Биологические особенности сибирской популяции Phoma exiqua var. foveata и совершенствование системы защиты картофеля от фомоза

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Специальность: 06.01.11 - защита растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Биологические особенности сибирской популяции Phoma exiqua var. foveata и совершенствование системы защиты картофеля от фомоза

Заверткина И.В.

Кинель - 2007

Работа выполнена на кафедре фитопатологии Новосибирского государственного аграрного университета

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Шалдяева Елена Михайловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Сидоров Александр Аркадьевич Самарский экономический университет кандидат биологических наук, доцент Макеева Антонина Михайловна Самарская ГСХА

Ведущее учреждение: Саратовский государственный аграрный университет

Защита состоится «23» октября 2007г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.220.058.01 при Самарской государственной сельскохозяйственной академиипо адресу: 446442, Самарская область, г. Кинель, п.Усть-Кинельский , ул. Учебная,1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Самарской государственной сельскохозяйственной академии.

Автореферат разослан «21 » октября 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета Г.К. Марковская

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Фомозная гниль - широко распространенное заболевание картофеля как за рубежом, так и в России. Потери клубней от фомоза в период хранения составляют от 15 до 30%, а в отдельные годы - до 80% (Попов, 1978, Дорожкин, Бельская, 1979). Причем, в большинстве европейских стран значительное распространение имеет форма Phomа exiqua var. foveata, в то время как на территории Российской Федерации в прошедшие десятилетия доминирующее положение занимала Phoma exiqua var. exiqua (Арсеньева, 1962).

Обследование картофелеводческих хозяйств Новосибирской и Кемеровской областей 1986-1989гг. показало, что наряду с распространенной разновидностью Phoma exiqua var. exiqua, встречается также и var. foveata, составляя 20% популяции возбудителя (Малюга, Коняева, 1990; Малюга, 1992; 1993).

Короткий вегетационный период, низкая биологическая активность почв Западной и Восточной Сибири, уборка незрелого картофеля с большим количеством механических повреждений способствуют заражению клубней и обусловливают длительную выживаемость и активность почвенных патогенов (возбудителей сухой фузариозной и фомозной гнилей).

Недостаточная изученность тактик выживания и трофических связей Phoma exiqua var. foveata, а также способов снижения патогенности возбудителя фомоза послужили основанием для проведения настоящей работы.

Цель исследований: совершенствование системы защиты картофеля от фомоза на основе изучения особенностей жизненного цикла возбудителя Phoma exiqua var. foveata и индуцирования устойчивости растений.

Для достижения этой цели требовалось решение следующих задач:

Изучить биологические особенности гриба Phoma exiqua var. foveata (стратегию жизненного цикла, тактики трофических связей и выживания, а также динамику накопления и основной химический состав токсических метаболитов гриба).

Определить степень влияния микроэлементов на возбудителя фомозной гнили, элементы структуры урожая и формирование барьеров устойчивости картофеля.

Оценить эффективность осенней обработки клубней дымовым фунгицидом Вист в снижении развития фомоза.

Научная новизна. Установлено преобладание формы Phoma exiqua var. foveata на территории Западной Сибири, изучены и описаны основные биологические особенности изолятов. Экспериментально доказана возможность заражения и формирования спороношения Phomа exiqua var. foveata на растениях семейств: капустовые (Brassicaceae), бобовые (Fabaceae), тыквенные (Cucurbitaceae), пасленовые (Solanaceae).

Впервые предложена методика накопления и выделения токсических метаболитов патогена и установлен химический состав основных компонентов суммарного токсина. Предложен механизм инактивации токсинов возбудителя микроэлементами, основанный на образовании неактивных соединений с меньшей степенью токсичности. Показан многофункциональный характер действия микроэлементов на возбудителя фомозной гнили и формирование барьеров устойчивости растений картофеля.

Основные положения, выносимые на защиту

Жизненный цикл возбудителя фомоза направлен на выживание и расширение трофических связей (К-стратег) с одновременным усилением токсических и патогенных свойств;

Эффективность и механизмы повышения устойчивости картофеля к фомозу микроэлементами обусловлены инактивацией токсических метаболитов патогена и стимуляцией защитных реакций растений;

Дымовой фунгицид Вист в норме 10 г/т эффективно подавляет фомозную и смешанную фомозно-фузариозную гнили.

Совершенствование системы защиты картофеля от фомоза с учетом особенностей биологии патогена.

Практическая ценность работы. Описанные симптомы фомозной гнили, вызываемой Phoma exiqua var. foveata позволяют проводить более точную диагностику патогена. Детальное изучение компонентов суммарного токсина возбудителя фомоза облегчает разработку эффективных приемов защиты от данного заболевания, включая направленный синтез фунгицидов и отбор устойчивых форм картофеля. Применение микроэлементов в технологии возделывания культуры повышает устойчивость картофеля к фомозной гнили за счет увеличения толщины перидермы клубней. Показана эффективность осенней обработки картофеля дымовым фунгицидом Вист в борьбе с сухими гнилями картофеля.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука ХХI века» (Пущино, 2003), конференциях молодых ученых Сибирского федерального округа «Аграрная наука России в новом тысячелетии» (Омск:, 2003), «Научное обеспечение устойчивого развития АПК в Сибири» (Улан-Удэ, 2004), «Инновационное развитие аграрного производства в Сибири» (Кемерово, 2005), на втором всероссийском съезде по защите растений «Фитосанитарное оздоровление экосистем» (Санкт-Петербург, 2005), на Сибирской ярмарке «Дни урожая - 2004».

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе в журналах «АГРО ХХI» и «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки».

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 114 страницах, состоит из введения, 5 глав, выводов, предложений производству, списка литературы, включающего 192 наименования (из них 43 иностранных). Работа иллюстрирована 19 таблицами, 17 рисунками.

Объекты, условия и методы проведения исследований. В период проведения полевых наблюдений 1997-1999, 2002-2004 гг. метеорологические факторы учитывались по данным метеостанции Огурцово г. Новосибирска. Среднемесячные температуры вегетационных периодов в годы проведения полевых исследований практически приравнивались к среднемноголетним показателям. Количество осадков резко отличалось по годам. Вегетационные периоды 1999 и 2003 гг. были засушливыми, в другие годы отмечалось достаточное и повышенное увлажнение, особенно в июне 2002 и июле 2004 гг.

Закладку полевых опытов проводили в учебном хозяйстве «Тулинское» Новосибирской области, где почвенный покров представлен черноземом выщелоченным.

По данным центра агрохимической службы «Новосибирский» содержание микроэлементов в годы исследований в период посадки было в среднем: Cu - 7,8мг/кг, Mn - 8,5мг/кг, Zn - 0,48мг/кг, В - 2,7мг/кг.

Объектами наших исследований были фомоз картофеля и сибирская популяция гриба Phoma exiqua var. foveata. Растительным объектом служил районированный сорт картофеля Невский.

Выделение и описание морфолого-культуральных признаков изолятов Phoma exiqua var. foveata проводили по общепринятым методикам (Методы экспериментальной микологии, 1982). Разделение на формы exiqua и foveata осуществляли при помощи стандартного NaOH-теста (Logan, Khan, 1969; Boerema, 1976). Для описания симптомов гнили и оценки патогенных свойств использовали искусственное заражение с расчетом индекса Попова (Попов, 1987). Определение круга растений-хозяев возбудителя фомоза проводили путем искусственной инокуляции растений овощного севооборота: картофеля, редиса, томата, капусты, огурца, бобов (Редькина, 1978).

Фитотоксическую активность штаммов и токсических метаболитов оценивали по методике Берестецкого (Методы экспериментальной микологии…, 1973, 1982) Обнаружение и идентификацию токсических метаболитов проводили на базе института химической кинетики и горения СО РАН, Новосибирского института органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН с использованием тонкослойной хроматографии и хромато-масс-спектрометрического метода (Основы аналитической химии, 1999). Извлечение токсических метаболитов проводили путем экстракции органическими растворителями (Методические рекомендации…, 1990). Образцы анализировали методом газовой хромато-масс-спектрометрии на приборе "Hewlett-Packard', включающем газовый хроматограф НР 5890 серии II и масс-селективный детектор НР 5971 (ЭУ, 70 эв). Капиллярная колонка НР 5 MS (5%)-дифенил-(95%)-диметилсилоксан: 30 м0,25 мм0,25 мкм, газ-носитель - гелий, 1 мл/мин.

Мощность перидермы оценивали путем окраски срезов спиртовым раствором судана III (Саломахина, 1978).

Изучение аккумуляции и распределения микроэлементов в клубнях картофеля проводили методом инверсионной вольтамперметрии на комплексе "ТЭМОС-ЭКСПРЕСС" ТЭ-1 с использованием ртутно-пленочных игольчатых электродов при перемешивании раствора и постоянном потенциале (-1,4В). Для анализа использовался анализатор ТА-2 (ООО «Техноаналит») и трехмодульный пакет программ «VALab».

Повышение устойчивости картофеля к фомозной гнили путем интенсификации раневых реакций под действием микроэлементов оценивали методом инокуляции клубней суспензией спор Phoma exiqua var. foveata (7,8 х 106 спор в 1 мм3) при нанесении механических повреждений (Соломахина, 1978; Редькина, 1978; Филина, 1978).

Полевой опыт по изучению влияния обработок картофеля микроэлементами закладывали в учхозе "Тулинское". Схема включала обработку клубней растворами солей микроэлементов (0,2%) и совместную обработку клубней (0,2%) и ботвы (0,02%). Повторность 4-х кратная; площадь делянки 10,5м2. В опыте определяли количественные показатели элементов структуры урожая и урожайность культуры (Методика исследований по культуре картофеля…, 1967);

Влияние осенней обработки дымовым фунгицидом Вист (в норме 10 г/т) на развитие фомозной гнили в период хранения оценивали в производственных экспериментах в хозяйствах Новосибирской, Кемеровской областей и Алтайского края общим объемом более 3 тысяч тонн на сортах картофеля Невский, Романо, Луговской.

Математическую обработку данных проводили по руководству, составленному Б.А. Доспеховым (1985), также использовали программу СНЕДЕКОР (Сорокин, 2004).

Автор выражает глубокую благодарность кандидату химических наук Маринкиной Галине Александровне за методическую и практическую помощь.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Биологические особенности сибирской популяции гриба

Phoma exiqua var. foveata

Морфолого-культуральные и патогенные свойства Phoma exiqua var. foveata. Изучены и описаны морфолого-культуральные свойства изолятов формы Phoma exiqua var. foveata на различных питательных средах с разделением на 5 групп, имеющих схожие признаки (окраска и характер роста мицелия, пигментация среды, формирование пикнид).

По результатам сравнительного изучения интенсивности ростовых процессов и пикнидообразования Phoma exiqua var. foveata для культивирования изолятов рекомендуются следующие питательные среды: картофельно-декстрозный бульон - для массового получения пикнид за короткий период времени; картофельно-декстрозный агар - для длительного инкубирования гриба; 2% сусло-агар - для быстрого получения биомассы возбудителя при отсутствии спороношения.

Доказано преобладание разновидности Phoma exiqua var. foveata на территории Западной Сибири, составляющей более 60% популяции и подтверждена высокая степень патогенности данной формы. Все выделенные изоляты были отнесены к сильнопатогенным с индексом Попова более 15. В пределах группы нами были выделены 3 подгруппы, существенно отличающиеся уровнем патогенности и размерами язв на 10-12% (табл. 1).

Таблица 1 - Патогенность штаммов Phoma exiqua var. foveata

Подгруппа	Индекс Попова	Глубина язвы по отноше- нию к размеру клубня, %	Диаметр язвы по отноше- нию к размеру клубня, %
1	15-17	73,3-93,4	65,5-74,4
2	18-25	83,5-95,4	77,4-91,9
3	>25	95,7	93,7
НСР05		13,952	12,955

В ходе проведенных исследований нами впервые показана способность var. foveata формировать 4 типа поражения клубней картофеля: поверхностный некроз, округлые язвы, клиновидные язвы, «глазковую» форму, с преобладанием последней, что также свидетельствует о повышении уровня патогенности популяции. В связи с этим, для точной диагностики фомозной гнили требуется выделение возбудителя и его идентификация при помощи NaOH - теста.

Специализация возбудителя Phoma exiqua var. foveata. Впервые было установлено, что возбудитель кроме основного хозяина - картофеля, способен поражать виды растений из других, отдаленных в систематическом положении семейств: капустовые (Brassicaceae), бобовые (Fabaceae), тыквенные (Cucurbitaceae) (табл.2).

Таблица 2 - Источники воспроизводства инфекции Phoma exiqua var. foveatа

Культура	Поражаемые органы	Тип болезни	Формирование пикнид
капуста белокочанная	стебель, листья	язва	+
огурец	листья	пятнистость	+
редис	листья	пятнистость	+
бобы	стебель, листья	язва, пятнистость	+
томат	стебель, листья	язва, пятнистость	+

На томате, как и на картофеле, отмечена типичная стеблевая форма проявления заболевания: удлиненные расплывчатые белесые пятна с темной каймой у оснований листовых черешков с хаотично разбросанными темноокрашенными пикнидами. На стеблях бобов пятна более мелкие, буроватые, светлеющие в центре. Отмечено опадение листьев, расположенных выше места инокуляции. На капусте белокочанной симптомы были схожи с поражением картофеля и томатов, с растрескиванием стебля в месте появления пятна. Образование пикнид на растениях бобов и капусты происходило на листьях, где формировались мелкие (2-3 мм) пятна у края листовой пластинки. На листьях огурца отмечено появление светлых некротизированных пятен неправильной формы, размером до 15 мм, на которых располагались многочисленные темные пикниды. Через 4,5 месяца после инокуляции отмечен выход пикноспор из пикнид и проведена реизоляция возбудителя с пораженных растений.

Установлено, что форма foveata способна к образованию покоящихся структур: через 4 месяца культивирования на искусственных питательных средах в клетках мицелия было отмечено обособление протоплазмы, затем он распадался на отдельные клетки, формируя хламидоспоры, на ранней стадии собранные в цепочки.

Таким образом, нами впервые показано, что гриб Phoma exiqua var. foveata имеет широкие трофические связи в агроэкосистемах и формирует хламидоспоры, усиливающие сохранение возбудителя на инфицированных растительных остатках многих сельскохозяйственных культур и в почве.

Наличие пикнид, способность к формированию покоящихся структур и расширению круга питающих растений, повышенная патогенность популяции свидетельствуют о том, что возбудитель фомозной гнили относится к группе К-стратегов, в которой доминирующими признаками популяции видов являются тактики выживания и трофических связей (Чулкина и др., 2000).

Токсические метаболиты гриба Phoma exiqua var. foveata. По типу питания вид Phoma exiqua sp. относится к факультативным паразитам с четко выраженными признаками паразитизма. В большинстве случаев патогенность факультативных паразитов связана с их токсичностью.

Показано, что сибирская популяция Phoma exiqua var. foveata неоднородна по показателю токсичности и включает слабо- и сильнотоксичные штаммы с преобладанием последних (до 70% популяции).

Пик выделения токсических метаболитов (ТМ) на картофельно-декстрозном бульоне у высокотоксичных изолятов приходится на первую неделю культивирования, составляя 85,5% и остается на этом уровне.

У слаботоксичных изолятов накопление токсических веществ идет постепенно, с дальнейшим увеличением от 10,3 до 67% через 4 недели культивирования (табл. 3).

Таблица 3 - Фитотоксическая активность изолятов на тест-культуре огурца, (%)

Группа штаммов	Время культивирования, сутки
	9	18	28
Сильнотоксичные	85,5	90,7	90,3
Слаботоксичные	10,3	20,7	67,0

Предложенная схема изучения токсических метаболитов включала:

1. Подбор питательной среды для наработки ТМ;

2. Культивирование изолятов и фильтрация культуральной жидкости;

3. Экстракцию органическими растворителями;

4. Тонкослойную хроматографию;

5. Газовую хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием;

6. Жидкостную хроматографию с масс-селективным детектированием.

Накопление токсических метаболитов гриба Phoma exiqua var. foveata проводили на минеральном растворе Петри, способствующем усиленному продуцированию метаболитов. Так, показатель активности слаботоксичных штаммов на этой питательной среде составил 72,4%, в то время как на картофельно-декстрозном бульоне - 10,3%.

После экстракции органическими растворителями было получено 3 образца: 1) гексановая фракция; 2) объединенная фракция полярных растворителей (этилацетат, хлороформ); 3) водная фракция.

При анализе гексанового экстракта (образец 1) было обнаружено 24 соединения, относящихся к разным классам органических веществ: предельные высокомолекулярные углеводороды с числом углеродных атомов от 37 гептатриаконтан СН3(СН2)35СН3 до 20 n-айкозан СН3(СН2)18СН3; из непредельных углеводородов присутствовал сквален. В образце также отмечено наличие ароматических соединений: толуола, дибутилфталата, диоктилфталата, а также 1-гидрокси-4-метилантрахинона, что согласуется с литературными данными о наличии антрахиноновых пигментов у формы Phoma exiqua var. foveata (Malkolmson, 1968).

Анализ объединенной фракции полярных растворителей (образец 2) показал наличие 69 веществ. Это, в основном, высокомолекулярные углеводороды с числом углеродных атомов 36 гексатриаконтан (ММ=507) до десяти декан. Более широко представлены непредельные углеводороды с числом углеродных атомов от 12 додекен до 18 октадекен, присутствовал алифатический спирт октадеканол. Из ароматических углеводородов, также как и в образце 1, присутствовал толуол и 1-гидрокси-4-метилантрахинон, более широко представлены эфиры фталевой кислоты. Кроме дибутилфталата присутствовал этилфталат и диоктилфталат, а также децилфталат и фталевая кислота.

Анализ водной фракции (образец 3) выявил наличие вещества с брутто формулой С20Н45О2N и ряда изомеров.

Наибольшим ингибирующим эффектом обладала водная фракция ТМ, которая подавляла рост корней пшеницы (ФА до 34,6%) и огурца (ФА до 89%) (табл.4), а также вызывала быструю гибель изолированных стеблей картофеля.

Таблица 4 - Фитотоксическая активность водной фракции токсических метаболитов Phoma exiqua var. foveata, (%)

Вариант	Тест- объект
	Пшеница	Огурец
1:100	34,6	89,0
1:500	16,3	69,6
1:1000	8.2	22,8
Раствор Петри	5,5	12,5

Таким образом, на данном этапе работы впервые было проведено изучение динамики накопления токсических метаболитов штаммов гриба Phoma exiqua var. foveata, изолированных из пораженных клубней картофеля на территории Западной Сибири. Подобраны условия и разработана схема наработки и выделения токсических метаболитов из культуры гриба, определены основные компоненты фракций суммарного токсина.

Изучение токсических метаболитов патогенов имеет большое практическое значение, а именно: образование токсических веществ может быть ограничено путем поиска синтетических или природных ингибиторов этого процесса, а также конкурентоспособных штаммов, не образующих токсины, либо штаммов-антагонистов. Селекция на устойчивость к фитопатогену с использованием токсических метаболитов в качестве селективного фактора представляется наиболее перспективным направлением, поскольку решает помимо хозяйственных задач, связанных с урожаем, и ряд экологических (снижение нагрузки химических средств защиты растений на окружающую среду).

2. Механизмы индуцирования физиологической устойчивости картофеля к возбудителю фомоза при помощи микроэлементов

Ингибирование культуры гриба Phoma exiqua var. foveata под действием микроэлементов. Оценку ростовых показателей проводили при добавлении в питательную среду сульфатов меди, цинка, марганца и борной кислоты в трех концентрациях 0,001% (0,5мг /50мл среды), 0,005% (2,5мг/50мл), 0,01% (5мг/50мл). Скорость роста гриба в сутки уменьшалась по сравнению с контролем, причем четко прослеживалось влияние концентрации соли в вариантах с медью. Бор снижал прирост гриба в среднем за период наблюдений на 7-22%. Добавление марганца и цинка в меньшей степени тормозило рост мицелия патогена, ограничивая его на 2-18%. При культивировании гриба Phoma exiqua var. foveata на жидкой питательной среде с микроэлементами нами были также отмечены отличия в характере роста патогена: колонии были сформированы в виде отдельных «островков», мицелий был прозрачным, истонченным, полупогруженным в жидкость, пикниды отсутствовали.

Таблица 5 - Масса воздушно-сухого мицелия слаботоксичных штаммов на 28 сутки культивирования

Микроэлемент	Концентрация (мг/50мл)	Масса мицелия, мг
		Штамм 2	Штамм 5А
Медь	0,5	261,0	178,0
	2,5	266,0	104,0
	5,0	264,0	138,0
Цинк	0,5	290,0	168,0
	2,5	-	200,0
	5,0	362,5	138,0
Марганец	0,5	291,5	195,0
	2,5	300,5	196,0
	5,0	279,0	151,0
Бор	0,5	255,5	168,0
	2,5	-	176,0
	5,0	283,5	181,0
Контроль	344,0	274,0
НСР 05	2,457	2,702

Изменение морфологических особенностей патогена в итоге привело к снижению вегетативной биомассы гриба (табл. 5).

Таким образом, микроэлементы оказывают фунгистатическое действие, замедляя интенсивность ростовых процессов и споруляцию возбудителя фомозной гнили, тем самым ограничивая заполнение экологических ниш и распространение патогена.

Инактивация токсических метаболитов Phoma exiqua var. foveata микроэлементами. При добавлении солей микроэлементов в питательную среду фитотоксическая активность токсичных штаммов снижалась в вариантах с медью, цинком и марганцем, и лишь в случае с бором она оставалась на уровне контрольной. На 18 сутки данный показатель был во всех случаях на уровне контроля, за исключением цинка (5 мг/50 мл), где токсичность составила 65%. На 28 сутки культивирования фитотоксическая активность значительно снизилась по всем вариантам с добавлением микроэлементов, кроме марганца. Самый низкий показатель отмечен в вариантах с внесением бора (0,5 и 2,5 мг), цинка (2,5 и 5 мг) и меди (2,5 и 5 мг).

Таким образом, добавление солей микроэлементов в питательную среду в большинстве случаев приводит к снижению фитотоксической активности патогена. Возможным механизмом снижения ФА может быть образование комплексных соединений микроэлементов с азотсодержащими веществами, входящими в состав водной фракции токсических метаболитов гриба Phoma exiqua var. foveata.

Изучение микроэлементного состава клубней как фактора устойчивости картофеля к возбудителю фомозной гнили. Оценку распределения микроэлементов в клубнях проводили методом инверсионной вольтамперометрии (ИВА), характеризующимся низким пределом обнаружения и высокой чувствительностью, использующимся для одновременного определения нескольких металлов.

Накопление меди и цинка в клубнях картофеля идет по-разному: содержание меди в кожуре и мякоти отличается незначительно и не регулируется обработками различными растворами солей микроэлементов (табл.6). Так, средний показатель по содержанию меди в мякоти составил 1,37, а в кожуре - 1,35 мг/кг. Напротив, среднее содержание цинка в кожуре составило 9,3 мг/кг, тогда как в мякоти - 6,2 мг/кг картофеля.

Таблица 6 - Распределение микроэлементов в клубнях картофеля (мг/кг)

Варианты	Мякоть	Кожура
	cодержание Zn	cодержание Cu	cодержание Zn	cодержание Cu
Контроль	2.6062	1.2353	0	1.2907
Zn	обработка клубней	14.4318	1.7099	9.1315	1.4834
	обработка клубней и ботвы	11.7236	1.1201	2.3153	1.8311
Cu	обработка клубней	5.6090	1.2153	21.2922	1.1983
	обработка клубней и ботвы	7.3557	1.3827	3.8800	1.0719
B	обработка клубней	2.7379	1.2146	12.3183	1.2816
	обработка клубней и ботвы	0	1.2687	21.6851	1.4667
Mn	обработка клубней	5.0288	1.7899	3.3300	1.2174

Погрешность прибора 0-0,001мг/кг

Кроме того, концентрация цинка изменялась под действием микроэлементов. Так, в кожуре его количество значительно повышалось при обработке медью (в варианте с обработкой клубней) и бором, а в мякоти - при обработке всеми изучаемыми микроэлементами, но в большей степени - цинком и медью. Методом искусственного заражения установлено снижение пораженности клубней фомозом в вариантах с обработкой микроэлементами (в среднем до 25%), вероятно связанное с их накоплением в клубнях нового урожая. Еще одним подтверждением может служить снижение фитотоксической активности культурального фильтрата токсичных штаммов в вариантах с добавлением меди на 3-90%, цинка - на 4-61%, марганца - до 22%, бора - до 93%. Таким образом, показана возможность регулирования поступления микроэлементов в клубни картофеля, которая может рассматриваться как фактор устойчивости культуры к возбудителю фомозной гнили. микроэлемент урожай картофель фомоз

При изучении влияния микроэлементов на элементы структуры урожая отмечено более раннее появление всходов в целом на 10-30% (табл.7).

Таблица 7 - Влияние микроэлементов на урожайность и элементы структуры урожая картофеля

Вариант	Число взошедших растений, % к контролю	Число стеблей на куст, % к контролю	Количество клубней на куст, % к контролю	Урожайность, % к контролю
	2003 г.	2002- 2004 гг.	2003 г.	2002-2004 гг.	2003 г.	2002- 2004 гг.	2003 г.	2002- 2004 гг.
Обработка клубней
Марганец	133,1*	136,4	89,2	97,6	112,8	106,5	88,4	106,8
Медь	110,4*	115,6	106,2	108,0	123,1	100,2	94,8	96,8
Цинк	91,7	106,5	101,5	97,6	105,1	98,8	92,7	100,3
Бор	117,2*	136,2	107,7	106,7	92,3	90,1	73,3	92,7
Обработка клубней и ботвы
Марганец	113,8*	150,7	110,8	104,0	269,2*	143,4	219,1*	145,2
Медь	100,0	122,2	107,8	100,8	100,0	98,4	117,5	112,4
Цинк	96,6	124,9	101,5	104,8	144,0	104,4	125,0	111,9
Бор	134,5*	138,9	107,8	108,0	110,3	101,7	107,8	104,8

* - достоверные различия на уровне 95%

Увеличение числа взошедших растений при обработке клубней растворами солей микроэлементов наблюдалось по всем вариантам, за исключением цинка. Подобная тенденция отмечалась и при совместной обработке клубней и ботвы. Число стеблей на куст увеличилось на 6-7% при обработке раствором сульфата меди, на 7,7% - в случае с бором. В варианте с цинком этот показатель был на уровне, а с марганцем - ниже контрольного. В схеме обработка клубней и ботвы увеличение числа стеблей на куст зафиксировано во всех вариантах и составило 1,5-10,8%. Прослеживалась тенденция возрастания количества клубней на куст при обработке картофеля микроэлементами.

Повышение значений элементов структуры урожая привело к увеличению урожайности в схеме: обработка клубней и ботвы на 8-119%, существенно различаясь по годам в вариантах с марганцем и цинком.

Кроме того, обработка картофеля микроэлементами привела к увеличению выхода средней фракции клубней на 17-58% по сравнению с контрольным вариантом (табл.8).

Таблица 8 - Фракционный состав клубней, % (2003 г.)

Вариант	Фракции
	крупная	средняя	мелкая
Контроль	17,5	54,0	28,6
Обработка клубней
Марганец	5,6	74,7	19,7
Медь	6,5	63,6	29,9
Цинк	13,6	74,2	12,1
Бор	7,0	71,9	21,0
Обработка клубней и ботвы
Марганец	7,1	81,0	11,9
Медь	15,0	65,9	19,3
Цинк	7,8	74,4	17,8
Бор	11,8	85,3	2,9

Таким образом, показано увеличение показателей элементов структуры урожая и изменение соотношения фракций на фоне обработки картофеля микроэлементами с одновременным снижением пораженности клубней фомозом.

Индуцирование микроэлементами устойчивости картофеля к фомозу путем интенсификации образования раневой перидермы.

Состояние покровов клубня является залогом успешного хранения, особенно для возбудителей с раневым механизмом проникновения. Показано, что толщина естественной перидермы в клубнях нового урожая под действием микроэлементов увеличилась на 25-70% по сравнению с контролем (табл. 9).

Таблица 9 - Влияние микроэлементов на скорость образования опробковевшего слоя перидермы

Вариант	Толщина перидермы
	Естественная	Раневая
		Осень	Весна
	толщина слоя, мк	% к контролю	толщина слоя, мк	% к контролю	толщина слоя, мк	% к контролю
Контроль	137	100	98	100	84	100
Обработка клубней
Марганец	153,6	112,1	106,2	108,4	68,5	81,5
Медь	141,6	103,4	150,0	153,1	85,0	101,2
Цинк	211,0	154,0	142,2	145,1	100,5	119,6
Бор	217,2	158,5	189,6	193,5	85,5	101,8
Обработка клубней и ботвы
Марганец	172,2	125,7	95,0	96,9	116,5	138,7
Медь	199,2	145,4	162,0	165,3	83,5	99,4
Цинк	193,8	141,5	166,8	170,2	78,0	92,9
Бор	234,0	170,8	204,0	208,2	117,5	139,9
НСР05	24,3	-	34,2	-	27,6	-

Активная интенсификация образования раневой перидермы отмечена осенью, причем существенное увеличение данного показателя было отмечено практически по всем микроэлементам. Наилучшие результаты были достигнуты при совместной обработке клубней и вегетирующих растений, где опробковевший слой был на 60-100% больше контроля. Весной образование раневой перидермы протекало в 1,7 раза медленнее, чем осенью. Однако, увеличение толщины перидермы было отмечено в вариантах с обработкой клубней сернокислым цинком, а также при совместной обработке клубней и ботвы марганцем и бором, где отличия от контроля были существенны.

Поражение фомозом клубней оценивалось при искусственной инокуляции суспензией спор в различных условиях заражения. В контрольном варианте отмечено, что размер механических повреждений оказывает существенное влияние на процент поражения: при нанесении суспензии спор на срез клубня показатель составил 70%, тогда как в случае с царапинами поражение было 100%-ным (табл. 10). Это объясняется тем, что к поверхности глубоких механических повреждений затруднен доступ кислорода, деятельность феллогена интенсифицируется слабо, опробковевший слой содержит меньше суберина, а перидерма закладывается не под пораненной поверхностью, а значительно глубже. Через неделю, когда на срезе образовался тонкий слой опробковевших клеток, было поражено 25% клубней, а спустя 20 дней - 40%.

В вариантах с обработкой клубней растворами солей микроэлементов при заражении в день повреждения и через 7 дней варианты были на уровне контроля или превышали его. Но через 20 дней заметно существенное снижение данного показателя в несколько раз.

Таблица 10 - Влияние микроэлементов на пораженность картофеля фомозом на фоне формирования раневой перидермы

Вариант	Пораженных клубней, %
	Заражение в день повреждения	Заражение через 7 дней	Заражение через 20 дней
	глубокие царапины	срез	срез	срез
Контроль	100	70	30	50
Обработка клубней
Медь	100	90	30	10
Цинк	90	70	40	-
Марганец	90	80	10	5
Бор	60	80	50	0
Обработка клубней и ботвы
Медь	90	90	50	0
Цинк	100	65	5	-
Марганец	60	80	20	0
Бор	100	70	14	11

При совместной обработке клубней и ботвы уже на 7 сутки отмечено уменьшение процента больных клубней в вариантах с цинком, марганцем и бором. Через 20 дней после нанесения механических повреждений не было отмечено пораженных клубней при обработке медью и марганцем. В случае с бором поражение было в 3,6 раза ниже контроля. Поэтому, для снижения вредоносности фомозной гнили, вызываемой Phoma exiqua var. foveata, рекомендуется увеличить продолжительность лечебного периода до 20 дней.

Таким образом, одним из механизмов устойчивости клубней к раневому патогену - возбудителю фомозной гнили картофеля - является увеличение мощности естественной и раневой перидермы под действием микроэлементов.

Влияние осенней обработки дымовым фунгицидом Вист на развитие фомозной гнили в период хранения. Отсутствие в большинстве картофелеводческих хозяйств специального оборудования препятствует широкому применению осеннего протравливания картофеля.

Существует альтернативный способ обработки - пиротехническая смесь Вист, изготовленная на основе тиабендазола, которая при возгорании образует дымовой аэрозоль и распределяет действующее вещество фунгицида равномерно по поверхности обрабатываемых клубней, особенно при использовании в картофелехранилищах принудительной вентиляции.

Результаты исследований показали, что при использовании фунгицида Вист в норме 10 г/т наблюдалось снижение жизнеспособности и ограничение распространения патогенов внутрь клубня. Частота выделения возбудителя фузариозной гнили из пораженной ткани после обработки снижалась в 5 раз, фомозной гнили - в 2,5 раза, размеры язв - в 1,5 и 1,2 раза соответственно по сравнению с контролем (табл.11).

Таблица 11 - Влияние осенней обработки картофеля дымовым фунгицидом Вист на возбудителей грибных гнилей

Заболевание	Показатели	Варианты
		Контроль	Вист
Сухая фузариозная гниль	Поражено клубней, %	17-24	2,1-6,5
	Частота выделения грибов Fusarium spp. из пораженных клубней, %	83,3	16,5
	Размеры язв, % к размеру клубня	75,0	50,9
Фомозная гниль	Поражено клубней, %	3,2-9,4	1,4-2,6
	Частота выделения грибов Phoma exigua из пораженных клубней, %	80	33
	Размеры язв, % к размеру клубня	76,8	62,1

Кроме того, изоляты, выделенные с обработанных клубней, обладали более низкой скоростью роста (на 11-15%) по сравнению с контрольными. При культивировании гриба на разных питательных средах данная закономерность сохранялась (рис. 1).

Рис.1 - Средний диаметр колоний гриба р. Phoma на 15-е сутки

В ходе лабораторных исследований проводили определение видового состава возбудителей грибных гнилей картофеля (Fusarium spp., Phoma exigua). Установлено, что выделенные изоляты возбудителей сухой фузариозной гнили относятся к секциям Elegans и Discolor. В первой секции выделили виды F.moniliforme var.subglutinans, во второй - F.culmorum (W.G.Sm.) Sacc. и F. trichotchecoides Wr. Причем видовой состав изолятов, выделенных из обработанных Вистом клубней, был значительно уже и представлен в основном видом F.culmorum (Шалдяева, Воробьева, Лущукова, 2001).

Популяция возбудителей фомоза была представлена двумя формами: Phoma exigua var. exigua и Phoma exigua var. foveata с преобладанием последней (Пилипова, Шалдяева, Заверткина, 2001).

При оценке патогенных свойств изолятов отмечено более высокое значение индекса Попова (26,3) у контрольных штаммов, чем у изолятов, выделенных с обработанных Вистом клубней (22,9).

Производственные испытания показали высокую эффективность Виста в защите картофеля от грибных гнилей, в том числе и фомоза, в период хранения.

По результатам анализов клубней отмечено, что при использовании препарата в норме 10 г/т общее количество пораженных клубней по сравнению с контролем сократилось в 3 раза, а фомозной гнилью - в 1,9 раза.

Эффективность действия Виста напрямую зависела от срока обработки картофеля. Исследования показали, что сохранность картофеля при обработке его в течение недели после закладки на хранение составляет около 90% и резко снижается с увеличением продолжительности этого периода (табл. 12).

Таблица 12 - Сохранность картофеля в зависимости от сроков обработки клубней Вистом, % ()

Показатель	Время обработки после закладки картофеля на хранение, недель.
	1	2	3	4
Здоровые клубни, %	90	77	59	54
Всего с гнилями, %	10	23	41	46
в т.ч.: фузариозная	4	3	2	14
фомозная	1	5	7	8
фузариозно-фомозная	2	12	30	16
бактериальные	3	3	2	8

При запаздывании с проведением осеннего протравливания на 2-3 недели сохранность картофеля составляет 60-80%. Обработка клубней через месяц после закладки нецелесообразна, так как количество гнилей значительно возрастает.

В то же время, при своевременной обработке картофеля Вистом увеличение количества гнилей за период хранения не превышает 5-8% (рис. 2).

Рис.2 - Динамика пораженности клубней в период хранения (среднее за 4 года)

Таким образом, за период 1997-2001 гг. проведено широкомасштабное научно-производственное испытание осенней обработки картофеля дымовым фунгицидом Вист общим объемом более 3 тыс. тонн. Уровень пораженности картофеля гнилями в период хранения в регионах составляет 33-40%. Проведение осенней обработки картофеля дымовым фунгицидом повышает сохранность клубней до 90%. Причем наибольшее действие препарат оказывает на возбудителей сухой фузариозной и фомозной гнилей с эффективностью 80,8 и 65% соответственно. Кроме того, наблюдается некоторое подавление бактериальных инфекций (табл. 13).

Таблица 13 - Эффективность осенней обработки картофеля дымовым фунгицидом Вист

Показатели	Новосибир-ская область	Алтайский край	Кемеров- ская область	В среднем за 1997-2000гг.	Биологи ческая эффектив-ность, %
	К	В	К	В	К	В	К	В
Без признаков гнилей, %	67,1	89,8	60,5	85,7	65,2	88,7	64,3	88,1	-
Всего гнилей, %	30,4	10,3	39,5	14,3	34,8	11,3	32,1	12,0	62,6
в том числе: фузариозная	14,5	3,7	11,1	1,3	19,7	3,8	15,1	2,9	80,8
фомозная	5,4	1,4	3,2	2,6	9,4	2,3	6,0	2,1	65,0
смешанная	7,7	2,4	10,0	6,0	2,0	0,7	6,6	3,0	54,5
бактериальные	2,8	2,8	14,5	11,4	4,0	4,5	7,1	6,2	12,7

Примечание: К - контрольный вариант; В - обработанный вариант

Экономическая эффективность осеннего протравливания. На основании полученных данных произведен расчет экономической эффективности использования препарата Вист.

Уровень рентабельности производства составил 185%. Рентабельность применения осеннего протравливания составила 208-309%. При использовании препарата Вист затраты окупаются в 1,12-1,7 раза. Таким образом, применение дымового фунгицида Вист для защиты картофеля в период хранения экономически выгодно.

Таким образом, на основании изучения биологических особенностей возбудителя Phoma. exiqua var. foveata (преобладание в структуре сибирской популяции, высокий уровень токсичности и патогенности, широкие трофические связи, наличие покоящихся структур) усовершенствована система защиты картофеля от фомозной гнили, включающая размещение картофеля в севооборотах, исключающих возделывание потенциальных источников инфекции возбудителя, повышение супрессивности почв для ограничения выживания покоящихся структур, обработку картофеля микроэлементами для повышения физиологической устойчивости растений, осеннюю обработку дымовым фунгицидом Вист в условиях увеличения лечебного периода до 20 дней.

Выводы

1.Установлено преобладание формы Phoma. exiqua var. foveata на территории Западной Сибири с одновременным повышением патогенных свойств. Показана неоднородность популяции по степени токсичности с доминированием сильнотоксичных изолятов (около 70%).

2. Выявлены 4 типа проявления фомозной гнили на клубнях, вызываемые формой foveata: поверхностный некроз, округлые язвы, клиновидные язвы, «глазковая» форма.

3. Экспериментально доказана возможность поражения растений семейств капустовые (Brassicaceae), бобовые (Fabaceae), тыквенные (Cucurbitaceae), пасленовые (Solanaceae)и формирования на них спороношения Phoma exiqua var. foveata. Показана способность патогена образовывать хламидоспоры, обеспечивающие сохранение возбудителя на инфицированных растительных остатках и в почве.

4. Предложена схема наработки и выделения токсических метаболитов из культуры гриба Phoma exiqua var. foveata, проведено изучение динамики накопления токсических метаболитов и установлен химический состав основных компонентов суммарного токсина, включающих предельные высокомолекулярные углеводороды, непредельные углеводороды, спирты и ароматические соединения. Наибольшим ингибирующим эффектом обладала водная фракция токсических метаболитов (фитотоксичность 34-100%), в составе которой обнаружено соединение с брутто-формулой С20Н45О2N.

5. Установлена возможность регулирования обработками поступления микроэлементов, позволяющая повышать устойчивость клубней картофеля к возбудителю фомозной гнили за счет снижения фитотоксической активности и ограничения ростовых процессов патогена. Отмечено увеличение концентрации цинка в кожуре до 21,29-21,69 мг/кг под действием обработок медью и бором, а в мякоти - в 1,9-5,5 раз по сравнению с контролем при обработке картофеля металлами.

6. Обработка картофеля микроэлементами, особенно цинком и бором, способствует интенсификации защитных механизмов клубней за счет увеличения мощности естественной (на 25-70% по сравнению с контролем) и раневой перидермы (на 60-100%), что снижает вероятность заражения возбудителем фомоза после нарушения целостности покровов клубня.

7. Осенняя обработка картофеля дымовым фунгицидом Вист в норме 10г/т снижает количество гнилых клубней в 2,5-3 раза, эффективно подавляя фомозную и смешанную фомозно-фузариозную гнили. Уровень рентабельности производства при осеннем протравливании составлял в годы исследований от 221до 309%.

8. Усовершенствованная на основе изучения биологических особенностей Phoma exiqua var. foveata система защиты картофеля от фомозной гнили позволяет получить прибавку урожая качественных клубней за счет индуцирования физиологической устойчивости растений и ограничения тактик жизненного цикла патогена в агроценозах культуры.

Предложения производству и селекционной практике

1. С целью снижения пораженности картофеля возбудителем фомозной гнили (Phoma exiqua var. foveata) рекомендуется включить в систему защиты культуры:

· введение фитосанитарных севооборотов с исключением восприимчивых культур (капуста, томат, огурец, бобы, редис);

· повышение супрессивности почвы путем внесения органических удобрений и запашки сидеральных культур;

· проведение обработки клубней перед посадкой 0,2% раствором марганца и бора и однократное опрыскивание вегетирующих растений 0,02% раствором тех же микроэлементов через 2 недели после появления полных всходов;

· осеннее протравливание дымовым фунгицидом Вист в норме 10 г/т в течение недели после закладки клубней на хранение

· увеличение продолжительности лечебного периода до 20 дней.

2. Рекомендовать в селекционной работе для отбора устойчивых форм методику наработки и выделения токсических метаболитов Phoma exiqua var. foveata. (Заверткина и др., 2006).

Публикации по материалам диссертации

1. Пилипова Ю.В. Изучение сибирской популяции возбудителя фомозной гнили в условиях протравливания картофеля дымовым фунгицидом вист. / Ю.В. Пилипова, Е.М. Шалдяева, И.В. Заверткина // Вредители и болезни растений. Международный сборник научных трудов. - Новосибирск, 2001. - С.63-65

2. Заверткина И.В Изучение биологических особенностей популяции Phoma exiqua sp. В Западной Сибири / И.В. Заверткина, Е.М. Шалдяева // Тезисы докладов 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука ХХI века» - Пущино, 2003-С.101

3. Заверткина И.В. Изучение фитотоксической активности штаммов Phoma exiqua sp. и инактивация токсических метаболитов микроэлементами // Материалы региональной научной конференции молодых ученых аграрных вузов Сибирского федерального округа «Аграрная наука России в новом тысячелетии». - Омск, 2003 - С.66-70

4. Заверткина И.В Токсические метаболиты Phoma exiqua и их взаимодействие с микроэлементами / И.В.Заверткина, Е.М. Шалдяева // Материалы конференции молодых ученых СФО «Научное обеспечение устойчивого развития АПК в Сибири» - Улан-Удэ, 2004 - С.35-38

5. Заверткина И.В. Типы фомозной гнили картофеля / И.В.Заверткина, Е.М. Шалдяева // Агро ХХI. - 2004-2005. - №7-12. - С.25-26

6. Заверткина И.В. Влиияние микроэлементов на формирование защитных барьеров в клубнях картофеля / И.В. Заверткина, Е.М. Шалдяева / Сб. материалов3-ей конференции молодых ученых «Инновационное развитие аграрного производства в Сибири» - Кемерово, 2005 - С. 26-29

7. Заверткина И.В. Токсические метаболиты гриба Phoma exiqua var.foveata / И.В. Заверткина, Г.А. Маринкина, Е.М. Шалдяева / Материалы второго всероссийского съезда по защите растений «Фитосанитарное оздоровление экосистем». - Том 1. - Санкт-Петербург, 2005 - С.165-167

8. Заверткина И.В. Симптомы фомозной гнили клубней, вызываемой Phoma exiqua Desm. var. foveata (Foister) Boerema / И.В.Заверткина, Е.М. Шалдяева // Мой Алтай: село и город - 2006. - №6(46). - С.38-39

9. Заверткина И.В. Определение химического состава токсических метаболитов гриба Phoma exiqua var.foveata / И.В.Заверткина, Г.А. Маринкина, Е.М. Шалдяева и др. // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - Краснообск, Новосиб. обл., 2006 - №5. - С.38-41

Размещено на Allbest.ru