Влияние солености и кислотности среды на активность ферментов осморегуляции и протеолиза молоди стерляди (Acipenser ruthenus L.)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Влияние солености и кислотности среды на активность ферментов осморегуляции и протеолиза молоди стерляди (Acipenser ruthenus L.)

М.Ю. Крупнова, Е.И. Кяйвяряйнен, Е.В. Борвинская, Н.Н. Немова, Г.Г. Серпунин

Институт биологии Карельского научного центра РАН, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11

Проведенный эксперимент продемонстрировал реактивность ферментов осморегуляции Na+/K+-АТФазы и лизосомального протеолиза - катепсинов B и D к изменяющимся экологическим факторам среды, таким как повышение солености и рН, что лежит в основе приспособительных реакций, развитых у эвригалинных видов рыб, к которым относится стерлядь.

Ключевые слова стерлядь, Na/K АТФ-аза, катепсины B и D, соленость, кислотность

Осетровые рыбы являются ценнейшими объектами отечественного рыбного промысла и аквакультуры. Уже первые детальные исследования экологии и физиологии разных видов осетровых показали высокую адаптивную пластичность, лежащую в основе биологического прогресса представителей этого семейства. Особенностью экологии эвригалинных видов является то, что в своем жизненном цикле они могут сталкиваться со значительными изменениями абиотических факторов среды обитания, в частности, солености и кислотности. Это положение справедливо и по отношению к стерляди, выдерживающей значения солености среды обитания до 10‰, тогда как для большинства представителей пресноводной ихтиофауны критическими являются значения выше 5-8‰ [1]. Исследуемый диапазон кислотности среды (рН от 7,0 до 9,0) находится в пределах адаптивной нормы для стерляди. Стерлядь генетически близка к проходным осетровым, поэтому представляет интерес более глубокое раскрытие эффективных механизмов регуляции ионно-солевого и белкового обмена для поддержания устойчивости метаболизма в связи с проблемой возможной акклиматизации.

Известно, что нарастание количественного значения какого-либо абиотического фактора до определенной критической точки благоприятно для организма, а затем становится отрицательным. Согласно данным П.Хочачка [2], при отклонении от оптимальных значений включаются компенсаторные механизмы, снижающие даже стрессовое воздействие факторов.

Успех адаптации зависит от способности рыб перестраивать свой водно-солевой обмен. Целью ионной регуляции организмов является поддержание во внутренней среде наиболее благоприятного соотношения ионов, необходимого для нормального функционирования макромолекул в клетках. Включение адаптационных механизмов затрагивает также и лизосомальную систему клетки, в частности, такая адаптация кроме синтеза новых ферментов, соответствующих изменившимся потребностям организма, ведет к распаду и удалению тех ферментов, которые больше не нужны для ее нормального функционирования, регулируя, тем самым, высокую избирательность внутриклеточного протеолиза [3].

Исследования показателя активного транспорта ионов - Na+/K+-АТФазы и лизосомальных протеолитических ферментов - катепсинов B и D помогут расширить представления о биохимических механизмах адаптации стерляди Acipenser ruthenus L. к изменению солености и кислотности окружающей среды.

рыба осморегуляция протеолиз экологический

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на сеголетках стерляди, которых выращивали в экспериментальных УЗВ (установки с замкнутым циклом водообеспечения) в аквариальной кафедры аквакультуры ФГОУ ВПО «Калининградский государствен-ный технический университет» в течение трех месяцев 2007 г. В одной серии экспериментов по влиянию солености молодь стерляди выращивалась в трех аквариумах с различной концентрацией соли: I - 3 ‰; II - 6 ‰ ; III - контроль (0,3‰). В другой серии экспериментов по влиянию рН молодь выращивалась в трех аквариумах с различными значениями рН: I - 7; II - 8; III - 9.

Измерение активности Na+/K+-АТФазы определяли по методу Н.Р. Елаева [4]. Определение активности катепсина D проводили по несколько модифицированному методу Ансона, определение активности катепсина В исследовали по расщеплению его синтетического субстрата [5]. Количество белка в пробе определяли используя реактив Бредфорд [6].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные данные по определению активности Na+/K+-АТФазы в мышцах и жабрах стерляди, выращиваемой в условиях различной солености, представлены на рис. 1.

Рис. 1. Влияние солености среды на активность Na+/К+-АТФазы (М±?) в органах стерляди. Условные обозначения: различия достоверны (р<0,05) по сравнению с соленостью в контроле 0,3 ‰ (а) и 3‰ (б). Различия достоверны между органами при р<0,05 (*), при р<0,01 (**)

Достоверно зафиксировано увеличение активности Na+/К+-АТФазы (р<0,05) в мышцах и жабрах при увеличении солености до 6‰. Это свидетельствует о том, что фермент обладает высокой чувствительностью к повышению этого фактора в данном диапазоне изменения солености, оказывающего однонаправленное влияние на его активность. Это связано с ролью Na+/К+-АТФазы в метаболизме клетки как одного из важнейших участников регуляции водно-солевого баланса [7].

В жабрах рыб при повышении солености отмечают увеличение числа ионотранспортирующих хлоридных клеток, при этом происходит увеличение суммарного количества сайтов Na+/K+-АТФазы на плазматических мембранах [8]. С этим связано увеличение экспрессии, а также активности Na+/К+-АТФазы при повышении солености.

В нашем эксперименте значение активности Na+/K+ АТФазы в жабрах контрольных и адаптированных к повышенной солености рыб достоверно ниже, чем в мышцах (рис.1). Можно предположить, что жабры не являются основным барьерным органом в регуляции водно-солевого баланса у рыб. Возможно, именно увеличение проницаемости жаберного эпителия в связи с повышением солености приводит к увеличению потока ионов в организм и активации ионотранспортных систем. Основная регуляторная функция ионного обмена между организмом и внешней средой присуща и другим органам выделительной системы, особенностью которых является наличие проницаемого эпителия. Из литературных источников известно, что у морских рыб таким органом является кишечник, в котором происходит впитывание проглоченной морской воды и избирательная абсорбция из неё ионов Na+ и К+, а у пресноводных рыб, которым не нужно пить воду, значительная осморегуляторная нагрузка ложится на почки [8, 9]. Многие исследования говорят о том, что обитающие в пресной воде рыбы характеризуются меньшей проницаемостью эпителия, чем морские, что связано с экономией ионов, в дефиците присутствующих в окружающей среде. Эту же тенденцию демонстрируют эвригалинные рыбы, проницаемость жабр для ионов у которых многократно снижается при переносе из морской воды в пресную [9].

На рис. 2 видно, что активность лизосомальных протеиназ в гомогенатах мышц стерляди при разной степени солености, а этот фактор среды является одним из важнейших для гидробионтов, изменяется следующим образом: отмечен рост активности катепсина В (до 60%), резкое снижение активности аспартильной протеиназы - катепсина D (около 100%), содержание водорастворимого белка несколько снижается (10-14%) в зависимости от увеличения солености воды. В предыдущих исследованиях, проведенных в лаборатории по влиянию различной степени солености (от 5 до 45 ‰) на мидий Белого моря, также выявлено участие лизосомальных протеиназ в адаптивном механизме гидробионтов к изменяющимся условиям среды (в данном случае, солености). Причем этот ответ характерен как для мидий литоральной, так и сублиторальной зон [10].

Рис. 2. Изменение активности катепсина D, катепсина B и содержание белка в мышцах стерляди при разной солености (в % к контролю)

При повышении рН среды наблюдалось снижение активности Na+/K+-АТФазы в жабрах и мышцах стерляди (рис. 3). Так как ионы Н+ обмениваются на Na+ из внешней среды с участием Na+/H+-транспортера, работающего за счет градиента ионов Na+, непосредственно создаваемого Na+/К+-АТФазой, поэтому наблюдаемое снижение активности Na+/K+-АТФазы при повышении рН от 7,0 до 9,0, предположительно, связано со снижением секреции ионов Н+, в которой косвенно задействована Na+/К+-АТФаза.

Многие исследования демонстрируют повышение активности и экспрессии этого транспортного белка при адаптации рыб к закислению окружающей среды [11, 12], указывая на важную роль Na+/Н+ обменных процессов в регуляции кислотно-щелочного равновесия [9].

Также следует отметить, что снижение активности в жабрах идет медленнее, чем в мышцах. Это может быть результатом большей приспособленности жабр к колебаниям внешних факторов среды, что связано с наличием эволюционно выработанных приспособительных реакций к непосредственному контакту с постоянно изменяющейся внешней средой. Существует гипотеза, что решение проблемы регуляции кислотно-щелочного баланса было первейшей задачей жаберного эпителия рыб, заселивших континентальные водоемы, которые, по сравнению с морскими, отличаются значительными колебаниями этого фактора [13].

Рис. 3. Влияние кислотности среды на активность Na+/К+-АТФазы (М±?) в различных органах стерляди. Условные обозначения: различия достоверны (р<0,05) по сравнению с рН= 7 (а) и рН=8 (б); различия достоверны между органами при р<0,05 (*), при р<0,01 (**)

Щелочная среда благоприятствует снижению проницаемости жабр. Это приводит к уменьшению диффузной потери основного внеклеточного Na+, в результате чего общий уровень их потери не будет превышать поглощение [9]. Вероятно, с замедлением поступления ионов в организм может быть связано понижение уровня активности Na+/К+-АТФазы, в том числе и в мышцах, где при рН=9,0 ее значение становится меньше, чем в жабрах.

Ферменты обычно наиболее активны в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов, соответствующей для животных тканей в основном выработанным в процессе эволюции физиологическим значением рН среды 6.0 - 8.0. рН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений. При этом некоторые из них выдерживают сильные колебания рН и восстанавливают свою активность при возвращении к оптимальным условиям.

Аналогичная картина отмечена и для ферментов лизосом, в частности, протез, работающих в кислой зоне рН. В нашем опыте показано, что при увеличении рH от 7.0 до 9,0 происходит рост активности цистеиновой протеиназы - катепсина B более чем на 100% (рН 9,0) и снижение активности катепсина D практически на такую же величину, при этом количество водорастворимого белка почти не изменялось ( рис.4).

Рис. 4. Изменение активности катепсина D, катепсина B и содержание белка в мышцах стерляди при разной кислотности среды (в % к контролю)

Отмеченные нами изменения активности аспартильной (катепсин D) и цистеинзависимой (катепсин В) протеиназ в мышцах стерляди аналогичны данным, полученным ранее в исследованиях по выяснению влияния рН на окуней из гидрохимически различающихся озер [14].

заключение

Наши исследования указывают на приспособительный характер реактивности ферментов активного транспорта ионов Na+ и К+ и лизосомальных ферментов - катепсинов B и D у стерляди Acipenser ruthenus L. при изменении солености и рН воды в диапазоне докритических значений. Полученные результаты продемонстрировали, что активность Na+/К+-АТФазы стерляди находится в прямой зависимости от солености внешней среды (в диапазоне до 6‰) и в обратной зависимости от увеличения рН среды (при изменении рН от 7,0 до 9,0). Анализируя данные по изменению активности исследованных протеиназ, можно предположить, что они являются свидетельством усиления деградации белкового метаболизма в ответ на воздействие повышенных концентраций соли и значений рН.

Таким образом, изменение активности Na+/K+-АТФазы и лизосомальных ферментов является примером биохимической адаптации, направленной на поддержание механизмов обмена веществ и его изменений в зависимости от непостоянных условий среды.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Хлебович В.В. Критическая соленость биологических процессов / В.В. Хлебович. - Л., 1974. - 230 с.

2. Хочачка П. Стратегия биохимической адаптации / П. Хочачка, Дж. Сомеро. - М., 1977. - 396 c.

3. Мосолов В.В. Механизмы контроля протеолиза / В.В. Мосолов //Успехи биол. химии. - 1988. - Т. 28. - С. 125-144.

4. Елаев Н.Р. Изменение активности мембранных АТФаз мозга при воздействии холино - и адреномиметических веществ / Н.Р. Елаев, Е.В. Семенов // Биохимия. - 1974. - Т. 39. - Вып. 3. - С. 636-640.

5. Алексеенко Л.П. Определение активности протеиназ по расщеплению белковых субстратов / Л.П. Алексеенко // Совр. методы в биохимии. - М., 1968. - Т. 2. - С. 117.

6. Bradford M.M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford Anal Biochem.- 1976.- № 10 - P. 491 - 497.

7. Болдырев А.А. Na+/K+-ATФаза. Свойства и биологическая роль / А.А. Болдырев // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - № 4. - С. 2-10.

8. Матей В.Е. Жабры пресноводных костистых рыб / В.Е. Матей // Морфофункциональная организация, адаптация, эволюция.- СПб., 1996. - 204 с.

9. Виноградов Г.А. Процессы ионной регуляции у пресноводных рыб и беспозвоночных / Г.А. Виноградов. - М., 2000. - 216 с.

10. Крупнова М.Ю. Влияние различных концентраций солености на протеолитическую систему мидий Mytilus edulis Белого моря / М.Ю. Крупнова, Н.Н. Немова, Е.И. Кяйвяряйнен и др. // Инновации в науке и образовании-2003: Международная научная конференция: материалы / КГТУ.-Калининград, 2003. - C. 36.

11. Choe K.P. Immunological detection of Na+/H+-exchangers in the gills of a hagfish, Myxine glutinosa, an elasmobranch, Raja erinacea, and a teleost, Fundulus heteroclitus / К.Р. Choe, A.I.Morrison-Shetlar, В.Р.Wall and J.B. Claiborne // Comp Biochem Physiol A Physiol. - 2002. - № 131. - Р. 375-385.

12. Hirata T. Mechanism of acid adaptation of a fish living in a pH 3.5 lake / Т.Hirata, Т.Kaneko, т.Ono T. et. al. // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. - 2003. - № 284. - Р.1199-1212.

13. Виноградов Г.А. Процессы ионной регуляции у пресноводных рыб и беспозвоночных / Г.А. Виноградов.- М., 2000. - 216 с.

14. Немова Н.Н. Биохимические эффекты накопления ртути у рыб / Н.Н. Немова. - М., 2005. - 164 с.

Размещено на Allbest.ur