22

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Генотипирование чёрно-пёстрого скота по локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и BLAD-мутации методами ДНК-технологии

06.02.07. - Разведение, селекция

и генетика сельскохозяйственных животных

Валиуллина Эльвира Фанилевна

Казань - 2012

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана"

Научный руководитель: доктор биологических наук

Ахметов Тахир Мунавирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мухаметгалиев Нурвахит Нургалиевич

доктор ветеринарных наук, профессор

Фаизов Тагир Хадиевич

Ведущая организация: ФГНУ "Всероссийский научно-исследовательский

институт племенного дела", Московская область,

Пушкинский р-н, п. Лесные Поляны.

Защита диссертации состоится " 20 " января 2012 г. в " 15.00 " часов на заседании диссертационного совета Д.220.034.02 при ФГБОУ ВПО "Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана" по адресу: 420029, г. Казань, Сибирский тракт, 35; тел. (8432) 73-96-17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО "Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана", автореферат размещен в сети интернет на сайте www.ksavm. senet.ru/ru_doska. php и www.mon.gov.ru.

Автореферат разослан " " декабря 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Р.Я. Гильмутдинов

1. Общая характеристика работы

Актуальность. Насыщение рынка продовольствия качественными продуктами отечественного производства в достаточном объёме невозможно без интенсификации животноводства, где одной из составляющих является эффективная селекция. Сегодня уже ни у кого не вызывает сомнения эффективность использования генетических маркёров, таких как группы крови, биохимические белки, ферменты, а также новых маркёров, выявляемых с помощью ПЦР-анализа (полимеразная цепная реакция). Применение такой маркёрной технологии в селекции позволяет выявлять генетические дефекты и прогнозировать генетический потенциал продуктивности животных сразу после рождения (Г.М. Гончаренко, 2009).

Опыт многих стран с развитым животноводством свидетельствует о важности использования генетических маркеров, которые связаны с качественными признаками молочной продуктивности крупного рогатого скота. В качестве потенциальных маркеров молочной продуктивности могут рассматриваться гены молочных белков, а именно каппа-казеина и бета-лактоглобулина (Е.С. Усенбеков, 1995; Б.С. Иолчиев, В.И. Сельцов, 1999; Л.А. Калашникова, 2003; Е.А. Денисенко, 2004; О.В. Костюнина, 2005; Н.Н. Мухаметгалиев, 2006; Э.Ф. Валиуллина и др., 2007; Я.А. Хабибрахманова, 2009, О.Г. Зарипов, 2010).

Ген каппа-казеина связан с белковомолочностью и технологическими свойствами молока. Аллель В гена каппа-казеина ассоциирован с более высоким содержанием белка в молоке. Ген бета-лактоглобулина отвечает за белковомолочность и показатель биологической ценности молока (N. Strzalkowska et al., 2002; Н.А. Зиновьева и др., 2002; Т.М. Ахметов, 2009; Р.А. Хаертдинов, М.П. Афанасьев, Р.Р. Хаертдинов, 2009). Аллель В гена бета-лактоглобулина связан с высоким содержанием в молоке казеиновых белков, высоким процентом жира, тогда как аллель А характеризуется с высоким содержанием сывороточных белков.

Широкий обмен генетическим материалом между странами сопровождается распространением различных инфекционных заболеваний, а также заболеваний, вызываемых редкими мутациями, возникающими у выдающихся представителей коммерческих пород. В отдельных случаях наблюдается высокая скорость распространения таких мутаций. Огромный экономический ущерб обусловливает необходимость строгого генетического контроля импортируемого генетического материала, а также изучение возможных механизмов распространения мутаций (В.И. Глазко и др., 2001; А.Е. Маріуца, 2005).

Одним из таких наследственных заболеваний крупного рогатого скота является BLAD-мутация, характеризующаяся дефицитом лейкоцитарной адгезии (Р.В. Биккинин, 2007; Г.М. Гончаренко, 2009).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение полиморфизма генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина, определяющих молочную продуктивность и технологические свойства молока крупного рогатого скота, а также выявление животных-носителей ВLAD-мутации.

Учитывая вышеизложенное, в настоящей работе поставлены следующие задачи:

совершенствовать технику выделения ДНК из крови и спермы крупного рогатого скота для молекулярно-генетических исследований;

совершенствовать технику проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и BLAD-мутации; разработать новые способы проведения ПЦР;

изучить частоту отдельных типов каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций, а также BLAD-мутации у крупного рогатого скота;

определить молочную продуктивность коров и матерей быков-производителей с разными генотипами каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций;

оценить технологические свойства молока коров с разными генотипами каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций.

Научная новизна. Усовершенствована техника выделения ДНК из крови, спермы и проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по генам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и BLAD-мутации. Разработаны способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина. Выявлен полиморфизм и определена частота встречаемости аллелей и генотипов по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и BLAD-мутации. Изучена молочная продуктивность, качество и технологические свойства молока чёрно-пёстро х голштинских коров в зависимости от генотипов каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций.

Практическая значимость. Разработанные и усовершенствованные приемы проведения ПЦР-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и BLAD-мутации позволяют вести грамотную селекционно-племенную работу на повышение молочной продуктивности и улучшение технологических свойств молока коров, а также выведение из разведения животных-носителей BLAD-мутации.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

всероссийской научно-практической конференции "Технологические и технические аспекты развития сельского хозяйства", посвященной 85-летию КГАУ (Казань, 2007);

международной научно-практической конференции "Современные подходы развития АПК", посвященной 135-летию КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2008);

международной научно-практической конференции "Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства (Казань, 2010).

полиморфизм ген мутация крупный рогатый скот

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 12 научных статей, в том числе 8 в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен 1 патент РФ на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту.

Усовершенствованная нами техника экстракции ДНК и проведения ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и BLAD-мутации позволяет проводить маркирование аллелей и генотипов, связанных у животных с молочной продуктивностью и резистентностью к заболеваниям.

Разработанные нами способы высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 в усовершенствованной технике 2-х стадийной ПЦР обеспечивают более результативную наработку специфичных ампликонов, которые далее являются мишенями для праймеров в системе 100% комплементарности.

Определен аллельный полиморфизм генов CSN3, LGB и BLAD-мутации у чёрно-пёстрого скота в условиях Республики Татарстан.

Наличие в геноме чёрно-пёстро х голштинских коров В-аллеля гена CSN3 и А-аллеля гена LGB приводит к повышению показателей молочной продуктивности. При этом молоко от чёрно-пёстро х голштинских коров, несущих в своем геноме В-аллель генов CSN3 и LGB более сыропригодное, тогда как молоко от животных, имеющих в геноме А-аллель более устойчивое к тепловой обработке.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 158 страницах, содержит 24 таблицы, 17 рисунков. Состоит из: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, предложения производству, списка использованной литературы (всего 220 источников, в том числе 75 иностранных) и приложения.

2. Материалы и методы исследования

Исследования по теме диссертационной работы проводились в период с 2005 по 2011 гг. на кафедре технологии животноводства ФГБОУ ВПО "Казанская государственный академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана", в отделе генно-молекулярной диагностики ФГБУ "Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория", в ГУП головном племенном предприятии "Элита" Высокогорского района и ООО им. Тукая Балтасинского района Республики Татарстан.

Научно-хозяйственные опыты поставлены согласно схеме исследования (рис.1).

Для определения полиморфизма генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина, оценки молочной продуктивности и технологических свойств молока у коров с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина было отобрано в ООО им. Тукая 107 чёрно-пёстро х голштинских коров. Также определили полиморфизм генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у отобранных 70 чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей в ГУП ГПП "Элита". Наряду с этим, провели на данном поголовье исследования для выявления носителей BLAD-мутации.

Определение частоты А и В аллелей, генетических вариантов каппа-казеина и бета-лактоглобулина, а также наличие носителей BLAD-мутации у коров и быков-производителей проводили методами ДНК-технологиии.

По принципу аналогов (А.И. Овсянников, 1976) были сформированы группы чёрно-пёстро х голштинских коров-первотелок с разными генотипами каппа-казеина, бета-лактоглобулина, а также с разными комбинациями генотипов CSN3/LGB.

При проведении научно-хозяйственных опытов использовали документацию зоотехнического и племенного учета ООО им. Тукая (материалы годовых отчётов и бонитировки, племенные свидетельства, карточки быков-производителей и коров - форма 1-МОЛ и 2-МОЛ, а также акты контрольных доек коров).

Основным фоном, на котором были изучены хозяйственно-полезные и другие биологические особенности крупного рогатого скота с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина были одинаковые условия кормления и содержания, что способствовало более полному проявлению генетических особенностей животных.

Рис.1. Схема исследования

Рационы коров ООО им. Тукая в основном, состояли из местных кормов. В зимний период основными кормами были: сено кострецовое, силос кукурузный, сенаж из однолетних трав, патока кормовая, которые животные получали в равных количествах. При этом корнеклубнеплоды, концентрированные корма и минерально-витаминные добавки задавались животным из расчета живой массы, а также фактического удоя коров. В летний период основными кормами были: зелёного корма на пастбище и в виде резки при стойловом содержании. Концентраты давали коровам из расчета 300-360 г на 1 кг молока. Структура рациона по питательности в зимний период состояла из грубых кормов - 18-21%, сочных - 40-46%, концентрированных - 33-38%, в летний период - зеленые корма - 79-82%, концентрированные 18-21%. При этом затраты кормов составили 0,97-1,04 ЭКЕ, соответственно за лактацию 5095-5150 ЭКЕ. В ООО им. Тукая рационы кормления коров были составлены с учетом норм и рационов кормления сельскохозяйственных животных (А.П. Калашников и др., 2003).

Кровь, отобранную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ. Сперма от быков-производителей поступала в замороженном виде.

Выделение ДНК из крови и спермы проводили разработанными и усовершенствованным нами аммиачным и комбинированным щелочным способом.

Анализ локуса гена каппа-казеина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере "Терцик" (Россия) в объеме реакционной смеси 20 мкл, с использованием следующих праймеров:

1) Праймеры AB1: 5^/-TGTGCTGAGTAGGTATCCTAGTTATGG-3^/ и АВ2: 5^/-GCGTTGTCTTCTTTGATGTCTCCTTAG-3^/, сконструированные А. Барросо и др. (A. Barroso et al, 1998) для амплификации фрагмента длиной 453 bp.

2) Праймеры К1: 5^/-GAAATCCCTACCATCAATACC-3^/ и К2: 5^/-CCATCTA CGCTAGTTTAGATG-3^/, сконструированные С. Камински (S. Kaminski, 1993) для амплификации фрагмента длиной 271 bp.

3) Праймеры JК5: 5^/-АТСАТТТАТGGCCATTCCACCAAAG-3^/ и JКЗ: 5^/-GCCCAT TTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3^/, сконструированные Дж.Ф. Медрано и Е. Акилар-Кордова (J. F. Medrano and E. Aguilar-Cordova, 1990) для амплификации фрагмента длиной 350 bp.

4) Праймеры JK5-hs: 5^/-GGGGGATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3^/ и JK3-hs: 5^/-CCCCGCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3^/, сконструированные Р.Р. Вафиным и др. (2007) для амплификации фрагмента длиной 359 bp.

5) Праймеры N-JK5: 5^/-GGGCAGAGGTGATTATGGCCATTCCACCAAAG-3^/ и N-JK3: 5^/-GGGCAGAGGTGATTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3^/, сконструиро-ванные Р.Р. Вафиным и др. (2007) для амплификации фрагмента длиной 363 bp.

Для ПДРФ-идентификации генотипов гена каппа-казеина 20 мкл ПЦР-пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Hinf I в 1Чбуфере "О" фирмы СибЭнзим (Россия) или 10 ед. эндонуклеазы рестрикции HindIII в 1Чбуфере "W" фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 ⁰С течение ночи.

6) Праймеры B-F-hs: 5^/-СССССGTGAGCCTACAAGTACACCTACCAT-3^/, B-R-hs: 5^/-СССССGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACC-3^/, A-F-hs: 5^/-GGGGGCT GTTCACACACAAAAACAGTAAAG-3^/ и A-R-hs: 5^/-GGGGGGTGCCTAACCTTA TACAGCCTTTCG-3^/, сконструированные Р.Р. Вафиным и др. (2008) для амплификации фрагментов длиной 242 bp (А) и 156 bp (В).

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 50 мин в 1ЧТВЕ буфере.

Анализ локуса гена бета-лактоглобулина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере "Терцик" (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров BLGP3: 5^/-GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA-3^/ и BLGP4: 5^/-CAGGACACCGGCTCCCGGTATATGA-3^/, сконструированных Дж.Ф. Медрано и Е. Акилар-Кордова (J. F. Medrano and E. Aguilar-Cordova, 1990) для амплификации фрагмента длиной 262 bp.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Hae III в 1Чбуфере "С" фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 ⁰С течение ночи.

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1ЧТВЕ буфере.

Анализ BLAD-мутации. ПЦР проводили на программируемом термоциклере "Терцик" (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров BLAD-F: 5^/-TCCGGAGGGCCAAGGGCTA-3^/ и BLAD-R: 5^/-GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGT AGTACAGG-3^/, сконструированных К.Е. Грир и др. (C. E. Greer et al., 1991).

Для выявления BLAD-мутации 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Hae III в 1Чбуфере "С" фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 ⁰С течение ночи.

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 4,0% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1ЧТВЕ буфере.

Частоту встречаемости генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина определяли по формуле:

p = n/N,

где р - частота определения генотипа, n - количество особей,

имеющих определенный генотип, N - число особей.

Частоту отдельных аллелей определяли по формуле:

Р_А = (2nAA+nAB): 2N и q_B = (2nBB+nAB): 2N,

где P_{А -} частота аллеля А,

q_B - частота аллеля В, N - общее число аллелей.

По закону Харди-Вайнберга (В.Л. Петухов, А.И. Жигачёв, Г.А. Назарова, 1985) рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции.

Молочную продуктивность определяли ежемесячно путём проведения контрольных доек (ежедекадно). Содержание жира и белка в молоке определяли на приборе ЛАКТАН 1-4. Для определения сыропригодности молока использовали сычужную и сычужно-бродильную пробы, согласно ГОСТа 9225-84. Термоустойчивость молока определяли по тигловой пробе.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Excel. Уровень достоверности полученных результатов определяли по критерию Стьюдента.

3. Результаты собственных исследований

3.1 Разработка и совершенствование техники выделения ДНК из крови и спермы

ДНК из крови выделяли разработанным нами аммиачным и комбинированным щелочным способом.

Выделенные нами препараты ДНК из крови и спермы аммиачным и комбинированным щелочным способами показали эффективность своего применения в ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по генам каппа-казеина и бета-лактоглобулина, а также для выявления у него носителей BLAD-мутации.

Комбинированный щелочной способ выделения ДНК из крови и спермы крупного рогатого скота позволяет сохранить экстрагированные нуклеиновые кислоты для ПЦР-анализа в течение 1 года с более чем 30 кратной заморозкой-разморозкой.

3.2 Совершенствование техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина

Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену каппа-казеина нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров: AB1+АВ2, К1+К2, JK5+JK3 по усовершенствованной нами технике ПЦР-ПДРФ (см. "2. Материалы и методы исследования").

Праймеры AB1+AB2 инициируют амплификацию фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 453 bp, а ПДРФ-HinfI профиль (AA=326/100/27 bp, BB=426/27 bp и AB=426/326/100/27 bp) и ПДРФ-HindIII профиль (AA=453 bp, BB=351/102 bp и AB=453/351/102 bp) идентифицируют его генотипы (рис.2).

Рис.2. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами AB1+AB2 и эндонуклеазным расщеплением ферментом HinfI или HindIII

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 bp (СибЭнзим);

1) цельный ПЦР-фрагмент генотипа BB гена каппа-казеина (453 bp);

2) генотип BB (426/27 bp (HinfI));

3) генотип BB (351/102 bp (HindIII));

4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (453 bp);

5) генотип АА (326/100/27 bp (HinfI));

6) генотип АА (453 bp (HindIII));

7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа AB гена каппа-казеина (453 bp);

8) генотип AB (426/326/100/27 bp (HinfI));

9) генотип AB (453/351/102 bp (HindIII)).

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами AB1+AB2 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов. Слабый "фон неспецифики" по сравнению с сильным ПЦР-сигналом (453 bp) существенно не влияет на информативность и точность интерпретации генотипов.

Праймеры K1+K2 инициируют амплификацию фрагмента гена-каппа казеина крупного рогатого скота длиной 271 bp, а ПДРФ-HinfI профиль (AA=131/91/49 bp, BB=222/49 bp и AB=222/131/91/49 bp) и ПДРФ-HindIII профиль (AA=271 bp, BB=182/89 bp и AB=271/182/89 bp) позволяют установить его генотипы (рис.3).

Рис.3. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами K1+K2 и эндонуклеазным расщеплением ферментом HinfI или HindIII

Обозначения:

1) цельный ПЦР-фрагмент генотипа BB гена каппа-казеина (271 bp);

2) генотип BB (222/49 bp (HinfI));

3) генотип BB (182/89 bp (HindIII));

4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (271 bp);

5) генотип АА (131/91/49 bp (HinfI));

6) генотип АА (271 bp (HindIII));

7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа AB гена каппа-казеина (271 bp);

8) генотип AB (222/131/91/49 bp (HinfI));

9) генотип AB (271/182/89 bp (HindIII); М) ДНК-маркеры 1500-100 bp (СибЭнзим).

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ-анализа гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами K1+K2 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов; а наличие димерности (трек 1, 3, 4, 6, 7 и 9) на одной длине с информативным фрагментом HinfI рестрикции (49 bp) не снижает эффективности генотипирования с данным протоколом реакции.

Праймеры JK5+JK3 инициируют амплификацию фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 350 bp, а ПДРФ-HinfI профиль (AA=134/131/85 bp, BB=265/85 bp и AB=265/134/131/84 bp) позволяет установить его генотипы (рис.4).

Рис.4. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами JK5+JK3 и эндонуклеазным расщеплением ферментом HinfI

Обозначения: 1-4) генотип BB (265/85 bp (HinfI)); 5-6) генотип AA (134/131/85 bp (HinfI)); 7-8) генотип AB (265/134/131/84 bp (HinfI));

9) цельный ПЦР-фрагмент генотипа AB гена каппа-казеина (350 bp); М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим).

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами JK5+JK3 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов. Для точной интерпретации генотипов необходимо делать ориентир на мажорные идентифицирующие ПДРФ-HinfI фрагменты: 265 bp (генотип ВВ), 134/131 bp (АА) и 265/134/131 bp (АВ) соответственно.

3.3 Разработка способа проведения высокоточной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина

Разработанный нами способ проведения высокоточной ПЦР, схож с разновидностями "touch up" ПЦР (F. Weighardt, G. Biamonti, S. Riva, 1993; M. Ailenberg, M. Silverman, 2000) тем, что в качестве праймеров используются олигонуклеотиды, которые состоят из 3^/-участка, комплементарного последовательности-мишени, и 5^/-участка, не комплементарного последовательности-мишени, отличим тем, что в качестве праймеров используются олигонуклеотиды с потенциальной температурой гибридизации по всей длине, превышающей температуру отжига их 3^/-комплементарного участка на 5-10⁰С, а при проведении ПЦР отжиг ведут при температуре, соответствующей указанной потенциальной температуре гибридизации.

Выбранная стратегия проведения высокоточной ПЦР основывается на том, что используется фиксированная температура потенциального оптимума отжига праймеров по всей 5^/-3^/ длине, при этом связывание 3^/-комплементарного участка олигонуклеотида с нуклеиновой кислотой исследуемого биологического объекта затрудняется в виду несоответствия температур гибридизации на 5-10⁰С, однако неспецифичное праймирование находится в значительно более угнетенном состоянии, чем достигается более эффективная наработка только специфичных ампликонов, которые в дальнейшем являются мишенями для праймеров в системе 100% комплементарности.

Разработанный способ проведения высокоточной ПЦР нами протестирован в сравнении с классической ПЦР и ближайшим аналогом на предмет оценки аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота.

На основании положительного результата по исключению неспецифичной амплификации при использовании предлагаемого способа проведения ПЦР с модифицированными праймерами JK5-hs и JK3-hs нами были предприняты дальнейшие действия по усовершенствованию режима 2-х стадийной ПЦР с температурным совмещением стадий отжига и синтеза при 68 (72) ⁰С (рис.5 и 6).

Рис.5. ПЦР-ПДРФ-HinfI (HindIII) профиль гена каппа-казеина крупного рогатого скота, инициированный праймерами JK5-hs и JK3-hs при температуре 68⁰С на стадии "отжиг-синтез"

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 bp (СибЭнзим);

1) цельный ПЦР-фрагмент генотипа BB гена каппа-казеина (359 bp);

2) генотип BB (270/89 bp (HinfI));

3) генотип BB (222/137 bp (HindIII));

4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (359 bp);

5) генотип АА (139/131/89 bp (HinfI));

6) генотип АА (359 bp (HindIII));

7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа AB гена каппа-казеина (359 bp);

8) генотип AB (270/139/131/89 bp (HinfI));

9) генотип AB (359/222/137 bp (HindIII)).

Рис.6. ПЦР-ПДРФ-HinfI (HindIII) профиль гена каппа-казеина крупного рогатого скота, инициированный праймерами JK5-hs и JK3-hs при температуре 72⁰С на стадии "отжиг-синтез"

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 bp (СибЭнзим);

1) цельный ПЦР-фрагмент генотипа BB гена каппа-казеина (359 bp);

2) генотип BB (270/89 bp (HinfI));

3) генотип BB (222/137 bp (HindIII));

4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (359 bp);

5) генотип АА (139/131/89 bp (HinfI));

6) генотип АА (359 bp (HindIII));

7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа AB гена каппа-казеина (359 bp);

8) генотип AB (270/139/131/89 bp (HinfI));

9) генотип AB (359/222/137 bp (HindIII)).

В режиме 2-х стадийной ПЦР модифицированные праймеры JK5-hs и JK3-hs эффективно инициируют амплификацию фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 359 bp, а ПДФР-HinfI профиль (AA=139/131/89 bp, BB=270/89 bp и AB=270/139/131/89 bp) и ПДФР-HindIII профиль (AA=359 bp, BB=222/137 bp и AB=359/222/137 bp) идентифицируют его генотипы (рис.5 и 6).

Полученные результаты ПДРФ-ПЦР гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами JK5-hs +JK3-hs являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

Таким образом, разработанный способ и усовершенствованная техника проведения высокоточной ПЦР в режиме 2-х стадийной ПЦР с температурным совмещением стадий отжига и элонгации при 68 (72) ⁰С является действенным инструментом генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина.

3.4 Разработка способа проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина

Существуют различные способы ДНК-анализа аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота (J. F. Medrano, Е. Aguilar-Cordova, 1990; S. Kaminski, 1993; G. Rincon and J. F. Medrano, 2003), среди которых выделяется способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина.

В способе проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина, предложенном Г. Ринкон и Дж. Медрано (G. Rincon and J. F. Medrano, 2003) используется принцип тетра-праймерной ARMS-PCR, где в реакции применяют 4 олигонуклеотида, два из которых являются внешними (общие праймеры "JK5" и "JK3"), инициирующие при совместном фланкировании амплификацию фрагмента ДНК гена каппа-казеина любого из его аллелей, а остальные два - внутренними (аллель-специфичные праймеры "INNERKCAS FORWARD" и "INNERKCAS REVERSE"), каждый из которых при совместном фланкировании только с одним из внешних праймеров инициирует амплификацию соответствующего аллель-специфичного фрагмента ДНК. Следует отметить, что каждый внутренний праймер помимо рефрактерного 3^/-терминального "mismatch-нуклеотида" имеет дополнительный некомплементарный ни к одному из аллелей гена каппа-казеина "mismatch-нуклеотид" в позиции - 2 от 3^/-терминального нуклеотида ( - 0 +) праймера (рис.7).

Нами разработан способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина, схожий со способом, предложенным Г. Ринконом, Дж. Медрано (G. Rincon, J. F. Medrano, 2003), включающим подготовку пробы нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, 4-х праймеров; проведение ПЦР; детекцию амплифицированных фрагментов ДНК методом гель-электрофореза; отличающийся тем, что, используются другие последовательности праймеров, все из которых являются аллель-специфичными, не имеющие дополнительных некомплемен - тарных ни к одному из аллелей гена каппа-казеина крупного рогатого скота "mismatch-нуклеотидов" в позиции - 2 от 3^/-терминальных нуклеотидов праймеров, но имеющие 5^/-некомплементарные участки (n) длиной 5-3 нуклеотидов: В-аллель-специфичные праймеры "B-F-hs" и "B-R-hs", которые инициируют амплификацию В-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 156 bp; А-аллель-специфичные праймеры "A-F-hs" и "A-R-hs", которые инициируют амплификацию А-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 242 bp; проводят 2-х стадийную ПЦР с совмещением температуры отжига и синтеза при 72⁰С (рис.7).

Рис.7. Электрофореграмма предложенного способа аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина с праймерами "B-F-hs"+"B-R-hs"+"A-F-hs"+"A-R-hs".

Обозначения: M) ДНК-маркеры 100-1000 bp (СибЭнзим);

1) генотип АА гена каппа-казеина кр. рог. ск (242 bp);

2) генотип ВВ гена каппа-казеина кр. рог. ск (156 bp);

3) генотип АВ гена каппа-казеина кр. рог. ск. (242/156 bp).

Разработанный способ проведения аллель-специфичной ПЦР с протоколом 2-х стадийной ПЦР является более эффективным способом генотипирования гена каппа-казеина, в сравнении со способами ПЦР-ПДРФ, в связи с тем, что не требует проведения обработки ПЦР-продукта рестриктазами, таким образом, сокращая время анализа и материальные затраты.

3.5 Совершенствование техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина

Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина нами была протестирована пара олигонуклеотидных праймеров: BLGP3+BLGP4 по усовершенствованной нами технике ПЦР-ПДРФ (см. "2. Материалы и методы исследования").

Праймеры BLGP3+BLGP4 инициируют амплификацию фрагмента гена бета-лактоглобулина крупного рогатого скота длиной 262 bp, а в-LGB-ПДРФ-HaeIII профиль (AA=153/109 bp, BB=109/79/74 bp и AB=153/109/79/74 bp) идентифицирует его генотипы (рис.8).

Рис.8. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена в-лактоглобулина крупного рогатого скота с праймерами BLGP3+BLGP4 и эндонуклеазным расщеплением ферментом HaeIII

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим); 1, 4,5) генотип АВ (153/109/79/74 bp);

2,8) генотип АА (153/109 bp); 3, 6,7) генотип ВВ (109/79/74 bp);

9) цельный ПЦР-фрагмент гена бета-лактоглобулина (262 bp).

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ с праймерами BLGP3+BLGP4 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина.

3.6 Совершенствование техники ПЦР-ПДРФ для выявления у крупного рогатого скота BLAD-мутации

Для оценки качества работы известных протоколов по выявлению у крупного рогатого скота BLAD-мутации нами была протестирована пара олигонуклеотидных праймеров: BLAD-F+BLAD-R по усовершенствованной нами технике ПЦР-ПДРФ (см. "2. Материалы и методы исследования").

Праймеры BLAD-F+BLAD-R инициируют амплификацию фрагмента для выявления BLAD-мутации крупного рогатого скота длиной 58 bp (рис.9).

Рис.9. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ для выявления у крупного рогатого скота BLAD-мутации с праймерами BLAD-F+BLAD-R и эндонуклеазным расщеплением ферментом HaeIII

Обозначения:

1) цельный ПЦР-фрагмент гена CD 18 (58 bp); 2, 3, 4,5) генотип с отсутствием BLAD-мутации; М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим).

У здоровых животных ПДРФ-HaeIII профиль 49/9 bp, у больных животных 30/19/9 bp и у животных-носителей BLAD-мутации 49/30/19/9 bp.

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ с праймерами BLAD-F+BLAD-R являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и выявления у крупного рогатого скота BLAD-мутации.

Следует отметить, что из протестированных 70 быков-производителей, принадлежащих ГУП ГПП "Элита" и 107 коров, принадлежащих ООО им. Тукая методом ПЦР на носительство BLAD-мутации, нами не выявлено ни одного животного-носителя данного генетического заболевания.

3.7 Оценка полиморфизма генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у крупного рогатого скота

Анализ результатов ДНК-тестирования быков-производителей по локусу гена каппа-казеина показал, что из 70 быков 48 (68,6%) имели генотип АА; 18 (25,7%) - АВ и желательный генотип ВВ - 4 (5,7%). При этом частота аллеля А была на уровне 0,81, а аллеля В - 0, 19. Среди коров получены следующие результаты, что из 107 коров 68 (63,6%) имели генотип АА; 36 (33,6%) - АВ и лишь 3 (2,8%) - ВВ. При этом частота аллеля А составила 0,80, а аллеля В - 0,20 (табл.1).

Таблица 1. Частота встречаемости генотипов и аллелей гена каппа-казеина у быков-производителей и коров

Хозяйство	n	Частота генотипов	Частота аллелей	ч2
		АА	АВ	ВВ
		n	%	n	%	n	%	А	В
ГУП ГПП "Элита"	Н	70	48	68,6	18	25,7	4	5,7	0,81	0, 19	0,85
	О		46	65,6	21	30,8	3	3,6
ООО им. Тукая	Н	107	68	63,6	36	33,6	3	2,8	0,80	0, 20	0,38
	О		69	64,0	34	32,0	4	4,0

Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов.

Расчет соответствия фактического распределения генотипов по локусу каппа-казеина теоретически ожидаемому с использованием методов Харди-Вайнберга и ч2 показал, что в данных стадах быков-производителей и коров не имеется статистически достоверного сдвига генетического равновесия ни по одному из трех генотипов. Следовательно, в данных стадах не проводился искусственный отбор, затрагивающий генотипы животных по локусу гена каппа-казеина.

С помощью метода ПЦР-анализа быков-производителей по локусу гена бета-лактоглобулина нами получены следующие результаты. Так из 70 быков-производителей 9 (12,9%) имели генотип АА, 26 (37,1%) - генотип АВ и 35 (50,0%) быков - генотип ВВ. При этом частота аллеля А составила 0,31, а аллеля В - 0,69. Из 107 коров 14 имели генотип АА, 60 коров - генотип АВ, 33 коровы - генотип ВВ. Частота гомозиготного генотипа АА составила 13,1%, гетерозиготного генотипа АВ - 56,1%, гомозиготного генотипа ВВ - 30,8%, при этом частота аллеля А составила 0,41 и аллеля В - 0,59 соответственно (табл.2).

Таким образом, использование математического анализа методом Харди-Вайнберга и методом ч2 показало, что в стадах быков-производителей и коров нет статистически достоверного смещения генетического равновесия ни по одному из трех генотипов локуса гена бета-лактоглобулина (АА, АВ и ВВ). Полученные результаты показывают, что в этих стадах не проводится искусственный отбор, затрагивающий генотипы животных по локусу гена бета-лактоглобулина.

Таблица 2. Частота встречаемости генотипов и аллелей гена бета-лактоглобулиа у быков-производителей и коров

Хозяйство	n	Частота генотипов	Частота аллелей	ч2
		АА	АВ	ВВ
		n	%	n	%	n	%	А	В
ГУП ГПП "Элита"	Н	70	9	12,9	26	37,1	35	50,0	0,31	0,69	1,23
	О		7	9,6	30	42,8	33	47,6
ООО им. Тукая	Н	107	14	13,1	60	56,1	33	30,8	0,41	0,59	2,55
	О		18	16,8	52	48,4	37	34,8

Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов.

Среди быков-производителей выявлено 8 разных комбинаций генотипов. Из 70 быков-производителей имели комбинацию CSN3 AA / в-LGB AA 6 (8,6%) быков-производителей, CSN3 AA / в-LGB AВ - 18 (25,7%), CSN3 AA / в-LGB ВВ - 24 (34,3%), CSN3 AВ / в-LGB AA - 2 (2,9%), CSN3 AВ / в-LGB AВ - 5 (7,1%), CSN3 АВ / в-LGB ВВ - 11 (15,7%), CSN3 ВВ / в-LGB АА - 1 (1,4%) и CSN3 ВВ / в-LGB АВ - 3 (4,3%) соответственно. При этом комбинация CSN3 ВВ / в-LGB ВВ в данном стаде быков-производителей не встречалась (табл.3).

Таким образом, в стаде быков-производителей наиболее часто встречались три комбинации: CSN3 АВ / в-LGB ВВ с частотой 15,7%, CSN3 АА / в-LGB АВ - 25,7% и CSN3 АА / в-LGB ВВ - 34,3% соответственно.

В стаде коров выявлено 7 разных комбинаций генотипов. Из 107 коров имели комбинацию CSN3 AA / в-LGB AA 11 (10,3%) коров, CSN3 AA / в-LGB AВ - 31 (29,0%), CSN3 AA / в-LGB ВВ - 26 (24,3%), CSN3 AВ / в-LGB AA - 3 (2,8%), CSN3 AВ / в-LGB AВ - 26 (24,3%), CSN3 АВ / в-LGB ВВ - 7 (6,5%), и CSN3 ВВ / в-LGB АВ - 3 (2,8%) соответственно. При этом комбинации CSN3 ВВ / в-LGB АА и CSN3 ВВ / в-LGB ВВ в данном стаде коров не встречались (табл.3).

Таблица 3. Частота встречаемости комбинаций генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у быков-производителей и коров

Генотип по генам CSN3/LGB	Частота комбинаций генотипов
	быки-производители	коровы
	n	%	n	%
АА / АА	6	8,6	11	10,3
АА / АВ	18	25,7	31	29,0
АА / ВВ	24	34,3	26	24,3
АВ / АА	2	2,9	3	2,8
АВ / АВ	5	7,1	26	24,3
АВ / ВВ	11	15,7	7	6,5
ВВ / АА	1	1,4	-	-
ВВ / АВ	3	4,3	3	2,8

Таким образом, в стаде коров наиболее часто встречались три комбинации: CSN3 АА / в-LGB АВ с частотой 29,0%, CSN3 АА / в-LGB ВВ - 24,3% и CSN3 АВ / в-LGB АВ - 24,3%.

3.8 Характеристика быков-производителей с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина по молочной продуктивности их матерей

Наибольший удой был у матерей быков с генотипом по гену каппа-казеина ВВ - 9394 кг, а наименьший у матерей быков с генотипом АВ - 8642 кг. При этом матери быков-производителей с генотипом АА по данному показателю имели промежуточные значения.

Более высокое содержание жира в молоке имели матери (4,01%) быков-производителей с генотипом ВВ, а более низкое у матерей быков с генотипом АВ (3,84%). Матери потомков с генотипом ВВ превосходили по содержанию жира аналогов с генотипом АА на 0,10%. По выходу молочного жира тенденция сохранилась.

Проведенные исследования быков-производителей с разными генотипами каппа-казеина по продуктивности их матерей показали, что наибольшую молочную продуктивность (удой за лактацию, содержание и выход молочного жира) имели матери быков с генотипом ВВ.

Удой матерей быков с генотипом ВВ бета-лактоглобулина был ниже на 1299 кг (Р<0,01) молока, чем у матерей быков с генотипом АВ, и на 1038 кг (Р<0,05), чем удой у матерей быков с генотипом АА.

Жирность молока матерей быков с генотипом ВВ была ниже, чем у матерей быков с генотипами АА и АВ на 0,11% и на 0,09%, соответственно, и составила 3,85%. По выходу молочного жира матери быков с генотипом ВВ также уступали матерям быков с генотипами АА и АВ на 50 кг (Р<0,05) и 58,4 кг (Р<0,01).

Таким образом, по результатам оценки быков-производителей по происхождению более высокие показатели были у быков с генотипом АВ, чьи женские предки имели более высокую молочную продуктивность.

Наибольший удой за лактацию отмечен в группе матерей быков с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB АВ и составил 9437 кг молока, а наименьший у матерей быков с комбинацией генотипов CSN3 АА / LGB ВВ - 8003 кг.

Более высокое содержание жира в молоке имели матери быков с комбинацией

генотипов CSN3 ВВ / LGB АА - 4,51%, а более низкое у матерей быков с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB АВ - 3,77%. Матери быков с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB АА превосходили по данному показателю животных других групп на 0,54-0,74% (Р<0,05-0,001).

Наибольший выход молочного жира (419,9 кг) отмечен у матерей быков, которые имели комбинацию генотипов CSN3 ВВ / LGB АА. Они превосходили по данному показателю аналогов на 47,3-106,3 кг молочного жира (Р<0,05 и 0,001).

Таким образом, полученные данные показали, что наибольшую молочную продуктивность имели матери быков с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB АА, а наименьшую матери быков с комбинацией генотипов CSN3 АА / LGB ВВ.

3.9 Молочная продуктивность коров с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина

Удой первотелок с разными генотипами каппа-казеина был в пределах от 4977 кг (АА) до 5293 кг (АВ) молока. Коровы, несущие в своем генотипе В аллель каппа-казеина превосходили сверстниц на 185-316 кг молока (табл.4).

Таблица 4. Молочная продуктивность коров с разными генотипами каппа-казеина

Показатели	Генотипы	Разница
	АА	АВ	ВВ	АВ-АА	ВВ-АА
n	68	36	3	-	-
удой, кг	497790,4	5293129,1	5162377,6	+316*	+185
жир, %	4,040,03	4,010,02	3,990,10	-0,03	-0,05
молочный жир, кг	201,73,73	212,35,48	206,012,40	+10,6	+4,3
белок, %	3,140,02	3,220,02	3,310,04	+0,08**	+0,17***
молочный белок, кг	156,33,06	170,44,73	170,914,54	+14,1*	+14,6

* - P<0,05; ** - P<0,01; *** - P<0,001.

Животные с генотипом АА уступали по количеству молочного жира сверстницам с генотипами АВ и ВВ на 4,3-10,6 кг.

Наибольшим содержанием белка, характеризовалось молоко от коров с генатипами АВ и ВВ (3,22% и 3,31%). Животные, несущие в своем геноме В аллель каппа-казеина превосходили сверстниц с генотипом АА на 0,08-0,17% (Р<0,01-0,001). От животных с генотипами АВ и ВВ получено больше молочного белка, чем от коров с генотипом АА на 14,1 кг (Р<0,05) и 14,6 кг соответственно.

Таким образом, коровы с генотипами АВ и ВВ каппа-казеина обладали более высоким уровнем молочной продуктивности по сравнению с животными с генотипом АА. Однако животные с генотипом АА превосходили аналогов с другими генотипами каппа-казеина по содержанию жира в молоке.

Удой первотелок в группе с генотипом бета-лактоглобулина ВВ составил 4899 кг, АВ - 5142 кг и ВВ - 5309 кг. Первотелки с генотипом бета-лактоглобулина ВВ уступали аналогам на 243-410 кг молока (табл.5).

Наибольшее содержание жира в молоке (4,06%) имели коровы с генотипом АА. Наибольшее количество молочного жира (206,7-215,6 кг) получено от животных, несущих в своем геноме А аллель гена бета-лактоглобулина, они превосходили сверстниц по данному показателю на 9,3-18,2 кг.