Изменение гуморального и клеточного иммунитета у мышей гибридов F1 после кастрации

Кастрация как распространенная операция в ветеринарной практике. Влияние кастрации на параметры гуморального и клеточного иммунного ответа в динамике у интактных мышей гибридов F1 и частоту развития аутоиммунного расстройства в экспериментальной модели.

Рубрика Сельское, лесное хозяйство и землепользование
Вид автореферат
Язык русский
Дата добавления 28.06.2018
Размер файла 789,2 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

1

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание

ученой степени кандидата биологических наук

Изменение гуморального и клеточного иммунитета у мышей гибридов f1 после кастрации

03.03.01 - физиология

Арсёнова Светлана Андреевна

Новосибирск - 2010

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии и микробиологии в

ФГОУ ВПО "Новосибирский государственный аграрный университет"

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Колесникова Ольга Петровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Деева Валентина Семёновна

кандидат биологических наук

Ефанова Нина Владимировна

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита диссертации состоится "____"__________2010 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 220.048.04 при Новосибирском государственном аграрном университете: 630039, г. Новосибирск, ул. Добролюбова, 160. Тел.8- (383) - 267-05-10; 264-28-00.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО "Новосибирский государственный аграрный университет" (www.nsau.edu.ru).

Автореферат диссертации разослан "_____"_____________2010г.

Ученый секретарь

диссертационного совета С.П. Князев

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Кастрация - одна из самых распространенных операций в ветеринарной практике. Хирургическое удаление гонад также широко используется как метод в экспериментальных исследованиях для изучения иммунофизиологических механизмов действия половых стероидных гормонов. Известно влияние гонадэктомии (GE) на некоторые параметры иммунной системы. Установлено, что возрастная инволюция тимуса ускоряется во время полового созревания - период, когда резко возрастает уровень половых гормонов (Whitacre C. C., 2001; Ярилин А.А., 2003). В результате кастрации останавливается возрастная инволюция тимуса и наблюдается его гиперплазия (Sutherland J. S., 2005; Safadi F. F., 2000; Fitzpatrick F., 1991). В литературе имеются данные, свидетельствующие о половом диморфизме в иммунном ответе, который обусловлен половыми стероидными гормонами (Myers M., 1972; Кудаева О.Т., 2005). Так женские половые гормоны - эстрогены ? обладают стимулирующим влиянием на гуморальный иммунный ответ. Повышенное антителообразование может сопровождаться появлением антител против собственных тканей организма. Тестостерон, напротив, угнетает гуморальный иммунный ответ, а значит, снижается риск проявления аутоиммунных реакций (Grossman Ch. J., 1984; Olsen N. J., 2001). В литературе описано усиление антителообразования после кастрации у мышей, крыс (Edinger D. et al., 1972; Tartarcovsky B. et al., 1981; Ainbeder E. et al., 1968), хряков (Ефанова Н.В., 2006). При этом антителообразование у кастрированных самцов становится более интенсивным, чем у самок (Edinger D. et al., 1972). Показано, что спонтанный и стимулированный синтез IgM, IgG, IgA клетками селезенки in vitro кастрированных мышей не отличается от интактных, но клетки селезенки кастрированных животных синтезировали высокие уровни аутореактивных антител, антител против IgG (ревматоидный фактор) и тиреоглобулина (Viselli S. M. et al., 1995). Возникает вопрос - возрастает ли риск развития аутоиммунных реакций в организме при такой усиленной продукции антител и является ли этот "аутоиммунный компонент" одним из этиологических факторов, который приводит к увеличению частоты болезней нижних мочевыводящих путей вследствие орхидэктомии?

Известно, что хирургическое удаление гонад приводит к возникновению различных патологий, ухудшающих качество жизни животных, таких как ожирение (Fettman M. J. et al., 1997; Kanchuk M. L. et al. 2002; Nguyen P. G. et al., 2004), сахарный диабет (Hoeng M. et al., 2002; Kanchuk M. L. et al., 2002), гипотиреоидизм (Milne K. L. et al., 1981; Panciera D. L., 1994) и др. Твердо установлено, что гипогонадизм у мужчин (дефицит тестостерона), который приводит к нарушениям костно-кальциевого обмена, является одним из этиологических факторов камнеообразования в почках, а андрогенная терапия статистически значимо замедляет этот процесс (Александров В.П. и др., 2008). У животных разных видов также показано, что кастрация приводит к увеличению частоты болезней нижних мочевыводящих путей (Stubbs W. et al., 1996; Lekcharoensuk С. et al., 2001; Spain C. V. et al., 2002). Однако конкретные механизмы развития патологии почек у кастрированных самцов, участие в этом аутоиммунных компонентов, воспаления изучены мало.

Одной из моделей аутоиммунных нарушений, активно используемых в экспериментальных работах, является модель на основе хронической реакции трансплантант против хозяина (РТПХ) в полуаллогенной системе DBA/2 (C57BL/6 Ч DBA/2) F1 (когда клетки селезенки одного из родителей, самок линии DBA/2, вводят внутривенно гибридам первого поколения) (Via C. S. et al., 1991). Несмотря на генетическую однородность реципиентов, при индукции хронической РПТХ в системе DBA/2 (DBA/2 x C57Bl/6) F1 было обнаружено, что реакция может идти по двум направлениям: у 50-60 % самок мышей развивается аутоиммунный гломерулонефрит на фоне супрессии клеточного и гуморального иммунитета, а у остальных мышей отсутствуют выраженные проявления поражения почек, и к тому же резко выраженная супрессия гуморального иммунного ответа не сочетается с супрессией клеточного ответа (Кудаева О. Т, 1993). Развитие иммунного ответа по клеточному или гуморальному типу связано с преимущественной активацией клонов Т-хелперов 1-го (Тh1) или 2-го (Тh2) типа, которые различаются по своей функции и по спектру экспрессируемых цитокинов. Тип аутоиммунного заболевания, обусловленный аутоантителами или аутореактивными Т-лимфоцитами, определяется преобладанием соответственно либо Тh2?, либо Тh1? клеток (Козлов В.А., 1997).

Течение хронической РТПХ у самок может быть направлено по двум разным путям: с преобладающим влиянием Th2? клеток (группа lupus, в которой развивается иммунокомплексный гломерулонефрит) или Th1?клеток (группа nonlupus без развития нефрита) (Кудаева О.Т., 1993). Иммунопатологическое состояние, возникающие в результате индукции РТПХ, хорошо изучено и описано на самках и практически нет данных о возможности индукции этого состояния на самцах.

Цель исследования. Охарактеризовать влияние кастрации на параметры гуморального и клеточного иммунного ответа в динамике у интактных мышей гибридов F1 и частоту развития аутоиммунного расстройства в экспериментальной модели.

Задачи исследования

1. Изучить влияние кастрации на массу и количество ядросодержащих клеток тимуса и селезенки у самцов гибридов B6D2F1.

2. Изучить выраженность реакции гиперчувствительности замедлен-ного типа (ГЗТ) у кастрированных животных.

3. Исследовать влияние кастрации на количество антителообразующих клеток селезенки (IgM-АОК и IgG-АОК) во время первичного и вторичного гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген.

4. Изучить влияние кастрации на частоту развития люпус-нефрита у животных в разные сроки относительно индукции хронической РТПХ.

5. Определить влияние мурамилдипептида (MDP) на частоту развития люпус-нефрита у кастрированных животных после индукции хроничекой РТПХ.

6. Исследовать уровень IgE и тестостерона в сыворотке крови у интактных кастрированных самцов и кастрированных самцов с хронической РТПХ.

Научная новизна работы

Впервые получены данные по усилению интенсивности гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у кастрированных самцов B6D2F1. Отмечено повышение ГЗТ у мышей в разные сроки после проведения кастрации.

Впервые выявлено повышение иммуноглобулина класса Е в сыворотке крови интактных кастрированных самцов B6D2F1 через 5 и 12 недель после проведения операции и кастрированных самцов B6D2F1 с Th2-вариантом течения хронической РТПХ.

Впервые показаны различия в содержании тестостерона в сыворотке крови у самцов с Th1 - и Th2 - вариантами течения хронической РТПХ в системе DBA/2 (C57BL/6 Ч DBA/2) F1. Выявлено, что развитие иммунокомплексного гломерулонефрита у интактных самцов после индукции РТПХ приводит к резкому снижению тестостерона в сыворотке крови.

Впервые показано, что кастрация самцов приводит к уменьшению числа животных lupus в экспериментальной модели, и баланс Th1/Th2 клеток у оперированных самцов сдвигается в сторону Th1, т.е. преобладания числа животных nonlupus. Установлена возможность модуляции течения хронической РТПХ у кастрированных животных под действием препарата, изменяющего соотношение Th1/Th2 в момент индукции реакции у самцов B6D2F1. Введение мурамилдипептида (MDP) приводит к увеличению числа мышей lupus с аутоиммунным гломерулонефритом.

Научная и практическая значимость работы

Полученные данные представляют дополнительный материал для понимания механизмов иммунореактивности у кастрированных самцов. Показано, что кастрация приводит к усилению интенсивности специфического первичного и вторичного гуморального и клеточного иммунного ответа у интактных самцов гибридов B6D2F1. Кастрация самцов B6D2F1 до или после индукции аутоиммунного расстройства снижает риск развития аутоиммунных реакций в организме, обусловленных аутоантителами. Однако введение кастрированным самцам B6D2F1 бактериального антигена (мурамилдипептида), который вызывает поликлональную активацию В-клеток и усиливает стимулирующее влияние ИЛ-4 на активированные В-лимфоциты, в момент индукции аутоиммунного заболевания увеличивает риск развития аутоиммунных реакций - число случаев иммунокомплексного гломерулонефрита возрастает. Эти данные позволяют рекомендовать проводить профилактику бактериальных инфекций мочевыводящих путей и ограничение использования иммуностимуляторов поликлонального действия у кастрированных самцов, как факторов провоцирующих поражение почек.

Положения, выносимые на защиту:

1. Кастрация стимулирует гуморальный и клеточный иммунный ответ у самцов мышей B6D2F1, максимальная стимуляция отмечается с пятой недели после операции.

2. Индукция хронической РТПХ в системе аллогенного переноса у интактных самцов B6D2F1 приводит к формированию преимущественно Тh2-зависимого иммунопатологического состояния, у кастрированных самцов B6D2F1 - Тh1-зависимого иммунопатологического состояния.

3. Формирование Тh2-зависимых иммунопатологических состояний у интактных самцов B6D2F1 приводит к резкому снижению тестостерона в сыворотке крови, у кастрированных самцов B6D2F1 - к увеличению IgЕ в сыворотке крови.

кастрация ветеринарная мышь иммунный ответ

4. Введение мурамилдипептида в момент индукции РТПХ у кастрированных самцов B6D2F1 увеличивает число мышей с Th2? ответом.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на трех этапах Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (Новосибирск, Омск, Москва, 2008, 2009), на VII Межрегиональной конференции молодых ученых и специалистов аграных вузов Сибирского федерального округа (Новосибирск, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе одна статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста, работа иллюстрирована 15 рисунками, 9 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, их обсуждения и выводов. Библиографический список включает 241 источников, из них 29 отечественных авторов и 212 зарубежных авторов.

Собственные исследования

Материалы и методы исследования

Животные. Исследования проводились на базе НИИ клинической иммунологии СО РАМН и кафедре эпизоотологии и микробиологии НГАУ. Материалом для экспериментальных исследований служили самцы мыши - гибриды первого поколения (С57Вl/6хDBA/2) F1 В6D2F1, самки DBA/2 9-16?недельного возраста. Содержали животных в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

Культуральные среды и реагенты. RPMI-1640 (НПО "Вектор"); физиологический раствор, забуференный фосфатным буфером pH 7,4 (ЗФР); Кumsai brilliant blue (Loba Feinchemie); уксусная кислота; соляная кислота; комплемент морской свинки (НПО "Биомед", г. Пермь); антитела кролика против цельной молекулы IgG мыши (RAM) (БИОС, Новосибирск); Tween 20 ("Sigma"); этиловый спирт; мурамилдипептид ("Sigma").

Кастрация. Опытным мышам проводили кастрацию открытым способом с использованием Zooletilтм в качестве наркоза в дозе 5 мг/кг.

Подсчет количества лейкоцитов и лимфоцитов. Для подсчета абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови 5 мкл крови разводили в 20 мкл 5% -го раствора уксусной кислоты (разведение 1: 20). Подсчет числа лейкоцитов проводили в камере Горяева. Для расчета относительного количества лимфоцитов мазок крови фиксировали в спирт-эфирной смеси (1:

1) 20 мин, окраску мазка крови проводили по Романовскому - Гимза.

Выделение клеток селезёнки, тимуса. Мышей забивали методом дислокации шейных позвонков. Тимус извлекали путём срединного (продольного разреза) верхней части грудной клетки и вскрытия грудной полости. Селезёнку, тимус помещали во флакончики со средой, расстригали ножницами, многократно пропускали через шприц с иглой, фильтровали через металлическую сеточку. Осадок клеток селезёнки, тимуса ресуспендировали в среде и подсчитывали их общее количество.

Определение массы и количества ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке. Массу тимуса и селезенки определяли путем взвешивания. Количество ядросодержащих клеток тимуса и селезенки подсчитывали в камере Горяева и рассчитывали по формуле

К1 =х4,5; К2= х 4,5,

где К1 - количество ядросодержащих клеток тимуса; К2 - количество ядросодержащих клеток селезенки; А - количество клеток, подсчитанное в 100 больших квадратах; 1600 - количество маленьких квадратиков в 100 больших квадратах (100х16=1600); 1/4000 - объем счетной камеры (1/4000мкл); 20 ? степень разведения клеток тимуса; 200-степень разведения клеток селезенки; 4,5 ? объем (мл) суспензии тимуса (селезенки).

Определение первичного гуморального ответа (IgM и IgG-АОК) на Т-зависимый антиген (эритроциты барана ЭБ). Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса M, в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа на 5-е сутки после внутривенной иммунизации эритроцитами барана в дозе 107/мышь по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом (Cunningham A. J., 1968). У мышей после дислокации шейных позвонков извлекали селезенку и помещали в пенициллиновый флакон с 0,5 мл среды 199. Каждую селезенку помещали в отдельный флакон. Все процедуры с клетками проводили на льду. Клетки селезенки разводили в 5 раз. Объём клеточной суспензии доводили до 4,5 мл. Затем готовили инкубационную смесь: 500 мкл суспензии селезенки, 500 мкл суспензии эритроцитов барана, 500 мкл комплемента, предварительно разведённого в 5 мл среды. Компоненты перемешивали, и смесь заливали в стеклянные камеры. Камеры помещали в термостат и инкубировали 1,5 ч при +380. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой (увеличение х 42) по формуле

где Абс. АОК - абсолютное количество антителообразующих клеток; kАОК - количество антителообразующих клеток на камеру; Vk - объем камеры; Vks - объем клеточной суспензии; R - разведение.

Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса G, в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа на 9-е сутки после внутривенной иммунизации 2%?м раствором эритроцитов барана (Cunningham A. J., 1968). Объём клеточной суспензии селезенки доводили до 4,5 мл. Клетки селезенки разводили в десять раз. Затем готовили инкубационную смесь: 700 мкл суспензии селезенки, 100 мкл суспензии эритроцитов барана, 100 мкл комплемента, предварительно разведённого в 1,5 мл среды, 100 мкл антисыворотки. Камеры, заполненные инкубационной смесью, помещали в термостат и инкубировали 2 часа при t +380. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой.

Определение вторичного гуморального ответа (IgG-АОК) на Т-зависимый антиген (ЭБ). Для определения вторичного гуморального иммунного ответа проводили внутривенную иммунизацию 2% раствором ЭБ в дозе 0,5 мл двукратно с интервалом 30 дней. Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса G, в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа на 4-е сутки после повторной иммунизации. Клетки селезенки разводили в 200 раз. Затем готовили инкубационную смесь: 700 мкл суспензии селезенки, 100 мкл суспензии эритроцитов барана, 100 мкл комплемента, предварительно разведённого в 1,5 мл среды, 100 мкл антисыворотки. Камеры, заполненные инкубационной смесью, инкубировали в термостате 2 ч при +380. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой (Sterzl J., Riha I., 1965).

Оценка клеточного ответа на Т - зависимый антиген. Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа: величины отёка лапы после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным. Для этого мышей предварительно иммунизировали внутрибрюшинно сенсибилизирующей дозой - 0,25% ЭБ в объёме 0,5 мл (2,5x107 ЭБ/мышь). Разрешающую дозу - 50% ЭБ в объёме 50 мкл (5x108 ЭБ/ мышь) вводили под подошвенный апоневроз задней правой лапы на 4 сутки. В контралатеральную лапу вводили среду в том же объёме. Учёт реакции проводили через 24 ч по величине местного отёка (Crowle A. J., 1975).

Хроническую РТПХ осуществляли путём переноса самцам B6D2F1 лимфоидных клеток родительской линии - клеток селезенки самок DBA/2. Вводили клетки селезёнки, выделенные ex tempore, в стерильной среде RPMI-1640. Каждая мышь-реципиент получала по 65x106 клеток путём внутривенной инъекции в хвостовую вену в объёме 0.5 мл среды двукратно с интервалом в пять дней.

Определение белка в моче. О развитии гломерулонефрита судили по стойкому появлению белка в моче. Содержание белка в моче определяли колориметрически с красителем Kumsai brilliant blue (Loba Feinchemie) c помощью Titertec Multiskan, длина волны 570 nm; калибровочную кривую строили по BSA 100-1000 мкг/мл. На сроке от 8-й до 12-й недели после индукции РТПХ определяли протеинурию. Стойкая протеинурия (уровень белка в моче более 3мг/мл регистрировали не менее 3 раз подряд при еженедельном тестировании) свидетельствует о развитии иммунокомплексного гломерулонефрита у мышей, что коррелирует с морфологическим подтверждением болезни.

Введение мурамилдипептида (MDP). MDP водили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг массы тела в первый день переноса полуаллогенных лимфоидных клеток и через 10 дней.

Определение IgE в сыворотке. Иммуноглобулин Е в сыворотке определяли иммуноферментным методом ELISA (BD OptEIA) c помощью Titertec Multiskan, длина волны 450 nm.

Определение тестостерона в сыворотке. Тестостерон в сыворотке определяли иммуноферментным методом ELISA (ИФА-БЕСТтм) c помощью Titertec Multiskan, длина волны 450 nm.

Морфологический анализ. Морфологический анализ органов мышей-гибридов B6D2F1 как интактных, так и с РТПХ, индуцированной иммунопатологией проводили методом обзорной микроскопии и общегистологическими полуколичественными методами совместно с сотрудниками Института клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, канд. мед. наук В.А. Логиновым и канд. мед. наук Л.А. Обуховой.

Статистическую обработку результатов проводили методом непараметрической статистики с использованием U-критерия Манна-Уитни (Гублер Е.В., 1978).

Результаты исследований и обсуждение

Влияние кастрации на количество лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови

Как известно, семенники являются основным органом, продуцирующим тестостерон. После хирургического удаления гонад концентрация тестостерона в сыворотке крови резко падает (Charing C. R., 1988; Kashwagi B. et. al., 2005). Так, у крыс Wistar через 6 ч после кастрации концентрация тестостерона в сыворотке крови уменьшается на 50% (Kashwagi B., et. al., 2005).

Нами для контроля кастрации также проведено определение уровня тестостерона. Забор крови для определения тестостерона проводили в первой половине дня, так как имеются данные о том, что концентрация тестостерона у мышей линии C57BLl6 выше в утренние часы (J. F. Sayegh et al., 1990).

Как видно из данных рис.1, после гонадэктомии мышей происходило достоверное снижение концентрации тестостерона в сыворотке крови ? в среднем в 4,8 раза через 5 недель после операции. В эти сроки значение тестостерона в среднем составляло 11,2 нмоль/л, тогда как у контрольных мышей 54 нмоль/л. Через 12 недель после кастрации концентрация тестостерона оставалась сниженной в среднем в 4 раза и составляла 13,5 нмоль/л.

*Р<0,001

Рис.1. Концентрация тестостерона в сыворотке крови у кастрирован-ных мышей B6D2FI

Далее исследовали содержание лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови в сроки через 5 и 12 недель после орхидэктомии.

Таблица - 1. Количество лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови, масса тимуса и селезенки, количество клеток в тимусе и селезенке в динамике посткастрационного периода

Показатели

Контроль

5 недель после кастрации

12 недель после кастрации

Количество лейкоцитов, х 109

19,3

25,9

22,0

Количество лимфоцитов, %

61,5

80,5**

81,2**

Количество лимфоцитов, 109

11,9

20,8

17,8

Масса тимуса, мг

27,1

77,6*

37,7**

Количество клеток тимуса,

х 106

47,9

157**

65,2*

Масса селезенки, мг

105

91,8

104

Количество клеток селезенки, х 106

121,3

130

125,2

*Р<0,001; **Р<0,05.

Установлена тенденция к увеличению абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови. Как видно из данных табл.1, относительное количество лимфоцитов в периферической крови достоверно повышалось через 5 и 12 недель после кастрации. Относительное количество лимфоцитов в крови гонадэктомированных животных было в среднем выше в 1,3 раза, чем у интактного контроля. Разница в показателях абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови у кастрированных и интактных животных не являлась достоверной, тем не менее, отмечалась тенденция к повышению абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови у кастрированных животных.

Влияние кастрации на массу и количество клеток в тимусе и селезенке

Из данных литературы известно, что после кастрации останавливается возрастная инволюция тимуса и наблюдается его гиперплазия (Sutherland J. S., 2005; Safadi F. F., 2000; Fitzpatrick F., 1991). Результаты исследования массы и абсолютного количества ядросодержащих клеток тимуса у самцов B6D2F1 через 5 и 12 недель после кастрации представлены в табл.1.

Как видно из приведенных данных, масса тимуса у мышей B6D2F1 через 5 недель после кастрации составила в среднем 77,6 мг, через 12 недель ? 37,7, у интактного контроля в среднем 27,1 мг. Масса тимуса через 5 недель после кастрации была в среднем в 2,9 раза больше, чем у контрольных мышей, через 12 недель ? в 1,4 раза.

Общее количество ядросодержащих клеток тимуса у кастрированных мышей в среднем было в 2,6 раза больше, чем у контрольных животных, через 5 недель после кастрации (157 x 106 в опытной группе и 47,9 x106 в контрольной) и в 1,4 раза выше через 12 недель (65,2 x 106 в опытной группе). Таким образом, во все исследуемые сроки установлено достоверное увеличение массы и клеточности тимуса у гонадэктомированных самцов B6D2F1 (Р<0,001; Р<0,05). Увеличение массы тимуса после кастрации можно объяснить усиленной пролиферацией незрелых тимоцитов и стромальных клеток тимуса за счет снижения суппрессорного влияния тестостерона на андрогенные рецепторы клеток тимуса (Aboudkhil S. et al., 1991; Sutherland J. L. et al., 2005; Roden A. J. et al., 2004). Во все сроки наблюдения у кастрированных самцов B6D2F1 не установлено каких-либо отличий по массе и количеству ядросодержащих клеток в селезенке по сравнению с интактными мышами, тогда как по литературным данным у кастрированных мышей выявляется не только значительное увеличение массы селезенки за счет экспансии В-лимфоцитов, но и изменение субпопуляционного состава клеток органа (снижение количества зрелых Т-лимфоцитов, увеличение количества CD5 - В-клеток) (Viselli S. M. et al., 1995).

Развитие гиперчувствительности замедленного типа при кастрации

Клеточный иммунный ответ у кастрированных самцов оценивался с помощью измерения ГЗТ. Степень гиперчувствительности замедленного типа у мышей определяли через 5 и 12 недель после проведения кастрации.

Как видно из данных рис.2, после кастрации происходило изменение выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа. Через 5 недель после кастрации у опытных мышей гиперчувствительность замедленного типа достоверно увеличивалась ? в среднем в 1,6 раза по сравнению с контролем. Через 12 недель после кастрации гиперчувствительность замедленного типа у опытных мышей была в среднем в 1,7 раза выше, чем в контроле.

Таким образом, кастрация приводит к достоверному увеличению клеточного иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ГЗТ) у самцов B6D2F1 (Р<0,001; Р<0,01)

*Р<0,001; **Р<0,01

Рис.2. Влияние кастрации на гиперчувствительность замедленного типа в динамике посткастрационного периода

Существуют данные, свидетельствующие о влиянии тимуса на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа, которое реализуется через растворимые медиаторы (Miller J. F., 1979). Можно предположить, что развивающаяся гиперплазия тимуса после кастрации приводит к усилению гиперчувствительности замедленного типа у гонадэктомированных животных.

Влияние гонадэктомии на количество IgM и IgG антителообразующих клеток на Т-зависимый антиген при первичном и вторичном гуморальном иммунном ответе

В литературе имеются данные о повышении продукции иммуноглобулинов класса М и G на тимуснезависимые и тимусзависимые антигены при первичном и вторичном иммунном ответе (Eidinger D., 1972).

Срок в 5 недель после кастрации для определения гуморального иммунного ответа был установлен в предварительных опытах. В различные сроки после кастрации определяли массу и клеточность тимуса. Установлено, что максимальное увеличение тимуса происходит на 5-й неделе посткастрационного периода.

Параметры первичного (IgM-АОК) гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ) исследовали в динамике посткастрационного периода через 5 и 12 недель после операции.

Из данных рис 3. следует, что количество IgМ-антителобразующих клеток у кастрированных самцов увеличивалось через 5 недель в среднем в 2,6 раза по сравнению с контролем, через 12 недель после кастрации ? в среднем в 3,5 раза.

*Р<0,001; **Р<0,05

Рис.3. Количество IgM-АОК на селезенку в динамике посткастрацион-ного периода

Уровень первичного (IgG-АОК) и вторичного (IgG-АОК) гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ) также исследовали в динамике посткастрационного периода через 5 и 12 недель после операции.

*Р<0,05

Рис.4. Количество IgG-АОК на селезенку при первичном иммунном ответе в динамике посткастрационного периода

Как видно из рис.4, количество IgG-антителобразующих клеток у кастрированных самцов через 5 недель после кастрации увеличивалось в 1,9 раза, через 12 недель ? в 1,5 раза.

Таким образом, кастрация приводит к достоверному увеличению абсолютного количества IgМ - и IgG-антителобразующих клеток, т.е. стимуляции первичного гуморального иммунного ответа.

*Р<0,05

Рис.5. Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса IgG при вторичном иммунном ответе

На рис.5 представлены данные о влиянии гонадэктомии на вторичный иммунный ответ (количество IgG-АОК на тимусзависимый антиген в селезенке). Количесво IgG-АОК в селезенке у кастрированных животных составляет 1583652, что в 1,5 раза превышает показатели у контрольных животных.

Таким образом, отмечалось достоверное усиление вторичного гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген in vivo после орхидэктомии (Р<0,05).

Влияние кастрации на концентрацию IgE в сыворотке крови

Содержание IgE в сыворотке крови у гонадэктомированных животных в динамике посткастрационного периода оставалось на одном уровне - 24,8 и 24,5 мкг/мл через 5 и 12 недель после операции соответственно (см. рис.6). Значения антител класса E в сыворотке крови было в среднем выше в 1,4 раза по сравнению с интактным контролем.

Как видно из рис.6, выявляется достоверное повышение продукции IgE in vivo у самцов B6D2F1 в посткастрационном периоде (Р<0,05). Эти результаты находят подтверждение в данных других исследований. У кастрированных самцов CBA/J после интраназальной иммунизации PLA2 отмечалась более высокая продукция IgЕ через 14 дней после кастрации, чем у ложнооперированных самцов (Yamamoto T., 2001).

*Р<0,05

Рис.6. Концентрация IgE в сыворотке крови у животных в динамике посткастрационного периода

Таким образом, оценивая в целом результаты по влиянию кастрации на гуморальный иммунный ответ, можно отметить его достоверную стимуляцию. Предполагается, что усиление антителообразования может быть связано с гиперплазией тимуса, увеличением количества В-клеток в костном мозге и селезенке (Eidinger D., 1972; Elis T. M. et al., 2001). Однако пусковые механизмы эффекта кастрации на иммунную систему остаются неизвестными, дисрегуляция в В-клеточном компартменте может быть вызвана нарушением нормальных механизмов Т-клеточного контроля (Viselli S. et al., 1995).

Особенности хронической реакции трансплантат против хозяина у интактных и кастрированных самцов B6D2F1

Физиологические различия между самками и самцами включают также и иммунную систему. Более высокий уровень нормальных иммуноглобулинов (Butterworth M. et al., 1967), антителопродукции после иммунизации (Eidinger D., Garett T. J., 1972), пониженная чувствительность к инфекциям (Huber S. A. et al., 1982), сниженная реакции отторжения (Altman S. R. et al., 1931), а также превалирование аутоиммунной патологии у самок связаны с половыми различиями в иммунном ответе (Treurniet R. A. et al., 1993). Тем не менее, патогенетические механизмы, объясняющие эти различия, до сих пор не известны. Показана более высокая чувствительность самок к развитию гломерулонефрита после индукции хронической РТПХ (Van Griensven M. et al., 1997).

Хроническая РТПХ как экспериментальная модель системной красной волчанки у мышей используется для изучения как общих механизмов формирования аутоиммунитета, так и люпусного нефрита (Lewis R. M. et al., 1968; Bruijn J. A. et al., 1992). Хроническая РТПХ развивается в полуаллогенной модели DBA/2> (C57BL/6 Ч DBA/2) F1 - при переносе лимфоидных клеток одного из родителей (донора) реципиентам-гибридам. Чаще используется модель переноса клеток селезенки родителя DBA/2 (самки или самцы) реципиентам-гибридам B6D2F1 или B10D2F1 (самки или самцы) (Via C. S. et al., 1991).

Показано, что перенос лимфоидных клеток от самок DBA/2 интактным реципиентам-самцам B10D2F1 не приводил к развитию аутоиммунного гломерулонефрита (Treurniet R. A. et al., 1993). Добавление гонад-эктомированным самцам эстрогенов не приводит к появлению протеинурии и развитию нефрита, введение андрогенов снижало уровень протеинурии у реципиентов-самок (Van Greinsven M. et al., 1997).

Детальное изучение хронической РТПХ в модели DBA/2>B6D2F1 на самках-реципиентах показало, что в зависимости от преобладающего соотношения Th1/Th2 CD4+ Т?лимфоцитов в ключевой момент развития реакции течение хронической РТПХ может направляться по двум оппозитным вариантам: Th1-зависимой иммунопатологии (группа nonlupus, без развития иммунокомплексного гломерулонефрита) и Th2 - зависимой иммунопатологии (группа lupus, при этом развивается иммунокомплексный гломерулонефрит) (Сафронова И.В., 2001; Кудаева О.Т., 2003).

Индукцию РТПХ проводили на интактных и кастрированных самцах. При этом кастрацию осуществляли в разные сроки относительно индукции РТПХ.

Частота развития люпус-нефрита у интактных и кастрированных животных

Как видно из данных рис.7, у 72% интактных самцов B6D2F1 после индукции РТПХ развивается lupus-нефрит, индукция РПТХ на 5-й неделе после кастрации приводила к достоверному снижению числа случаев lupus-нефрита - только у 38,4% мышей развивался иммунокомплексный гломерулонефрит.

Проведение кастрации на 7-й день после индукции РТПХ не изменяет частоты возникновения lupus-нефрита у мышей, она составляет 33%. Показано, что длительный дефицит андрогенов у мышей C57Bl/6 вследствие кастрации в возрасте 1,5 мес, приводил к 2-6 - кратной стимуляции продукции ИЛ-2 и к 3-7-кратному увеличению продукции ИФг ConA-стимулированными клетками селезенки in vitro, что соответствует профилю Th1 (Viselli S. M. et al., 1995). Можно предполагать, что эта девиация продукции цитокинов вследствие кастрации приводит к изменению соотношения Th1/Th2 в сторону Th1 и, следовательно, снижению числа случаев lupus-нефрита.

Рис.7. Течение хронической РТПХ у интактных самцов, кастрированных самцов и после введения MDP у кастрированных самцов B6D2F1

Ранее показано, что введение во время индукции РТПХ препаратов, сдвигающих соотношение Th1/Th2, изменяет частоту развития клинических вариантов расстройства иммунитета - lupus+ или lupus - (Кудаева О.Т., 2005). Для модуляции развития хронической РТПХ у самцов в сторону Th2-варианта был использован компонент клеточной бактериальной стенки мурамилдипептид. Введение MDP, который стимулирует выработку провоспалительных цитокинов, вызывает поликлональную активацию В-клеток и усиливает стимулирующее влияние ИЛ-4 на активированные В-лимфоциты в момент индукции РТПХ на 5-й неделе после кастрации, увеличивает число животных lupus+ с 38 до 60% (см. рис.7).

Уровень IgE в сыворотке крови у мышей до и после индукции РТПХ у интактных и кастрированных животных

Как следует из данных литературы (Grossman Ch. J. et al., 1990) и полученных результатов, гонадэктомия приводит к усилению гуморального иммунного ответа и увеличению продукции антител класса IgM, IgG и IgЕ. Продукция IgЕ у мышей регулируется также Th2-цитокинами (Snapper C. M., 1987). Было изучено влияние гонадэктомии на содержание IgE в сыворотке крови у мышей после индукции РТПХ (см. табл.2).

Таблица - 2. Влияние кастрации на уровень IgE в сыворотке крови у самцов B6D2F1 после трансплантации полуаллогенных лимфоидных клеток

Показатель

РТПХ

GE+РТПХ

lupus

nonlupus

lupus

nonlupus

Уровень IgE мкг/мл

26,4

16,1

33,2*

17,4

*Р0,05 (между группой lupus и nonlupus у гонадэктомированных самцов).

Как видно из данных, представленных в табл.2, у гонадэктомирован-ных животных в группе lupus, которая характеризуется преобладающим влиянием Th2-ответа, достоверно увеличивается концентрация IgЕ в сыворотке крови в 1,9 раза по сравнению с группой nonlupus. У негонадэктомированных животных группы lupus отмечается тенденция к повышению IgЕ в сыворотке крови. Таким образом, иммунокомплексный гломерулонефрит у гонадэктомированных самцов сопровождается усилением продукции IgE.

Влияние хронической РТПХ на содержание тестостерона в сыворотке крови у интактных и кастрированных самцов B6D2F1

Установлены различия в уровне сывороточного тестостерона у интактных и кастрированных самцов с индуцированной РТПХ (см. табл.3). Видно, что у некастрированных особей с Th2-зависимым вариантом РТПХ (с поражением почек) отмечалось достоверное снижение концентрации тестостерона ? в 3,5 раза по сравнению с мышами с Th1-зависимым вариантом хронической РТПХ (без поражения почек). У гонадэктомированных самцов с развившимся аутоиммунным гломерулонефритом концентрация тестостерона составила 8,8 нмоль/л. Это значение ниже показателей тестостерона у особей с Th1 - вариантом РТПХ в 1,2 раза, но различие не является статистически достоверным.

Таблица - 3. Концентрация тестостерона в сыворотке крови в группах lupus и nonlupus у мышей

Показатель

РТПХ

GE+РТПХ

lupus

nonlupus

lupus

nonlupus

Тестостерон, нмоль/л

16,8*

58

8,8

10,7

*Р0,05 (между группой lupus и nonlupus у интактных самцов).

Полученные результаты подтверждают наличие изменения гормонального статуса у самцов nonlupus - и lupus-реципиентов. У самцов формирование Th2-зависимого lupus-варианта связано с резким снижением уровня тестостерона, что может объясняться действием комплекса факторов, а также сложным взаимодействием тестостерона и провоспалительных цитокинов. Известно, что половые гормоны способны влиять на продукцию провоспалительных цитокинов. Так, эстрогены и тестостерон повышают концентрацию провоспалительных цитокинов (ФНО-б и ИЛ-1в) при аутоиммунном миокардите. Гонадэктомия самцов приводит к уменьшению провоспалительного цитокина ИЛ-1в, тем самым снижая проявления аутоиммунного миокардита (Fairweather D., 2004). Сложные процессы, происходящие после индукции РТПХ, в частности цитокиновый шторм, могут влиять на изменение содержания тестостерона у самцов.

Сравнительная морфология почек у самок и самцов после проведения хронической РТПХ

По нашим данным, при переносе 150х106 клеток селезенки от самок DBA/2 интактным самцам BDF1 частота развития иммунокомплексного гломерулонефрита (ИКГ) составляет 72%, что практически совпадает с данными о частоте возникновения ИКГ у самок при переносе такого же количества клеток - он составляет 60% (Сафронова И.В., 2001). У гонадэктомированных самцов частота возникновения ИКГ достоверно снижается и составляет 35%.

Таблица 4. Относительная площадь структур на срезе коркового и мозгового вещества почки (в % от площади среза)

Показатель

самки

самцы

контроль

lupus

контроль

lupus

Корковое вещество почки

Канальцы

90,2

66,3*#

90,8

88,1#

Клубочки

3,4

1,5*

3,9

2,0*

Кровеносные сосуды

5,9

2,1*#

5,3

3,4*#

Лейкоцитарные инфильтраты

0,2

13,2*#

0

0#

Цилиндры

0

7,4*

0

3,6*

Кисты и полости с жидкостью

0

9,5*

0

2,9*

Мозговое вещество почки

Канальцы и трубочки

95,8

94,9

97,5

97,3

Кровеносные сосуды

4,0

1,3*#

2,5

2,2#

Цилиндры

0

3,8*#

0

0,5*#

(Р<0,05): * ? между контрольной и опытной группой;

# ? между опытными группами.

По данным Кудаевой О.Т. (2006), у самок lupus обнаруживается более высокий уровень тестостерона в сыворотке крови по сравнению с nonlupus. По нашим данным, у самцов lupus по сравнению с nonlupus наблюдается резкое снижение концентрации тестостерона. Уровень иммуноглобулина Е как у самок, так и у самцов более высокий у особей с lupus-нефритом. Как у самок, так и у самцов удается модулировать течение хронической РТПХ в сторону Th2? варианта с помощью MDP. Таким образом, индукция РТПХ у самок и самцов имеет как сходства, так и различия.

Наблюдаемые особенности течения хронической РТПХ у самцов и самок возможны и в отношении морфологического проявления гломерулонефрита. Для выявления этих особенностей были проведены гистологические исследования почек у самцов и самок с иммунокомплексным гломерулонефритом (см. табл.4).

Морфологическое исследование почек показало, что развитие аутоиммунного гломерулонефрита у самцов характеризуется меньшей выраженностью поражения клубочков и канальцев, отсутствием лейкоцитарных инфильтратов и поражения стенок сосудов по сравнению с самками. Лейкоцитарный инфильтрат почек самок представлен преимущественно лимфоцитами. Наличие соединительной ткани в корковом и мозговом веществе почек не отмечается, что указывает на отсутствие склероза почечной ткани (см. табл.4). Не выявлялось наличие кровоизлияний в почках у животных с гломерулонефритом (см. табл.4).

Таким образом, характер поражения почек у самцов с иммунокомплексным гломерулонефритом отличается от такового у самок. Развитие аутоиммунного гломерулонефрита у самцов характеризуется меньшей выраженностью деструктивных процессов в почках по сравнению с самками.

Выводы

1. Относительное количество лимфоцитов, масса тимуса и общее число ядросодержащих клеток тимуса достоверно выше через 5 и 12 недель после кастрации по сравнению с контролем.

2. Кастрация приводит к усилению интенсивности гуморального иммунного ответа in vivo. Происходит достоверное повышение абсолютного числа IgМ-АОК и IgG-АОК в селезенке при первичном иммунном ответе на Т-зависимый антиген через 5 и 12 недель после кастрации. Достоверно увеличивается количество IgG-АОК в селезенке при вторичном иммунном ответе на Т-зависимый антиген через 5 недель после кастрации. Концентрация IgЕ в сыворотке интактных кастрированных животных достоверно увеличивается во все сроки наблюдения по сравнению с контрольными животными.

3. После кастрации достоверно возрастает клеточный иммунный ответ. ГЗТ увеличивается в 1,7 и 1,5 раза через 5 и 12 недель после операции соответственно по сравнению с контролем.

4. Проведение кастрации в различные сроки относительно индукции РТПХ достоверно снижает частоту развития иммунокомплексного гломерулонефрита по сравнению с интактными животными. У интактных самцов после индукции РТПХ иммуннокомплексный гломерулонефрит развивался в 72,4% случаев, у кастрированных - в 38,4%.

5. Введение мурамилдипептида одновременно с индукцией РТПХ приводит к увеличению частоты иммунокомплексного гломерулонефрита до 60% случаев.

6. Индукция РТПХ приводит к достоверному повышению уровня IgЕ в сыворотке крови у кастрированных животных группы lupus по сравнению с группой nonluрus.

7. Индукция РТПХ у интактных самцов сопровождается резким достоверным снижением концентрации тестостерона в сыворотке крови в группе с иммунокомплексным гломерулонефритом lupus по сравнению с группой nonlupus.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У кастрированных животных целесообразно проводить профи-лактику бактериальных инфекций при патологиях почек и болезнях нижних мочевыводящих путей, а также профилактические мероприятия по предупреждению воспалений мочевыделительной системы.

2. При терапии кастрированных животных рекомендуется исключить применение препаратов, обладающих поликлональными иммуностимулирующими свойствами, как факторов, провоцирующих поражение почек.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние гонадэктомии и на антителообразование и продукцию IgЕ у интактных мышей и мышей с аутоиммунным гломерулонефритом / С.А. Арсенова, О.Т. Кудаева, Е.Д. Гаврилова, Е.В. Гойман, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - №2/1. - С.16-17.

2. Арсенова С.А. Уровень тестостерона у самцов в эксперимен-тальной модели аутоиммунного гломерулонефрита / С.А. Арсенова // Инновационный потенциал молодых ученых в развитии агропромышленного комплекса Сибири: материалы VII Межрегион. конф. молодых ученых и специалистов аграрных вузов Сиб. Федерал. округа. - Новосибирск, 2009. - С.148-150.

3. Влияние кастрации на частоту развития аутоиммунного гломе-рулонефрита и уровень IgЕ / С.А. Арсенова, О.Т. Кудаева, Е.Д. Гаврилова, Е.В. Гойман, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Патология продуктивных и нерепродуктивных животных: материалы 8-й межрегион. науч. - практ. конференции. - Омск, 2009. - С.189-194.

4. Арсенова С.А. Влияние кастрации на параметры гуморального иммунного ответа / С.А. Арсенова, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных: материалы междунар. науч. - практ. конф. - Троицк, 2009. - С.237-239.

5. Влияние гонадэктомии на уровень IgЕ в экспериментальной модели аутоиммунного гломерулонефрита / С.А. Арсенова, О.Т. Кудаева, Е.Д. Гаврилова, Е.В. Гойман, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Симбиоз Россия 2009: материалы II Всерос. с междунар. участием конгр. студентов и аспирантов-биологов (25-29 мая). - Пермь, 2009. - С.268-270.

Размещено на Allbest.ru


Подобные документы

  • Характеристика кастрации. Способы кастрации самцов: открытый, закрытый. Анализ перкутанного способа кастрации и процес подготовки жеребцов к кастрации. Применение буторфанола при кастрации. Техника кастрации баранов и содержание животных после операции.

    реферат [43,0 K], добавлен 17.12.2011

  • Показания для кастрации, методы ее проведения. Исследование животного и порядок подготовки его к данной процедуре. Инструментарий и его стерилизация. Техника открытого и закрытого способа кастрации. Кастрация с первичным глухим швом (по Т.С. Минкину).

    курсовая работа [47,9 K], добавлен 02.12.2014

  • Задачи ветеринарной медицины по профилактике, ликвидацию болезней и лечение животных, обеспечению выпуска доброкачественных в санитарном отношении продуктов животноводства. Новые способы кастрации, способствующие стимулированию откорма и роста скота.

    дипломная работа [48,6 K], добавлен 28.07.2010

  • Происхождение, экстерьер и спортивные перспективы лошади. Кастрация жеребцов, подготовка животного к операции. Техника проведения операции. Кровотечение из сосудов культи семенного канатика. Проведение кастрации взрослого, сформировавшегося жеребца.

    курсовая работа [4,8 M], добавлен 07.11.2012

  • Понятие и принципы проведения кастрации животных, ее специфические особенности при проведении операции у жеребцов, цели и задачи процедур. Краткие сведения по топографии мошонки и семенников. Исследование животных перед операцией, послеоперационный уход.

    презентация [1,2 M], добавлен 24.11.2015

  • Инструменты, перевязочный материал, медикаменты, необходимые для проведения операции кастрации хрячка. Соблюдение правил асептики. Стерилизация перевязочного материала и хирургического белья. Подготовка животного к операции и возможные осложнения.

    практическая работа [32,7 K], добавлен 09.01.2011

  • Показания и противопоказания к операции кастрации хряков. Подготовка животного к операции, фиксация его во время ее проведения. Подготовка рук хирурга, инструментов, шовного и перевязочного материала. Анатомо-топографические данные оперируемой области.

    курсовая работа [319,7 K], добавлен 03.12.2011

  • Методы и техника кастрации. Классификация хирургических методов ее проведения по И.И. Магда. Анатомо-топографические данные о половых органах хряка. Исследование животных перед кастрацией, показания к ее проведению. Профилактика хирургической инфекции.

    курсовая работа [22,1 K], добавлен 27.07.2013

  • Ботаническая характеристика, биологические особенности и использование сорго-суданковых гибридов; эффект гетерозиса в селекции новых гибридов. Экономическая эффективность получения зеленой массы от сорго-суданковых гибридов, методика проведения опытов.

    дипломная работа [77,1 K], добавлен 20.08.2010

  • Анализ кастрации, обеспложивания самцов и самок путем оперативного удаления половых желез или путем прекращения их функции. Описания показаний и противопоказаний к операции, фиксации животного во время операции, обезболивания, послеоперационного ухода.

    реферат [276,0 K], добавлен 06.12.2011

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.