Создание исходного материала якона (Polymnia sonchifolia Poepp. & Endl.) при интродукции

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Создание исходного материала якона (Polymnia sonchifolia Poepp. & Endl.) при интродукции

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство

Колесникова Елена Олеговна

Рамонь - 2009



Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова» РАСХН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Жужжалова Татьяна Петровна

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Тороп Александр Андреевич;

кандидат биологических наук Машкина Ольга Сергеевна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет им. К.Д. Глинки»



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важным направлением селекции является обогащение генофонда сахароносных культур путём создания новых форм, сортов и гибридов. Успех этой работы в значительной степени определяется интродукцией полезных растений малоизвестных видов и сортов, произрастающих в различных районах земного шара.

Ценным объектом для интродукции в России является якон (Polymnia sonchifolia Poepp. & Endl.). Это многолетнее растение из Южной Америки в своих корневых клубнях содержит до 60% инулина и имеет урожайность 28 - 100 т/га (Grau, Rea, 1997), что делает его ценным сырьём для пищевой и лекарственной промышленности. Поскольку цветение даже на родине затруднено, якон размножается преимущественно вегетативным путём. В связи с этим селекционная работа с ним проводится путём отбора клонов по массе клубней, по содержанию инулина. Вместе с тем это растение отзывчиво к культивированию в условиях in vitro, что открывает широкие возможности для создания исходного селекционного материала с использованием современных методов биотехнологии. В Российской Федерации имеются единичные публикации по размножению якона путём микроклонирования (Таратонов, Знаменская, Корниенко, 1997; Тюкавин, Кононков, 1997), а также по выявлению его биологических особенностей и адаптационных свойств при интродукции на Среднем Урале (Багаутдинова, Федосеева, Рымарь, 1999), в Подмосковье (Тюкавин, 1999), в Краснодаре (Гуйда, 2007). Работы по интродукции и селекции данного растения в условиях Центрально-Черноземного региона (ЦЧР) не проводились.

В связи с этим актуальным является выявление биологического потенциала и адаптивных свойств якона при выращивании в ЦЧР, а также специфических условий, способствующих формированию регенерантов в условиях in vitro и получению новых форм с помощью методов биотехнологии. Такой подход будет способствовать расширению генетического разнообразия якона и проведению селекционных исследований по данной культуре.

Цель работы: выявить биоморфологические и биохимические особенности якона при выращивании в условиях ЦЧР и разработать методы создания нового исходного материала с использованием культуры тканей.

Задачи исследований:

1. Изучить особенности морфологического развития и биохимических свойств якона при выращивании в ЦЧР.

2. Определить оптимальные условия культивирования якона in vitro.

3. Изучить влияние колхицина на образование полиплоидов якона в условиях культуры ткани.

4. Разработать способ получения нового исходного материала якона на основе индуцирования каллусогенеза и получения сомаклональных вариантов.

Научная новизна. Впервые в климатических условиях ЦЧР установлено, что развитие якона отражает способность растения вегетировать без плодоношения, а строение побега подчиняется общим закономерностям изменения метамеров растений. Выявлено, что адаптационный потенциал якона зависит от гидротермического коэффициента, и нормальное развитие растения в полевых условиях возможно при ГТК не менее 1,1. Положительное влияние на ростовые процессы якона оказывает применение удобрений N₅₀P₅₀K₅₀ совместно с ретардантом 577 (0,05 мл/л), что позволяет получать клубни урожайностью до 22 т/га. Установлен химический состав растения (содержание белка - 3,7%, инулина - 42%, антиоксидантная активность - 117,5 мг/кг), что подтверждает ценность культуры для интродукции и использования в пищевых и лекарственных целях.

Впервые научно обоснованы условия стерилизации эксплантов анолитом и баланс гормонального состава питательных сред для разных этапов культивирования якона в условиях in vitro. Установлено, что реализация тотипотентности клеток якона в культуре тканей сопровождается регуляцией процессов, определяющих морфогенез путём прямой регенерации или через каллусогенез с последующим органогенезом. Данные исследования имеют теоретическое и прикладное значение при целенаправленном индуцировании изменчивости растений и ускоренном размножении в неограниченном количестве материала в селекционных целях.

Установлен оптимальный состав питательной среды и концентрация колхицина для получения микроклонов якона с повышенной плоидностью и жизнеспособностью. На основе этого разработан оригинальный метод получения растений с изменённым набором хромосом и новыми морфологическими признаками.

Показано, что наиболее эффективным способом индукции сомаклональной изменчивости якона in vitro является регенерация через каллусогенез с частотой побегообразования свыше 80%. На основании данного подхода разработан метод получения сомаклональных вариантов якона.

Практическая значимость результатов исследований. Выявленные биоморфологические и биохимические особенности якона можно широко использовать в селекционной работе для проведения оценки и отборов новых форм.

Разработанные параметры состава питательной среды позволяют ускоренно размножать ценный исходный материал, свободный от бактериальных и грибных заболеваний.

Разработанный метод полиплоидии путём колхицинирования якона в культуре ткани позволил получить 4 полиплоидных линии, которые можно использовать в селекционной работе.

Методом получения из каллусных культур сомаклональных вариантов создано 5 линий якона, представляющих практический интерес для селекции.

Выявленные оптимальные концентрации удобрений и регуляторов роста можно использовать для повышения урожайности якона при выращивании в полевых условиях по однолетнему циклу.

Полученные патенты (№ 2345543, 2007; № 2358447, 2007) предназначены для производства пищевых продуктов диетического и лечебного направления.

Разработанные методические подходы могут быть использованы в селекционной работе с яконом, а также в учебных программах по биологии, биотехнологии и селекции в высших и средних учебных заведениях.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на Межрегиональной научно-практической конференции «Вклад молодых учёных в решение проблем аграрной науки» (Воронеж, 2005), I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), Межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных «Достижения молодых учёных - будущее в развитии АПК» (Воронеж, 2007), VIII Международной научно-практической конференции «Интродукция нетрадиционных и редких растений» (Мичуринск, 2008), IX Молодёжной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2009), Всероссийской научно-практической конференции «Инновационные технологии и технические средства для АПК» (Воронеж, 2009), VIII Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва, 2009) и на заседаниях Учёного Совета ГНУ ВНИИСС (Рамонь, 2004 - 2009).

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Положения, выносимые на защиту.

1. Биоморфологические особенности якона, позволившие выявить биологический потенциал и адаптивные свойства культуры при интродукции в ЦЧР.

2. Установленные параметры стерилизации апикальной и пазушной меристемы и гормональный баланс питательной среды являются основой для индукции морфогенеза, сохранения и быстрого размножения ценного исходного материала.

3. Использование полиплоидии в условиях in vitro обеспечивает получение растений якона с изменённым генотипом в качестве исходных форм для селекции.

4. Способ получения сомаклональных вариантов якона, позволяющий индуцировать сомаклональную изменчивость, приводит к разнообразию исходного материала.

Личный вклад автора. Автор принимал личное участие в формулировании проблемы, постановке цели и задач, планировании и выполнении экспериментов. Автор участвовал в выполнении всех анализов, в обобщении и интерпретации результатов, в написании научных публикаций.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 143 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 5 глав, основных выводов, практических рекомендаций и библиографического списка, включающего 149 наименований, в том числе 30 на иностранных языках. Работа содержит 21 таблицу и 65 рисунков, включая фотоснимки и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Исследования проводились во Всероссийском научно-исследовательском институте сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова в 2004 - 2009 гг. в рамках Республиканской программы «Сахароносные растения и сахар» в соответствии с темой № 01.05 «Изучить биологические особенности новых и нетрадиционных сахароносных растений и выявить перспективы их интродукции».

Исходный материал в виде корневищ якона вида Polymnia sonchifolia был получен из НТИМИ г. Москвы.

Климат района, где проводились полевые исследования, умеренно-континентальный с неустойчивым увлажнением. Годы исследований характеризовались разной обеспеченностью теплом и влагой. Период выращивания якона в поле в 2006 г. был достаточно увлажнённым (ГТК=1,1), в 2008 г. - засушливым (ГТК=0,7).

Опыты проводились на чернозёме выщелоченном, малогумусном, среднемощном, тяжелосуглинистом на тяжёлом карбонатном суглинке.

Якон высаживали 1 июня по схеме 7070 см. Повторность опытов трехкратная, учётная площадь делянки 5,6 м². Размещение вариантов - систематическое.

Удобрения N₅₀P₅₀K₅₀ и N₁₀₀P₁₀₀K₁₀₀ вносились осенью под вспашку. Обработка ретардантом 577 и бензихолом проводилась в концентрациях 0,05 и 0,005 мл/л. Морфологические показатели измеряли каждые 15 дней. Определение высоты растений проводили по Моисейченко В.Ф. (1996). Площадь листовой пластинки определяли по методике Еникеева Е.И. (1967).

Для изучения химического состава якона воздушно-сухие листья и клубни были подвергнуты скринингу на содержание следующих соединений: 1) белки и аминокислоты (биуретовая и нингидриновая реакция); 2) редуцирующие сахара (реакция Троммера, реакция с метиленовой синью); 3) крахмал (йодная реакция); 4) лактоны (реакция с гидрооксидом натрия); 5) сапонины (реакция на пенообразование); 6) алкалоиды (реакция с фосфорномолибденовой кислотой). Реакции для выявления сахаров (реакция Молиша) и лигнина (флороглюциновая реакция) проводили на свежих срезах листьев и клубней. Массовую долю сухих веществ определяли рефрактометрическим методом (ГОСТ 28561 - 90). Определение содержания инулина проводили по методу Бертрана (ГОСТ 3628 - 78). Количество общего белка определяли по Лоури (Землянухин, 1985). Анализ экстракта из клубней якона на содержание аминокислот (МВИ 224.13.09.207/2003 от 10.10.2003) и витаминов проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе «Капель-105». Для определения АОА экстракта из клубней использовали прибор Яуза-ААА-01 (Методика выполнения измерений содержания антиоксидантов, 2004).

В качестве эксплантов брали апикальные и пазушные почки, фрагменты стебля и листа якона. В культуру было введено более 210 эксплантов. Стерилизацию осуществляли по схеме (табл. 1).

Таблица 1 - Схема опыта

№ варианта	Условия стерилизации
1	Хлорамин «Б», 20 мин.
2	Хлорамин «Б», 30 мин.
3	Анолит, 45 мин.
4	Анолит, 60 мин.

В опытах применяли общепринятую технику стерилизации и приготовления питательных сред (Бутенко, 1964, 1999). Для культивирования эксплантов использовали питательные среды Гамборга (В5) (Gamborg, Eveling, 1968) и Мурасиге-Скуга (MS) (Murashige, Skoog, 1962), дополненные витаминами по Уайту (White, 1963), 100 мг/л мезоинозита, 20 г/л сахарозы. рН рабочей среды поддерживали в пределах 5,8-6,0. Для индукции образования адвентивных побегов в питательную среду добавляли гормоны: 6-БАП, гиббереллин, кинетин в различных сочетаниях и концентрациях (0,1-0,9 мг/л). В качестве контроля использовали безгормональную питательную среду.

Для увеличения длительности беспересадочного культивирования якона в культуре in vitro использовали концентрации агара от 7,5 до 16 г/л. Режим депонирования длился 7 месяцев. Оценку состояния микроклонов проводили ежемесячно.

Индукция каллусообразования и пролиферации побегов достигалась добавлением гормонов: 6-БАП, гиббереллина, кинетина, б-НУК, ИУК, ИМК, 2,4Д в различных сочетаниях и концентрациях (0,01 - 4 мг/л).

Культивирование микроклонов проводили при температуре 23-26°С, влажности воздуха 70%, 16-ти часовом фотопериоде, освещённости 5000 люкс и в темноте.

Укоренившиеся растения переводили в различные сроки в закрытый грунт в смесь песка и почвы в соотношении 1:1. Для создания условий повышенной влажности применяли укрытие полиэтиленовой плёнкой.

Для получения растений с изменённой плоидностью микроклоны якона помещали на питательную среду В5 с добавлением раствора колхицина в концентрациях 0,05; 0,01; 0,005; 0,001%. Экспозиция составила 48 и 72 часа в темновых условиях. Затем растения пересаживали на среды без колхицина, выносили на свет, культивировали и переводили в закрытый грунт по разработанной методике.

Определение уровня плоидности производили методом подсчёта числа хромосом в точках роста (Паушева, 1970), а также путём определения содержания ядерной ДНК в делящихся клетках на анализаторе плоидности фирмы Partec.

Цитологические препараты просматривали на микроскопе Ienaval и бинокулярной лупе МБС-2. Фотографирование препаратов и объектов изучения осуществляли с помощью фотоаппарата Sony Cyber-shot DSC-W35/W55, микроскопа Ienaval окуляр GF-PW 10^х25, объектив - 40^х0,65, HI 100^х/ 1,25/ 0,17-А и бинокулярной лупы МБС-2 окуляр 8^х, объектив 4.

Статистическую обработку проводили по методике Доспехова Б.А. (1985) с использованием приложений Microsoft Excel.

БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЯКОНА ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ В ЦЧР

Особенности роста и развития якона в полевых условиях

Важной частью интродукции, обеспечивающую дальнейшую селекционную работу с любой культурой, является выявление биологического потенциала растений, впервые выращиваемых в новом регионе.

В результате исследований биоморфологических особенностей якона при выращивании в открытом грунте ЦЧР было установлено, что растения достигают в высоту в среднем 77,1 см. Стебель прямостоячий, имеется главный побег диаметром 16 мм, побеги первого и второго порядка. Побеги якона имеют метамерное строение, характерное для всех цветковых растений. Имеется группа укороченных междоузлий у основания, их длина постепенно возрастает от 1 см до 8,5 см и потом уменьшается по направлению к вершине побега до 1 см.

У якона отмечается супротивное листорасположение. Край листовой пластинки неравномерно зубчатый. Форма листа преимущественно копьевидная. Площадь листьев изменяется в зависимости от расположения на побеге: сначала возрастает от 49,6 см² до 157,6 см², а затем уменьшается до 3,9 см² при продвижении от основания к вершине. Поэтому можно сказать, что для якона характерно мезотонное изменение размеров метамеров на основном побеге. Основные конституционные элементы - междоузлия и листья - сначала увеличиваются до определённого максимума, а затем уменьшаются, что соответствует общим закономерностям изменения метамеров растений.

За годы исследований бутонизация и цветение не наблюдались.

У основания главного побега якона образуется корневище с неровной поверхностью и множеством почек возобновления. Корневище весит в среднем 0,35 кг, диаметр его равен 6 - 8 см. От него отходят корневые клубни, выполняющие запасающую функцию, в количестве до 19 штук массой в среднем 700 г с одного куста. Клубни чаще имеют форму веретеновидную, округлую и грушевидную.

Исследования показали, что адаптационные свойства якона зависят от погодных условий. Так, в 2006 году, когда ГТК за вегетационный период составил 1,1, растения были выше на 29,1 см, имели большие размеры листа, междоузлий, массу клубней больше на 550 г по сравнению с растениями 2008 года, когда ГТК был равен 0,7. Изменения ГТК влияли и на изменение динамики роста основного побега якона. S-образная кривая роста якона при низких ГТК имела более плавный вид и меньшие размеры по сравнению с кривой при более высоких ГТК (рис.1).

Рис. 1. Динамика изменения высоты якона в зависимости от значения ГТК

Таким образом, биологические особенности якона и развитие растений подчиняются общим закономерностям изменения метамеров растений и отражают способность к вегетации без плодоношения. Адаптационная способность якона при интродукции в зоне неустойчивого увлажнения зависит от конкретных погодных условий года. Для нормального роста и развития культуры необходимо оптимальное сочетание температуры и влажности, обеспечивающие ГТК не менее 1,1.

Изменение биометрических показателей надземной и подземной части якона под влиянием регуляторов роста и удобрений

Результаты исследований по применению ретардантов с проауксиновой активностью и стесспротекторным эффектом показали, что данные вещества вызывают уменьшение высоты якона по сравнению с контролем на 1,9-6,2 см, что объясняется их антигиббереллиновой активностью. Однако масса клубней оказалась достоверно больше в варианте с использованием ретарданта 577 в концентрации 0,05 мл/л по сравнению с другими вариантами и составила 0,97 кг (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние удобрений и ретардантов на вегетативную массу якона

Вариант	Масса якона, кг	Масса надземных побегов, кг	Масса клубней, кг	Масса корневища, кг
Контроль	1,65	0,60	0,70	0,35
577 0,05 мл/л	2,45	1,00	0,97	0,48
Бензихол 0,05 мл/л	2,18	0,80	0,88	0,50
Фон N50P50K50
Контроль	2,22	1,01	0,83	0,38
577 0,05 мл/л	2,55	1,01	1,06	0,47
Бензихол 0,05 мл/л	2,10	1,02	0,73	0,34
Фон N100P100K100
Контроль	1,86	0,99	0,61	0,26
577 0,05 мл/л	1,54	0,73	0,56	0,24
Бензихол 0,05 мл/л	1,62	0,85	0,47	0,29
НСР05	0,08	0,06	0,07	0,04

При выявлении влияния удобрений на рост и развитие якона было установлено, что применение N₅₀P₅₀K₅₀ вызывает увеличение всех показателей, в частности массы клубней до 0,83 кг, в то время как на контроле - 0,7 кг, а при использовании N₁₀₀P₁₀₀K₁₀₀ гораздо меньше - 0,61 кг.

Комплексное применение удобрений и ростовых веществ показало, что наиболее эффективным является использование низких доз удобрений N₅₀P₅₀K₅₀ совместно с ретардантом 577 в концентрации 0,05 мл/л. При этом увеличиваются практически все показатели продуктивности якона: зелёная масса на 41%, масса клубней - на 34%.

Биохимическая характеристика якона

Изучение биохимического состава растений позволяет выявить ценные пищевые и лекарственные свойства, ради которых культуру интродуцируют в новом регионе. В результате скрининга в клубнях и листьях якона помимо инулина, белков и аминокислот были обнаружены редуцирующие сахара, крахмал, лигнин, сапонины и лактоны. Установлено отсутствие алкалоидов.

Выявлено, что клубни якона содержат 83,4% воды и 16,6% сухих веществ, которые включают клетчатку, жир, золу, белок и сахара.

Содержание белка в клубнях якона, выращенного в ЦЧР, составило 3,7% в пересчёте на сухой вес, в листьях - 10,1%. В клубнях выявлено содержание практически всех аминокислот, включая незаменимые. Наиболее высоко содержание пролина (0,44%) и аргинина (0,43%). Количество инулина в корневых клубнях в среднем составило 42% и зависело от условий выращивания.

Было установлено, что экстракт из клубней якона обладает антиоксидантной активностью, которая составляет 117,5 мг/кг.

Таким образом, выявленные биохимические свойства характеризуют якон как источник инулинсодержащего сырья, обладающего полезными свойствами, что делает его ценным объектом для интродукции и для использования в пищевой промышленности. Это нашло подтверждение при разработке вкусоформирующей добавки-подсластителя совместно с Воронежской государственной технологической академией, что подтверждено патентами (Патент № 2345543, 2007; № 2358447, 2007).

ИНДУКЦИЯ ПОЛИПЛОИДИИ ЯКОНА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Важным направлением при интродукции якона является селекционная работа, направленная на создание сортов, адаптированных к новым условиям существования. Одним из перспективных методов, который можно применить в селекции якона является полиплоидия в культуре in vitro, что позволит улучшить существующие и создать новые более совершенные формы растений.

Влияние стерилизации и состава питательной среды на прямую регенерацию побегов якона

Первым и важным этапом при полиплоидизации якона in vitro явилась разработка режима стерилизации и гормонального состава питательной среды. Результаты сравнения действия различных стерилизующих агентов показали, что обработка анолитом в течение 60 минут обеспечивала 100% стерильность всех типов вводимых эксплантов (вариант 4) (рис. 2).

НСР₀₅=8,3

Рис. 2. Инфицированность якона в зависимости от способа стерилизации и типа экспланта

Причём повреждения эксплантов были незначительны и менее всего выражены у апикальных и пазушных почек. Другие варианты стерилизации показали низкую эффективность из-за высокого числа инфицированных эксплантов и значительных повреждений тканей.

При изучении влияния гормонального состава питательной среды на микроразмножение якона было выявлено, что наибольшее число адвентивных побегов путём прямой регенерации (6,5 шт.) образовывалось при наличии в среде 0,3 мг/л 6-БАП.

В результате выявления условий для депонирования якона было установлено, что при увеличении содержания агара в питательной среде происходит снижение интенсивности роста микроклонов. Самый низкий среднемесячный прирост (26 мм) и самая высокая выживаемость (72,5%) через 6 месяцев культивирования наблюдались на среде, содержащей 10 г/л агара.

Важным этапом культивирования микроклонов якона in vitro является индуцирование адвентивных корней. Установлено, что 100%-ное корнеобразование происходит на безгормональной среде, поэтому не было необходимости в подборе питательных сред для ризогенеза у якона. Растения образовывали корни уже через 2-3 недели культивирования и были готовы к пересадке в грунт.

При создании условий повышенной влажности в первые 14 дней после высадки растений-регенерантов в закрытый грунт приживаемость составила 100%, а при пересадке растений-регенерантов без укрытия полиэтиленовой плёнкой - 62,5%.

В результате проведённых опытов были выявлены условия культивирования якона in vitro, на базе которых разработан эффективный метод микроклонального размножения якона, включающий стерилизацию ростовых почек якона анолитом; микроразмножение на среде В5, содержащей 0,3 мг/л БАП; депонирование микроклонов на среде с содержанием агара 10 г/л; культивирование и укоренение на безгормональной питательной среде; перевод микроклонов в закрытый грунт при создании условий повышенной влажности.

Колхицинирование якона в культуре ткани

При добавлении колхицина в различных концентрациях в питательную среду была выявлена устойчивость якона к его воздействию. Ни в одном из вариантов не наблюдалось 100%-ной гибели. При обработке колхицином в течение 48 часов, выживаемость якона составила 100% на всех концентрациях, кроме 0,05%. В данном варианте количество выживших растений через 2 месяца составило 58,3% (рис. 3).



Рис. 3. Выживаемость регенерантов после обработки колхицином

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Увеличение времени воздействия мутагена при повышении его концентрации вызывало угнетение микроклонов, некроз листьев, точек роста и, как следствие, гибель растений. Для стабилизации полиплоидных растений якона после колхицинирования их пересаживали на питательную среду, содержащую 0,25 мг/л кинетина.

Изучение плоидности контрольных растений якона показало, что количество хромосом составляет 2n=60. Это согласуется с данными, полученными Хейсером (1963), Г.Б. Тюкавиным (2001). Это количество соответствовало уровню ядерной ДНК при определении на анализаторе плоидности фирмы Partec (рис. 4).

Наибольшее количество полиплоидов образовалось при воздействии 0,05% раствора колхицина в течение 48 часов. В этом варианте генетические изменения произошли у 100% микроклонов (табл. 3).

Таблица 3 - Изменения плоидности якона после обработки колхицином

Концентрация колхицина, %	Экспозиция, часы	Количество растений-регенерантов с разным набором хромосом, %
		60	90	120	45	150	Миксопл.
0	48	100	0	0	0	0	0
0,001		67	8	0	0	0	25
0,005		40	0	20	40	0	0
0,01		0	0	0	40	0	60
0,05		0	25	50	0	0	25
0	72	100	0	0	0	0	0
0,001		17	25	0	0	0	58
0,005		62	0	0	0	0	38
0,01		0	0	0	0	33	67
0,05		0	0	0	0	0	100



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Остальные концентрации оказались менее эффективными. При времени экспозиции 72 часа отмечалась очень низкая выживаемость, особенно на высоких концентрациях мутагена. А большинство выживших растений были миксоплоидами.

Таким образом, для перевода якона на более высокий уровень плоидности оптимальной явилась концентрация колхицина 0,05% при времени экспозиции 48 часов. Так, при выживаемости более 58% у всех регенерантов наблюдалось изменение количественного содержания ядерной ДНК. Среди них были растения с набором хромосом 120 и 90.

Получение форм якона с изменённой плоидностью

Полученные формы якона с изменённым набором хромосом были размножены, укоренены и пересажены в грунт по разработанной методике. Наибольший интерес представляли растения с набором хромосом 90, 120 и 150. Через 4 месяца культивирования в закрытом грунте микроклоны, хромосомный набор которых увеличился до 3n, были выше контрольных растений. Листья их были крупнее и имели более выраженную зазубренность. Кроме того, уже в вазончиках наблюдалось образование клубней. В связи с этим, данная форма может быть исходным материалом в селекции якона на продуктивность.

Регенеранты с плоидностью 4n имели изменённую форму основания листа. Растения якона с плоидностью, увеличенной в 5 раз, отличались замедленным развитием. Это связано, очевидно, с тем, что увеличение плоидности для каждого вида имеет свои пределы, по достижении которых дальнейшая полиплоидизация приводит к отрицательным эффектам (Инге-Вечтомов, 1989).

По результатам исследований разработана методика получения новых форм якона с изменённой плоидностью путем колхицинирования микроклонов в условиях in vitro, включающая следующие этапы: - стерилизацию эксплантов; - микроразмножение якона; - посадку двуузловых регенерантов якона на питательную среду В5, содержащую 0,05% раствор колхицина, на 48 часов; - стабилизацию микроклонов на среде В5 с кинетином; - отбор микроклонов с изменённой плоидностью; - размножение полученных растений на ростовой среде; - укоренение микроклонов; - перевод растений-регенерантов в закрытый грунт с последующей адаптацией во влажных условиях.

Таким образом, получены растения-регенеранты якона с различным набором хромосом: 5 растений, содержащих 90 хромосом (3n); 6 растений - 120 хромосом (4n), 2 растения - 150 хромосом (5n), 3 растения - 45 хромосом. Из полученных форм сформированы линии, изучение 4-х из них будет продолжено в полевых условиях. Это позволит отобрать наиболее ценный исходный материал с повышенной урожайностью и адаптивностью для продолжения селекционной работы.

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ СОМАКЛОНОВ ЯКОНА В УСЛОВИЯХ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ

якон исходный материал

Метод культуры изолированных тканей растений in vitro даёт возможность практического использования в селекции сомаклональной изменчивости, главной потенциальной возможностью которой является создание дополнительной генетической вариабельности у агрономически полезных культур без использования гибридизации. Поэтому разработка метода получения сомаклональных вариантов якона в условиях in vitro может позволить получать новые формы этого растения с улучшенными признаками.

Влияние минерального и гормонального состава питательной среды на каллусогенез якона

Одним из факторов, от которого зависит эффективность получения сомаклонов, является состав питательной среды.

При изучении влияния минерального состава среды на каллусообразование якона отмечено достоверное превышение образования каллуса на 6 - 56% на среде MS, по сравнению с вариантами, где минеральной основой была среда В5 (табл. 4).

Таблица 4 - Влияние минерального и гормонального состава питательных сред на процесс каллусообразования якона в культуре in vitro

№ варианта	Минеральная основа	Гормоны, мг/л	Введено эксплантов, шт.	Каллусообразование
				шт.	%
1	MS	0	16	4	25
2		0,2 БАП	16	11,5	72
3		0,3 БАП	16	12	75
4		0,3БАП+1ИУК	16	16	100
5		1 БАП+4 НУК	16	16	100
6		1БАП+0,1ИУК	16	16	100
7	B5	0	16	2	12
8		0,2 БАП	16	3	19
9		0,3 БАП	16	5	31
10		0,3БАП+1ИУК	16	15	94
11		1 БАП+4 НУК	16	13	81
12		1БАП+0,1ИУК	16	10	63
НСР05	0,9	5,6

Каллусогенез составил 100% на средах 4-6, где в качестве ростовых веществ использовали БАП и ИУК или НУК, а минеральной основой служила среда Мурасиге-Скуга. Каллус обладал способностью к формированию ростовых почек, имел плотную структуру, молочную или светло-зелёную окраску. В связи с этим использовали питательную среду MS в последующих опытах.

Дальнейшее изучение влияния гормонального состава питательной среды на каллусогенез показало, что при наличии в питательной среде 2,4Д в любых концентрациях (среды 13-18, 28, 30, 33-35) у якона отмечался 100%-ный гистогенез. Каллус при этом был рыхлым, имел бежевую окраску. Наибольшая способность к образованию морфогенного каллуса (100%) и достоверные различия по сравнению с контролем наблюдались в 32 варианте (0,2 мг/л БАП и 1 мг/л НУК) (табл. 5).

Таблица 5 - Влияние гормонов в питательной среде MS на каллусогенез якона в культуре ткани

№ варианта	Гормоны, мг/л	Введ. эксп., шт.	Каллусогенез
			шт.	%
1	0	16	4	25
13	0,05 2,4Д	16	16	100
14	0,1 2,4Д	16	16	100
15	0,2 2,4Д	16	16	100
16	1 2,4Д	16	16	100
17	2 2,4Д	16	16	100
18	4 2,4Д	16	16	100
19	1 БАП	16	0	0
20	1 БАП+0,1 НУК	16	16	100
21	4 БАП+0,25 ИМК	16	16	100
22	2 БАП+0,5 ИМК	16	16	100
23	0,1 БАП+1,5 ГК	16	0	0
24	0,2 БАП+1 ГК	16	14	88
25	0,3 БАП+0,5 ГК	16	11	69
26	0,2 БАП+0,1 ИМК+1 ГК	16	15	94
27	0,3 БАП+0,1 ИМК+0,5 ГК	16	14,5	91
28	0,5 БАП+0,8 2,4Д	16	16	100
29	0,4 БАП+2 НУК	16	16	100
30	0,5 БАП+0,5 ИУК+0,5 ГК+0,1 2,4Д+1 Кн	16	16	100
31	0,3 БАП+0,01 ИУК+0,3 ГК	16	12	75
32	0,2 БАП+1 НУК	16	16	100
33	0,3 БАП+0,1 2,4Д	16	16	100
34	0,2 БАП+0,05 2,4Д	16	16	100
35	0,3 БАП+0,2 2,4Д	16	16	100
НСР05	1,1	6,6

Таким образом, оптимальными для индукции морфогенного каллуса явились среды 4, 6, 32, содержащие 6-БАП, ИУК или НУК.

Влияние условий культивирования на пути морфогенеза якона

Известно, что формирование каллусной ткани и успешная регенерация наблюдаются при культивировании эксплантов различных вегетативных органов, являющихся меристематически активными (O'Hara, Street, 1978).

В результате проведённых исследований выявлено, что наибольшую склонность к каллусогенезу проявляли стеблевые экспланты якона. Так 25% из них образовывали каллус даже на безгормональной среде, в то время как листовые экспланты при таких условиях были не способны к каллусообразованию. В дальнейшем из каллусных структур происходила регенерация побегов, которая шла активнее из каллуса стеблевых эксплантов. На среде 4, содержащей 0,3 БАП и 1,0 ИУК, 81% каллусов образовывал ростовые почки. Прямого органогенеза не наблюдалось. К прямой регенерации оказались более склонными листовые экспланты, 12,5% из которых на этой же среде формировали ростовые побеги.

На процессы морфогенеза в культуре тканей растений оказывают влияние условия освещения. Каллусогенез якона на средах 1 и 3 активнее протекал в темновых условиях, чем при 16-ти часовом фотопериоде, на 6 и 19% соответственно. На средах 4 и 6 наблюдалось 100%-ное каллусообразование при обоих типах освещения, что обусловлено ролью гормонов в питательной среде. Регенерация побегов в темновых условиях происходила достоверно в меньшей степени, чем при 16-ти часовом фотопериоде. На средах 3 и 6 к прямой регенерации растений на свету оказались способны 18,8% эксплантов. В темноте прямой регенерации не наблюдалось. На средах 6 и 4 побеги регенерацией через каллус образовывали на 9 и 25% больше эксплантов на свету, чем в темноте.

Установлено, что на гистогенез влиял только гормональный состав среды. Образование неморфогенного каллуса происходило в равной степени, как на свету, так и в темноте и не зависело от типа экспланта.

В результате исследований выявлен ещё один путь морфогенеза якона - ризогенез. Причём, стеблевые экспланты оказались более склонны к ризогенезу in vitro, который активно протекал на безгормональной среде. Интенсивное 100%-ное корнеобразование у дедифференцированных клеток стеблевых эксплантов якона происходило на среде, содержащей 0,05 мг/л 2,4Д.

Таким образом, как показали наши исследования, морфогенез якона in vitro осуществляется различными путями в зависимости от условий культивирования. Воспроизведение растений идёт путём прямой регенерации и через каллусогенез. Тотипотентность клеток каллуса различна, что определяет пути морфогенеза через гистогенез, ризогенез и геммогенез. Морфогенез якона зависит не только от состава питательной среды, но и от типа экспланта, а также от условий освещения. Оптимальным для регенерации побегов из каллусных структур якона в культуре ткани явилось использование стеблевых эксплантов при 16-ти часовом фотопериоде.

Регенерация сомаклонов якона

В процессе культивирования стеблевых эксплантов якона выявлено, что реакция их клеток неоднозначна на состав питательной среды. Среда 4 оказалась самой благоприятной по составу для образования побегов из каллусных клеток. Здесь 81% новообразований был способен к регенерации (рис. 7).

Рис. 7. Влияние гормонального состава питательной среды на регенерационную способность эксплантов якона

Из этого можно заключить, что низкие концентрации БАП (цитокинина) и высокие ИУК (ауксина) способствовали как активному каллусообразованию у эксплантов якона, так и высокой регенерации побегов из полученных новообразований. Самое большое количество побегов из каллуса (11 шт.) образовывалось на 4 среде (рис. 8).



НСР₀₅=2,2

Рис. 8. Количество побегов на морфогенном каллусе в зависимости от состава питательной среды

В дальнейшем после перенесения морфогенного каллуса с данной среды на среду В5, содержащую 0,3 мг/л БАП, наблюдалось усиление регенерации побегов. В результате с одной каллусной структуры удавалось получать до 20 растений. Полученные сомаклональные варианты якона отличались от исходной формы: были растения с мутовчатым листорасположением (по три листа в каждом междоузлии), с очерёдным листорасположением, с листьями, крупнее обычных. Проверка на анализаторе плоидности показала изменение количества ядерной ДНК у большинства сомаклонов, что свидетельствует о произошедших генетических изменениях. Полученные сомаклональные варианты с изменёнными признаками были размножены и переведены в закрытый грунт. Из них сформировано 5 линий, обеспечивающих разнообразие исходного материала для проведения селекционной работы по созданию форм якона с новыми признаками.

Таким образом, в результате исследований выявлены оптимальные условия для индукции каллусогенеза с последующим органогенезом, что позволило разработать методику для получения микроклонов якона с сомаклональной изменчивостью в условиях культуры in vitro, включающую в себя следующие положения: - использование в качестве эксплантов частей стебля якона с насечками; - культивирование эксплантов в условиях in vitro при 16-ти часовом фотопериоде; - использование питательной среды Мурасиге-Скуга, содержащей 0,3 мг/л БАП и 1 мг/л ИУК для образования морфогенного каллуса и регенерации из него побегов; - последующие пересадки каллуса для дальнейшего получения побегов на среды В5 с 0,3 мг/л БАП; - микроразмножение, укоренение и перевод в закрытый грунт полученных сомаклонов по отработанным методикам для якона.



ВЫВОДЫ

1. Биологические особенности и адаптивные свойства якона при выращивании в ЦЧР позволяют получать клубни урожайностью до 22 т/га с содержанием инулина 42 %. В климатических условиях ЦЧР растения развиваются без плодоношения, поэтому выращивание якона осуществляется рассадным методом по однолетнему циклу.

2. Изменение структурной организации побега в процессе роста подчиняется общим закономерностям изменения метамеров растений, при этом размеры основных конституционных элементов - междоузлий и листьев - сначала увеличиваются до определённого значения, а затем уменьшаются при продвижении от основания к вершине.

3. Показано, что адаптационная способность якона при интродукции в зоне неустойчивого увлажнения зависит от конкретных погодных условий года. Для нормального развития культуры необходимо оптимальное сочетание температуры и влажности, обеспечивающие ГТК не менее 1,1. Снижение ГТК до 0,7 уменьшает все биометрические показатели растений, в том числе высоту на 38%, массу клубней на 78%.

4. Установлено, что обработка рассады якона раствором ретарданта 577 в концентрации 0,05 мл/л с одновременным внесением минеральных удобрений N₅₀P₅₀K₅₀ оказывает положительное влияние на ростовые процессы, повышая урожайность зелёной массы на 41%, клубней на 34%.

5. Получены новые данные, касающиеся биохимического состава якона, выращенного в ЦЧР. Корневые клубни содержат 3,7% белка, в листьях белка значительно больше - 10,1%. Запасающие органы якона содержат богатый набор аминокислот, включающий незаменимые. Наиболее высоко содержание пролина (0,44%) и аргинина (0,43%). В клубнях содержится в среднем 42% инулина. Экстракт из клубней обладает антиоксидантной активностью, равной 117,5 мг/кг. Всё это подтверждает существующие представления о яконе как о ценной пищевой и кормовой культуре.

6. Разработан эффективный метод микроклонального размножения якона, основанный на прямой регенерации побегов, лимитирующими факторами которого являются: 100%-ная стерилизация эксплантов анолитом; использование питательной среды В5, содержащей 0,3 мг/л БАП; длительное сохранение и укоренение растений. Данный метод позволяет ускоренно размножать селекционный материал в количестве до 10⁶ микроклонов в год.

7. Разработан метод получения полиплоидных форм якона, включающий введение в культуру in vitro эксплантов, микроразмножение растений, культивирование микроклонов на питательной среде с добавлением 0,05% раствора колхицина в течение 48 часов, проведение отбора по количеству хромосом, размножение, укоренение и перевод в закрытый грунт полученных полиплоидов. Метод позволяет получать 100% растений с изменённым генотипом (3n, 4n) в качестве исходных форм для селекции.

8. Разработан метод получения сомаклональных вариантов якона в культуре in vitro, который заключается в каллусообразовании с последующей регенерацией побегов у стеблевых эксплантов на питательной среде MS с добавлением 0,3 мг/л 6-БАП и 1 мг/л ИУК при 16-ти часовом фотопериоде, пересадку на среду В5 с 0,3 мг/л 6-БАП, черенкование, размножение, укоренение и перевод в грунт полученных сомаклонов.

9. Выявлены пути морфогенеза якона, основанные на реализации тотипотентности соматических клеток. Гормональный состав питательных сред регулирует ростовые процессы и определяет направления развития в условиях in vitro. Воспроизведение растений идёт путём прямой регенерации побегов и через каллусогенез, в котором реализация морфогенеза происходит по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней.

Практические рекомендации

1. Разработанный метод микроклонального размножения якона рекомендуется для получения неограниченного количества микроклонов, идентичных растениям-донорам и длительного сохранения ценного селекционного материала в чистоте.

2. Разработанный метод получения полиплоидов в культуре in vitro рекомендуется применять в селекционной практике для получения полиплоидных форм в качестве исходного материала.

3. Разработанный метод индуцирования сомаклональной изменчивости следует использовать в селекционной работе при создании новых форм с изменёнными признаками.

4. В условиях открытого грунта ЦЧР рекомендуется выращивание якона по однолетнему циклу с использованием обработки рассады ретардантом 577 в концентрации 0,05 мл/л на фоне удобрений N₅₀P₅₀K₅₀.



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колесникова Е.О. Клональное микроразмножение якона in vitro / Е.О. Колесникова // Вклад молодых учёных в решение проблем аграрной науки: Материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных. - Воронеж: ФГОУ ВПО ВГАУ, 2005. - Ч.II. - С. 37-38.

2. Колесникова Е.О. Влияние физиологически активных веществ на клубнеобразование якона / Е.О. Колесникова // Материалы IX Международной научной конференции молодых ботаников. - С.-Пб., 2006. - С. 158.

3. Колесникова Е.О. Клубнеобразование якона под действием физиологически активных веществ / Е.О. Колесникова // Достижения молодых учёных - будущее в развитии АПК: Материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных. - Воронеж: ФГОУ ВПО ВГАУ, 2007. - Ч.II. - С. 33 - 35.

4. Колесникова Е.О. Биолого-морфологические особенности якона при выращивании в ЦЧР / Е.О. Колесникова, Т.П. Жужжалова, П.Р. Покхрел // Интродукция нетрадиционных и редких растений: Материалы VIII Международной научно-методической конференции. - Мичуринск: Изд-во Мичуринского госагроуниверситета, 2008. - Т.II. - С. 58 - 61.

5. Коренман Я.И., Экстрагирование физиологически ценных компонентов натурального подсластителя якона / Я.И. Коренман, Е.С. Рудниченко, Е.И. Мельникова, С.И. Нифталиев, М.О. Ширунов, Е.О. Колесникова // Химическая технология. - 2008. - Т. 9. - № 12. - С. 626 - 627.

6. Колесникова Е.О. Влияние минеральных удобрений и ростовых веществ на рост и клубнеобразование якона / Е.О. Колесникова, Т.П. Жужжалова // Сахарная свёкла. - № 10. - 2008. С. 23 - 25.

7. Колесникова Е.О. Использование методов биотехнологии в селекции интродуцируемого растения якона (Polymnia sonchifolia) / Е.О. Колесникова // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Материалы IX молодёжной научной конференции. - М., 2009. - С. 16 - 17.

8. Жужжалова Т.П. Характеристика якона (Polymnia sonchifolia) как источника ценных веществ для производства натуральных подсластителей / Т.П. Жужжалова, Е.О. Колесникова, Е.С. Рудниченко, Е.В. Богданова // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: Материалы VIII международного симпозиума. - М., 2009. - Т. I. - С. 151 - 152.

9. Колесникова Е.О. Каллусообразование и получение сомаклональных вариантов якона (Polymnia sonchifolia) в культуре in vitro / Е.О. Колесникова // Инновационные технологии и технические средства для АПК: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Ч.II. - Воронеж: ФГОУ ВПО ВГАУ, 2009. - С. 95 - 97.

10. Мельникова Е.И. Применение углеводного комплекса якона (Polymnia Sonchifolia Poepp. & Endl.) в производстве подсластителей / Е.И. Мельникова, Е.В. Богданова, Е.С. Рудниченко, Я.И. Коренман, Е.О. Колесникова // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: Материалы VIII международного симпозиума. - М., 2009. - Т. III. - С. 379 - 382.

11. Мельникова Е.И. Якон - перспективный подсластитель натурального происхождения / Е.И. Мельникова, Е.В. Богданова, Е.О. Колесникова // Воронежский агровестник. - № 7. - 2009. - С. 46 - 47.

12. Колесникова Е.О. Индуцирование генетической изменчивости и особенности морфогенеза якона (Polymnia sonchifolia Poepp. & Endl.) в культуре in vitro / Е.О. Колесникова, Т.П. Жужжалова // Сахарная свёкла. - № 8. - 2009. - С. 18 - 20.

Размещено на Allbest.ru