические свойства штамма хламидий, выделенного при конъюнктивите у кошек / Бакиров И.Х., Равилов Р.Х., Евстифеев В.В., Хусаинов Ф.М., Кашов В.Н., Исхаков Г.М. // Материалы научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных», Казань, 2006.-С.56-59.

8. Бакиров, И.Х. Хламидиоз кошек / Бакиров И.Х, Равилов Р.Х., Исхаков Г.М., Евстифеев В.В., Хусаинов Ф.М. // Ученые записки КГАВМ - Казань. 2006.- С.19-26.

9. European Bioinformatics Institute, England. [Электронный ресурс] / EMBLE-EBI, England; Вафин Р.Р., Равилов Р.Х., Гафаров Х.З., Равилов А.З., Исхаков Г.М., Бакиров И.Х., Кашов В.Н., Вафин Р.Р.- Электрон. дан.- European Bioinformatics Institute, England, 2006-. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz, свободный.

10. DNA Data Bank of Japan. [Электронный ресурс]/ DDBJ; Вафин Р.Р., Равилов Р.Х., Гафаров Х.З., Равилов А.З., Исхаков Г.М., Бакиров И.Х., Кашов В.Н., Вафин Р.Р.- Электрон. дан.- DNA Data Bank of Japan, 2006-. - Режим доступа: http://srs.ddbj.nig.ac.jp/cgi-bin/wgetz, свободный.

11. GenBank NCBI, USA[Электронный ресурс] /GenBank NCBI; Вафин Р.Р., Равилов Р.Х., Гафаров Х.З., Равилов А.З., Исхаков Г.М., Бакиров И.Х., Кашов В.Н., Вафин Р.Р.- Электрон. дан.- GenBank NCBI, USA, 2006-.-Режим доступа: ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=74423036; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=74423038, код входа: DQ177459, DQ177460. - Загл. с экрана.

Размещено на Allbest.ru