Биохимические и биотехнологические аспекты фитопатогенных стрептомицетов картофеля

Размещено на http://www.allbest.ru/

МГУ М.В. Ломоносова

Биохимические и биотехнологические аспекты фитопатогенных стрептомицетов картофеля

Космачевская Л.Н.

Аннотация

Целью настоящей работы было выявление особенностей строения анионных углеводсодержащих полимеров клеточных стенок патогенных стрептомицетов, вызывающих заболевание клубней картофеля паршой. Было установлено, что клеточные стенки изученных фитопатогенных стрептомицетов содержали анионный полимер под сокращенным названием Kdn. Доказано, что Kdn, впервые обнаруженный в прокариотической клетке, является одним из факторов патогенности. Полученные результаты могут послужить основой будущих исследований общего процесса патогенеза сельскохозяйственных растений, позволят разработать способы предотвращения адгезии, решив, таким образом, проблему устранения факторов патогенности с помощью методов биотехнологии.

Ключевые слова: ФИТОПАТОГЕННЫЕ СТРЕПТОМИЦЕТЫ, ПАРША КАРТОФЕЛЯ, АНИОННЫЕ ПОЛИМЕРЫ, ПАТОГЕНЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ

Основная часть

патогенный картофель парша стрептомицет

Среди продуктов питания, составляющих основу продовольственного рынка России, картофель занимает особое место, оказывая существенное влияние как на формирование структуры рынка, так и на обеспечение продовольственной безопасности страны.

В настоящее время на долю России, при численности населения 2,5% от населения мира, приходится 17% посевных площадей картофеля и 11% мирового валового сбора. Годовая емкость российского рынка картофеля (без учета внешнеэкономической деятельности) в последние годы составляет 35-36 млн. т [1]. Наша страна, занимая лидирующее положение в мире по валовому производству картофеля и его потреблению, остается на одном из последних мест по урожайности этой культуры. В странах с развитым картофелеводством: Китае, США, Германии, Голландии, - урожайность картофеля достигает 23-48 т/га. В России этот показатель в несколько раз ниже: возделывая картофель на площади более 3 млн. га и получая около 35 млн. тонн валового урожая, мы имеем урожайность около 12 т/га [2]. Одной из причин этого является отсутствие высококачественного семенного материала - незараженных фитопатогенными микроорганизмами и физиологически правильно развитых клубней.

Гибель картофеля от различных патогенов может достигать иногда 80%, в частности, порча клубней от парши может доходить до 30% урожая.

Культура может быть поражена патогенами еще до появления всходов, во время вегетации и в период хранения. Размножение картофеля клубнями способствует передаче и накоплению из года в год многих фитопатогенов. Больные клубни, попадая из хранилища в поле, становятся источником распространения заболеваний, а поражение ботвы во время вегетации является одной из причин загнивания клубней при хранении.

Патогенность - это способность организма вызывать заболевание. Патогенность - важный в таксономическом отношении признак, поскольку он является свойством вида. Однако отдельные штаммы бактерий данного вида могут сильно различаться по степени патогенности. Степень патогенности называется вирулентностью. В соответствии с этим вирулентность - признак штамма, а не вида. Можно говорить о штаммах высоковирулентных, низковирулентных и авирулентных [3].

Стрептомицеты - фитопатогены картофеля вызывают паршу, которая поражает клубни картофеля, а также корнеплоды моркови, редиса, свеклы, турнепса. Парша вызывает глубокие или поверхностные оспины (ямки), повреждая картофельные клубни и корни ряда растений, перечисленных выше. Парша есть везде, где выращивают картофель. Она широко распространена в Америке, Японии, России и многих других странах. Существует несколько разновидностей парши: сетевая, красно-коричневая. Это комплексное бактериальное заболевание, симптомы которого различны, так же, как и вызывающие их агенты. Эта болезнь обычно распространена там, где рН почвы 5,2-8,0 и выше, и это, по-видимому, является решающим фактором развития патогена.

Заболевание влияет на урожай, размер клубней, ухудшается качество крахмала и товарный вид картофеля. В инфицированных клубнях сначала образуются небольшие рельефные пятна, которые затем разрастаются, объединяются и образуют корку. Повреждения достигают 3-4 см в глубину.

Процесс развития стрептомицета на клетках хозяина состоит из нескольких этапов [4]. Споры стрептомицета, попадая на поверхность клубня, образуют в местах раневых поверхностей одну или две прорастающие трубки, которые развиваются и образуют мицелий. Патоген растет и развивается через слои клеток, питаясь отмершими клетками. В ответ на инфекцию живые клетки окружают поврежденную ткань, образуя несколько слоев корковых клеток, которые изолируют патоген от других растительных клеток. Патоген растет на следующих умерших клетках, и, таким образом, развивается большое повреждение.

Некоторое время полагали, что только стрептомицеты вида scabies вызывают это заболевание. Это сапрофиты, которые могут существовать независимо во многих не кислых почвах. Однако исследования последних лет показали, что в эту группу входят различные виды. Практически уже доказано, что это свойство существует независимо от вида, так как заболевание картофеля вызывают филогенетически различные виды [5]. Патогенность не коррелирует с таксономическим и филогенетическим положением стрептомицетов. Хотя наиболее часто встречаемым возбудителем является Streptomyces scabies, описаны и другие патогены-стрептомицеты: S. setonii, S. griseus, S. tendae, S. Bottropensis [6].

Американскими учеными было установлено, что причиной парши картофеля является продуцируемый стрептомицетами фитотоксин такстомин А [7]. Но количество продуцируемого такстомина А не коррелирует со степенью поражения клубней картофеля (% заражения поверхности клубня), что наводит на мысль о существовании еще каких-то факторов, вызывающих болезнь.

Те же исследователи показали, что за вирулентность и патогенность стрептомицетов ответственен ген nec1. В частности, существует строгая корреляция между продуцированием такстомина и присутствием этого гена в генетически различных стрептомицетах-патогенах картофеля, таких, как S. scabies, S. acidiscabis, S. turgidiscabies [8]. Этот ген не был найден в 27 непатогенных стрептомицетах. Доказано, что он был трансформирован в S. acidiscabies и S. turgidiscabies через горизонтальный генный перенос из неродственного таксона. В отличие от S. Scabies, они сравнительно недавно приобрели способность паразитировать на растениях [9].

Целью нашей работы было изучение особенностей Kdn (3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновая кислоты), анионный полимер которой впервые найден нами в бактериях - стрептомицетах, патогенах картофеля. Об этом полимере пойдет речь ниже.

В последние годы проблема анионных полимеров клеточных стенок грамположительных бактерий приобрела новый аспект. Получен ряд экспериментальных данных, свидетельствующих о возможности использования особенностей структур тейхоевых кислот в систематике бактерий, в частности, актиномицетов, в качестве хемотаксономических маркеров. Для некоторых родов актиномицетов показана видоспецифичность структуры тейхоевой кислоты. Также актуальна проблема взаимодействия поверхностных полимеров патогенных бактерий с эукариотической клеткой. Это именно те структуры, с помощью которых происходит процесс адгезии патогена к клетке хозяина, первый этап в многоступенчатом инфекционном процессе, завершающемся поражением эукариотической клетки.

Полимеры клеточных стенок патогенных стрептомицетов и механизмы прикрепления патогена к клеткам клубня картофеля мало исследованы. Для выяснения молекулярных основ контактных взаимодействий патогенных стрептомицетов с клетками хозяина необходимо знать структуру тех соединений, которые участвуют в этих взаимодействиях.

В нашей работе были исследованы 18 стрептомицетов: 2 штамма, близкие к Streptomyces flavogriseus, 4 штамма, близких к Streptomyces scabies - классическому патогену картофеля, 4 штамма, принадлежащих к группе Streptomyces setonii, а также несколько других штаммов (табл. 1).

Первые два штамма, Ac-2090 и Ac-2501, по данным секвенирования 16S rDNK, были близки к группе стрептомицетов рода flavogriseus. Неожиданно оказалось, что основным полимером клеточных стенок этих организмов был полимер 3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновой кислоты (Kdn) (рис. 1). Это вещество не характерно для клеточной стенки бактерий.

Полимер был исследован, и было установлено, что он состоит из более чем 20 остатков Kdn, связанных между собой -24 связью. Каждый остаток имеет при С-8 -глюкозильный заместитель. Вообще Kdn представляет собой 9-атомный кетосахар, принадлежащий к семейству улозоновых кислот, уникальный дезаминированный аналог сиаловых кислот. До наших работ было уже изучено около 50 клеточных стенок непатогенных стрептомицетов, но это соединение не было обнаружено.

Как видно из таблицы 1, ранее Kdn был найден в составе олигомеров в эукариотических клетках (икре форели, некоторых тканях крыс, раковых клетках человека и др.) и в некоторых грамотрицательных бактериях. Полимеры же Kdn не были ранее обнаружены ни в прокариотической, ни в эукариотической клетке. Далее было интересно выяснить, является ли вновь обнаруженный полимер характерным соединением патогенных стрептомицетов, или обнаруженное соединение присутствует только в данном виде этого рода.

Для анализа мы взяли еще 4 штамма (табл. 2), принадлежащие к группе Streptomyces scabies, широко известным фитопатогенным стрептомицетам, вызывающим паршу картофеля. Результаты их исследований показали, что клеточная стенка S. scabies 40374 содержала свободные 2,3 и 1,3-поли(глицерофосфатные) цепи и опять Kdn. Небольшое количество этого соединения не позволило определить, входит ли оно в гомогенный или гетерогенный полисахарид. Клеточные стенки 3 следующих штаммов Ас-304, Ас-306 и Ас-305 этой группы оказались весьма интересными. Они тоже содержали полимер Kdn, но его строение было несколько иным, чем в группе flavogriseus.

Таблица 1

Встречаемость и структура гликоконъюгатов, содержащих полисиаловые кислоты

*Neu5Ac -- N-ацетилнейраминовая кислота

* *Neu5Gc - N-гликозилнейраминовая кислота

***Kdn - 3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновая кислота

Рис. 1 Повторяющееся звено Kdn-содержащего полимера

Таким образом, все 4 штамма, отнесенные к S. scabies по данным секвенирования 16S rDNK, содержали в клеточных стенках 3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновую кислоту и глицеринтейхоевые кислоты различной структуры.

Вид Streptomyces setonii также относится к фитопатогенам и вызывает паршу картофеля. Было исследовано 4 штамма этой группы стрептомицетов.

Клеточная стенка штамма ВКМ Ас-2124, отнесенного к этой группе, проявляла значительную вирулентность, ее анионные полимеры отличались от клеточных стенок других штаммов S. scabies. В ее составе обнаружены три анионных полимера различной структуры: тейхуроновая кислота с повторяющейся единицей, диаминоманнуроновая кислота с глюкозой (такая структура тейхуроновой кислоты была обнаружена впервые), 1,5-поли(рибитфосфат) с -глюкозильным заместителем и снова полимер Kdn с -глюкозой, аналогичный тому, который был идентифицирован нами в S. flavogriseus.

Три других штамма, принадлежащих той же группе, также имели в клеточной стенке несколько анионных полимеров: тейхуроновую кислоту новой структуры, но с другой повторяющейся единицей: диаминоманнуроновой кислоты с галактозамином, и 1,5-поли(рибитфосфат) с -глюкозильным заместителем. И только в штамме Ас-2277 было идентифицировано небольшое количество остатков Kdn. То, что разные штаммы содержат разные структуры тейхуроновых кислот, может свидетельствовать о том, что эта группа гетерогенна по своему составу и содержит разные виды (или подвиды) стрептомицетов. То есть полимер Kdn содержали два из четырех штаммов этой группы.

Далее для сравнения были взяты несколько штаммов стрептомицетов, не относящихся к вышеописанным группам.

Таблица 2

Анионные полимеры фитопатогенных штаммов стрептомицетов

Штамм Streptomyces sp. ВКМ Ас-2125 с неустановленным систематическим положением содержал, помимо замещенного глюкозой поли(глицерофосфата), нейтральный полисахарид, состоящий из эквимолярного количества маннозы и галактозы, причем он являлся основным компонентом клеточной стенки. Это было довольно неожиданно, тем более, что такое соединение под названием галактоманнан, но иной структуры, было найден только в эукариотах. Однако это был единственный случай обнаружения галактоманнана в исследуемых организмах. Клеточная стенка содержала также небольшое количество остатков Kdn. В связи с необычным составом клеточной стенки этот стрептомицет, очевидно, не относится к вышеописанным группам.

Еще два исследованных штамма S. diastatochromogenes ВКМ Ас-1760 и S. sp. ВКМ Ас-2502 имели одинаковый состав клеточных стенок и содержали 1,3-глицеринтейхоевые кислоты, частично замещенные -N-ацетилглюкозамином.

Стрептомицет S. bottropensis ВКМ Ас-1755т содержал отличную от других тейхое-вую кислоту: поли(гликозилглицерофосфат).

Последние три штамма не содержали Kdn.

Многие исследователи отмечали, что полисахариды, содержащие производные улозоновых кислот, участвуют в контактах между клетками, т. е. обладают адгезивными свойствами.

Фитопатогенез - это довольно сложный процесс, состоящий из нескольких этапов. Внедрение стрептомицета в клетки картофеля начинается на стадии прорастания споры, когда из споры вырастает ростовая трубка. Именно в этот момент происходит адгезия и внедрение патогена в клетку хозяина. И, по аналогии с многочисленными данными других исследователей сиаловых кислот животных тканей, мы предполагаем, что Kdn участвует в одном из начальных этапов патогенного процесса: способствует адгезии стрептомицета к клеткам хозяина.

Патогенность всех исследованных нами стрептомицетов определялась сотрудниками Белорусского Института картофелеводства. Как видно из таблицы 2, почти все штаммы стрептомицетов, содержащие в составе клеточной стенки полимер Kdn, являлись вирулентными.

В связи с этим мы можем утверждать, что найденный нами полимер участвует в одном из этапов патогенного процесса: в присоединении стрептомицета к клеткам хозяина, т. е. является одним из факторов патогенности. То, что мы не нашли Kdn в нескольких штаммах, обладающих вирулентностью, можно объяснить тем, что количество этого полимера (как и всякого другого) в клеточной стенке на разных этапах развития организма различно.

Cледует учесть, что метод ЯМР-спектроскопии дает положительный, т.е. обнаруживает вещество, лишь в случаях, когда оно составляет не менее 20% от общего состава компонентов клеточной стенки. Таким образом, меньшее количество этого полимера могло быть не обнаружено. Вполне вероятно, что в мицелии на ранних стадиях роста должно быть больше Kdn-полимера, что мы и наблюдали при получении некоторых штаммов. Это подтверждается и тем, что повторное изучение одного и того же штамма давало разные результаты относительно количества и Kdn, и тейхоевых кислот.

В штамме S. diastatochromogenes ВКМ Ас-1760, оказавшемся авирулентным, Kdn не была обнаружена.

Возможно, таким же образом, вследствие горизонтального генного переноса, с помощью которого стрептомицеты обмениваются генной информацией, Kdn попала в некоторые штаммы и виды, ранее не отмеченные как патогены картофеля.

Это исследование выявленных особенностей в строении полимеров клеточных стенок вирулентных штаммов, по мнению автора, внесет свой вклад в гипотезу о видовой специфичности анионных полимеров стрептомицетов и откроет биотехнологические перспективы борьбы с фитопатогенами картофеля.

Отметим также, что настоящее исследование привело к открытию новых структур и нейтральных полисахаридов. Структура галактоманнана, обнаруженного в штамме Ас-2125, ранее не была идентифицирована в прокариотической клетке. Гомогенный полимер, состоящий из остатков N-ацетилгалактозамина (штаммы Ас-304 и Ас-306), также был обнаружен впервые.

Настоящая работа является первым исследованием, посвященным изучению анионных полимеров клеточных стенок патогенных стрептомицетов, которые, возможно, являются соединениями, участвующими в контактах между прокариотической и эукариотической клетками. Обнаруженный нами полимер Kdn до наших исследований не был найден ни в прокариотической, ни в эукариотической клетке. Эти знания в дальнейшем позволят разработать способы предотвращения адгезии в проблеме заболеваний картофеля, а также решить ряд экологических проблем, в первую очередь, с помощью методов биотехнологии.

Список использованных источников

1. Голохвастов А.М. Состояние и перспективы российского рынка картофеля // Информационный бюллетень «Агроинформ». 2007. №52. http://www.agricons.spb.ru/services/52-agroinform/sost.html.

2. Картофель в России: популярен, перспективен, технологичен... и очень запущен. Издательский дом «Независимая аграрная пресса». 2010. http://agroobzor.ru/rast/a-126.html.

3. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. Мир. 1979, - т. 3. 365 p.

4. Agrious G. Plant Patology (Fourth Edition) Academic Press. 1997. 635 p.

5. Takeuchi T., Sawada H., Tanaka F., Matsuda I. Philogenetic analisis of Streptomyces spp. causing potato scab based on 16S rRNA seguences. // Int. J. System. Bacteriol. 1996. 46(2). P. 476-479.

6. Miyajima K., Tanaka F., Takeuchi T., Kuninaga S. Streptomyces sp. nov. Int. J. System. Bacteriol. 1998. 48. P. 495-502.

7. King R., Lawrence C., Gray J. Herbicidal properties of thaxtomin group of phytotoxin. // J. Agric Food Chem. 2001. 49(5). P. 298-301.

8. Healy F., Wach M., Krasnoff S., Gibson D., Loria R. The txtAB genes of the plant pathogen Streptomyces acidiscabies encode a peptide synthetase required for phytotoxin thaxtomin A production and pathogenicity // Mol. Microbiol. 2000. 38(4). P. 794-804.

9. Healy F., Bukhalid R., Loria R. Characterization of an insertion seguence element associated genetically diverse plant pathogenic Streptomyces spp. // J. Bacteriol. 1999. 181(5). P. 1562-1570.

Размещено на Allbest.ru