Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ ЯРОВОГО РАПСА (BRASSICA NAPUS L.)

Котлярова Екатерина Борисовна

06.01.05 - Селекция и семеноводство

Рамонь - 2007

Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский и проектно-технологи-ческий институт рапса»

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук

Подвигина Ольга Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Буторина Анастасия Константиновна

доктор сельскохозяйственных наук

Ошевнев Валерий Павлович

Ведущая организация - ФГНУ «Всероссийский научно-исследователь-ский институт масличных культур им. В.С. Пустовойта» РАСХН

Защита состоится «18» мая 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.065.01 Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» по адресу: 396030, Воронежская область, Рамонский район, ВНИИСС; факс (47340) 2-19-93

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»

Автореферат разослан «18» апреля 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

к. с.-х. н. Путилина Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Рапс яровой (Brassica napus L.) - ценная масличная и кормовая культура, хорошо приспособленная к умеренному климату. В России рапс является одной из перспективных масличных культур, увеличение объемов производства семян которой позволит полнее обеспечить население растительным маслом, животноводство - кормовым белком, а промышленность - сырьем (Карпачев, 2006).

Создание новых сортов рапса, соответствующих требованиям современного производства, во многом зависит от разнообразия исходного материала, который можно создавать с помощью методов биотехнологии. Одним из них является метод получения гаплоидов из репродуктивных клеток в условиях in vitro, ускоряющий процесс формирования гомозиготных линий по сравнению с традиционными методами селекции в 5-10 раз. У ярового рапса достаточно подробно разработан метод культуры изолированных пыльников. Однако, в гетерозисной селекции на основе цитоплазматической мужской стерильности необходимо сохранение материнской цитоплазмы, что возможно только с помощью культивирования in vitro неоплодотворённых семязачатков. Кроме того, растения, полученные данным методом, свободны от некоторых вирусов и нежелательных генов, передающихся по мужской линии. Сведений о получении гаплоидных растений в культуре неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в доступной нам литературе не выявлено.

Метод культуры незрелых зародышей дает возможность получать отдаленные гибриды, что играет немаловажную роль в селекции рапса, так как перенос ценных генов из других видов и родов Brassicaceae расширяет его генетический потенциал, который отличается крайней узостью.

В связи с этим в селекции рапса применение биотехнологических методов, в том числе эмбриокультуры и гаплоидии, позволяющих расширить генетический потенциал и ускорить создание новых сортов и гибридов, является актуальным.

Цель исследований - обосновать приемы культивирования in vitro неоплодотворённых семязачатков и незрелых зародышей в процессе создания нового исходного материала ярового рапса.

Задачи исследований:

1. Изучить влияние экзогенных и эндогенных факторов на индукцию гаплоидных регенерантов из неоплодотворённых семязачатков и формирование реституционных линий ярового рапса.

2. Разработать способ получения нового исходного материала ярового рапса, в том числе восстановителей фертильности, с использованием метода культуры неоплодотворённых семязачатков.

3. Изучить влияние направления скрещиваний (генотипа материнской и отцовской формы) и условий культивирования на развитие зародышей отдаленных гибридов в условиях in vitro.

4. Выявить ценные и хозяйственно-полезные признаки полученных реституционных линий и гибридных растений.

Научная новизна. Впервые установлено, что при культивировании неоплодотворенных семязачатков ярового рапса тотипотентность клеток каллуса различается, и реализация морфогенеза происходит по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней. В культуре незрелых зародышей морфогенез осуществляется через прямую регенерацию, ведущую к формированию ростовых побегов. Данные наблюдения имеют теоретическое значение, так как расширяют научные представления о регуляции ростовых процессов у растений рапса при воздействии стрессовых условий культуры in vitro.

Впервые разработан метод получения гомозиготных линий рапса путем индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков in vitro, позволяющий установить влияние эндо- и экзогенных факторов на индукцию гаплоидии, определить оптимальные стадии развития эксплантов, выявить состав и последовательность чередования питательных сред на этапах стабилизации и микроразмножения гаплоидных и реституционных линий ярового рапса. Установленные параметры культивирования неоплодотворенных семязачатков ярового рапса in vitro дали возможность впервые разработать способ, позволяющий ускоренно (в 5-10 раз) получать исходный материал для гетерозисной селекции, на который подана заявка на патент «Способ получения восстановителей фертильности ярового рапса».

Впервые модифицирован состав питательной среды для получения гибридов от межвидовых и межродовых скрещиваний путем прямой регенерации из незрелых зародышей в условиях in vitro. Установлен оптимальный срок введения зародышей изучаемых отдалённых гибридов семейства Brassicaceae в культуру. Использование метода эмбриокультуры позволило получить межродовые гибриды между рапсом яровым и горчицей белой при использовании последней в качестве опылителя, что представляет определенный теоретический интерес для отдаленной гибридизации рапса.

Практическая значимость результатов исследований. С помощью культуры неоплодотворенных семязачатков получено 5 реституционных линий ярового рапса, которые были переданы в лабораторию селекции рапса ВНИПТИР и включены в её научно-исследовательскую работу.

Данные линии представляют ценность для использования в гетерозисной селекции в качестве восстановителей фертильности и как перспективный исходный материал для селекции ярового рапса на скороспелость, качество семян и масла, устойчивость к полеганию и другие признаки.

Полученный в ходе применения эмбриокультуры гибридный материал может использоваться в практической селекции и дальнейших фундаментальных и прикладных исследованиях. Среди полученных гибридов выявлены образцы, устойчивые к тле и с желтой семенной оболочкой.

Разработанные в процессе исследований методические подходы могут использоваться в учебных программах по биологии и селекции в высших и средних учебных заведениях и в различных областях биотехнологии.

Апробация работы. Основные положения исследовательской работы доложены и обсуждены на школах-семинарах молодых учёных Липецкой области: «Актуальные проблемы современной науки» (Липецк, 2004), «Актуальные проблемы естественных наук и их преподавания» (Липецк, 2005, 2006); III и IV Международных конференциях молодых учёных и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур» (Краснодар, 2005, 2007), школе молодых учёных «Экологическая генетика культурных растений» (Краснодар, 2005), Международной научно-практичес-кой конференции «Рапс - культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели» (Липецк, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы преподавания молекулярной биологии, биотехнологии и вирусологии в высших педагогических учебных заведениях» (Орехово-Зуево, 2006), I (IХ) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), Международной научной конференции «Проблемы биологии, экологии и образования: история и современность» (Санкт-Петербург, 2006), IX Международной научно-практи-ческой экологической конференции «Современные проблемы популяционной экологии» (Белгород, 2006), на межвузовских научных конференциях преподавателей, аспирантов и студентов (Липецк, 2003 - 2006 гг.) и заседаниях Учёного совета ГНУ ВНИПТИР (Липецк, 2004 - 2007 гг.).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Экспериментальное обоснование влияния эндогенных и экзогенных факторов на индукцию гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков в условиях in vitro, позволяющее ускоренно получать новый исходный материал ярового рапса.

2. Способ создания реституционных линий рапса, основанный на индукции гаплоидии из неоплодотворенных семязачатков, стабилизации, микроразмножении и диплоидизации полученных регенерантов.

3. Параметры эмбриокультуры, заключающиеся в определении влияния направления скрещиваний и оптимизации условий культивирования зародышей отдаленных гибридов.

4. Ценные признаки полученных гибридных растений и реституционных линий.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из введения, 4 глав, выводов и рекомендаций для практического использования. Работа иллюстрирована 53 рисунками, включая фотоснимки, и содержит 19 таблиц. Библиография включает 222 литературных источника, из которых 135 на иностранных языках.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, кроме того, 3 работы находятся в печати.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории биотехнологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Мазлумова».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

биотехнология селекция яровой рапс

Материал, методика и условия проведения опытов

Исходный материал. Настоящая работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и проектно-технологическом институте рапса (г. Липецк) в 2003 - 2006 гг. в рамках тематических планов 04.03.04.01.03 «Создать исходный материал для гетерозисной селекции на основе ЦМС с применением метода культуры неоплодотворенных семязачатков рапса» и 04.03.04.01.04 «Создать новый исходный материал от межвидовых и межродовых скрещиваний растений семейства Brassicaceae методом эмбриокультуры». Цитоэмбриологические исследования проводились в лабораторных условиях отдела биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова (п. Рамонь, Воронежской области).

В качестве исходного материала для индуцирования гаплоидии использовались сорта ярового рапса (Ратник, Липецкий, Hanna, Galaxy), полученные на их основе самоопылённые линии на стерильной цитоплазме и гибриды с генами восстановления фертильности.

С целью получения отдаленных гибридов в полевых и тепличных условиях проводили реципрокные межвидовые скрещивания рапса (Brassica napus L., 2n=38, F5 (Харьковская 6 Hanna)) с горчицей сарептской (B. juncea (L.) Сzern., 2n=36, сорт ВНИИМК 13) и межродовые скрещивания рапса (F3 (6B (CHk198 L159) (ВНИИМК 162 ВНИИМК 109)) с горчицей белой (Sinapis alba L., 2n=24, сорт R 166), а также сурепицы яровой (B. campestris L. var. oleifera, 2n=20, сорт Восточная) и декоративной капустой (B. oleracea var. capitata, 2n=18).

Условия и методика проведения опытов.

Индуцирование гаплоидии. Растения ярового рапса выращивались в теплице и на полях ВНИПТИР, расположенных в 10 км к северу от г. Липецка. Семязачатки изолировали из 1-30 бутонов от первого цветка, длиной от 2 до 6 мм, с центральной кисти и побегов первого и второго порядков. Введение в культуру проводилось в летний период с растений, выращенных в поле, в зимне-весенний - с доноров, выращенных в теплице. Закладка опытов, фенологические наблюдения, уход за посевами, гибридизация проводились согласно общепринятым методикам (Пустовойт, 1967).

Для стерилизации бутонов ярового рапса применяли растворы веществ: хлорамин Б и Domestos в различных концентрациях, анолит (рН=6) и смесь анолита с католитом (рН=7 и рН=9). Экспозиция бутонов в исследуемых растворах составляла 10 мин.

Извлечение семязачатков из завязи и введение их в культуру проводили в стерильных условиях пылезащитного бокса под бинокулярным микроскопом МБС-9 (кратность увеличения 12,8). Всего культивировалось более 10 тыс. неоплодотворённых семязачатков.

В исследованиях использовалась общепринятая техника приготовления и стерилизации питательных сред (Бутенко, 1964, 1999). Для культивирования эксплантов применялись среды Мурасиге-Скуга (MS) (Murashige, Skoog, 1962) и Гамборга (В5) (Gamborg, Eveling, 1968). В питательную среду добавляли витамины по Уайту (White, 1963), 100 мг/л мезоинозита, 20-40 г/л сахарозы. Индукция гаплоидных растений достигалась добавлением гормонов: 6-бензиламинопурина (6-БАП), гиббереллина (ГК), кинетина, -нафтилуксус-ной кислоты (НУК), индолилуксусной кислоты (ИУК) в различных концентрациях (0,01 - 3 мг/л) и сочетаниях. рН среды поддерживался на уровне 5,8-6,0. В качестве контроля применяли безгормональную питательную среду.

Обработку материала пониженной температурой (+4-6 оС) при экспозиции 1-3 суток проводили в бытовом холодильнике.

Культивирование неоплодотворённых семязачатков проводили в термальной комнате на свету при 16-часовом фотопериоде и в темноте, при температуре 23 - 26 єС, освещённости 5 тыс. люкс и влажности воздуха 70 %.

Перевод гаплоидных регенерантов на диплоидный уровень в условиях in vitro проводили на основе безгормональной питательной среды с добавлением 0,005 - 0,01 % водного раствора колхицина в течение 2-х суток в условиях темноты. Затем растения пересаживали на питательную среду, содержащую 0,25 мг/л кинетина и культивировали 1 месяц на свету. Определение уровня плоидности производили методом подсчёта числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и числа хромосом в точках роста. Хорошо развитые пробирочные растения пересаживали в теплицу в смесь песка и почвы в соотношении 1:3 и накрывали стеклянными стаканчиками для прохождения акклиматизации.

Жирнокислотный состав масла определялся в биохимической лаборатории отдела селекции ВНИПТИР н.с. Германенко Г.В. по методике Демьянчук Г.Т. (1988) методом газожидкостной хроматографии по ГОСТ 30089-93, содержание глюкозинолатов в семенах - экспересс-методом (ГОСТ 9824-87, п. 3.5).

Эмбриокультура. Незрелые зародыши межвидовых и межродовых гибридов вводили в культуру in vitro на разных стадиях развития (5, 7, 10, 13 и 17 дни после опыления). Культивирование зародышей проводили на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 30 г/л сахарозы, БАП, ГК по 0,2 мг/л, 0,1 мг/л НУК и 300 мг/л гидролизата казеина.

Морфологическое описание гибридов осуществляли по методике ВИР (Корнейчук, 1983). Для цитологического изучения на всех этапах работы использовались общеизвестные методики (Паушева, 1988). Цитологические препараты просматривали на микроскопах МБИ-6, МБИ-15, Ienaval. Фотографирование препаратов и объектов исследования осуществляли с помощью фотоаппарата Olympus 400 Digital на микроскопах МБИ-15 и Ienaval (окуляр 8-10х, объектив - 12,5-40х).

Повторность опытов двух-трехкратная. При обработке экспериментальных данных использовали однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ (Доспехов, 1985), программы Excel и Statistica v. 6.0.

Индуцирование гаплоидии из неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в условиях in vitro

Влияние эндогенных факторов на индукцию гаплоидии

Влияние генотипа. Определяющим из комплекса лимитирующих факторов в культуре неоплодотворенных семязачатков являлся генотип растения-донора. Проведенные исследования показали, что реализация морфогенеза происходила по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней.

При введении в культуру семязачатки имели светло-зеленый цвет, затем становились матово-белыми, а в дальнейшем бурыми, и 37 % образовывали каллусы небольшого размера молочного или желтого цвета. При этом обнаруживалось образование двух типов каллусной ткани. Каллус первого типа (неморфогенный) формировался на 10 - 14-й день культивирования и представлял собой водянистую массу клеток рыхлой консистенции и жёлтого или мутно-серого цвета. На таких каллусах наблюдался некроз тканей или ризогенез, и они не были способны к регенерации.

Каллус второго типа (морфогенный) становился визуально заметным на 18 - 20-й день культивирования и имел белую или бледно-жёлтую окраску, плотную консистенцию и зернистую или глобулярную структуру. Массовое формирование и развитие каллуса наблюдали за период с 30-го по 45-й день после изоляции, что согласуется с данными других исследователей (Славова, Рафаилова, 1991). В процессе культивирования в нем образовывались проэмбриогенные массы или меристематические зоны. В дальнейшем из этих меристематических очагов путем последующей дифференциации формировались сначала ростовые почки, а затем растения.

Следует отметить, что в 98 % случаев наблюдался процесс развития вегетативной почки (вегетативный геммогенез). Формирующиеся регенеранты имели слабо развитый гипокотиль с двумя-тремя узкими листовыми пластинками бледно-зеленого цвета. Отмечались единичные случаи генеративного геммогенеза, когда растение высотой не более 2,5 см образовывало бутоны.

Из 16 изученных генотипов ярового рапса 15 были способны к каллусообразованию, 10 обладали способностью к индукции ростовых почек и только у пяти генотипов почки развивались в растения.

Частота индукции каллусных структур колебалась от 0 до 7,10 % в зависимости от генотипа донорского растения. У сортов и самоопыленных линий со стерильной цитоплазмой выявили самую низкую частоту каллусообразования, которая составила 1,15 % и 2,43 %, и регенерации (1,67 % и 3,85 % соответственно). Сорта и линии более чем в 2 раза уступали материалу гибридного происхождения по количеству ростовых почек (12,46 %). Гибриды обладали наибольшей склонностью к индукции каллуса и регенерации проростков, составивших в среднем 3,55 % и 4,72 %. Кроме того, у материала гибридного происхождения были обнаружены максимальные значения частоты образования каллуса (7,1 %) у генотипа № 3, ростовых почек (29,41 %) у № 7 и регенерантов (17,65 %) у № 8 (табл. 1).

Таблица 1 - Влияние генотипа донорского материала на регенерационную способность неоплодотворённых семязачатков ярового рапса (2003 - 2005 гг.)

№ материала	Характеристика материала	Введено семязачатков, шт.	Получено каллусов	Сформировано из каллусов
				ростовых почек	проростков
			шт.	%	шт.	%	шт.	%
1.	Гибриды	1055	43	4,08	0	0	0	0
2.		1048	28	2,67	2	7,14	0	0
3.		507	36	7,10	4	11,11	3	8,33
4.		936	28	2,99	3	10,71	0	0
5.		585	8	1,37	1	12,5	0	0
6.		1119	19	1,70	1	5,26	0	0
7.		811	17	2,34	5	29,41	2	11,76
8.		551	34	6,17	8	23,53	6	17,65
9.	Сорта	656	15	2,29	2	13,33	1	6,67
10.		541	6	1,11	0	0	0	0
11.		762	9	1,18	1	11,11	0	0
12.		298	0	0	0	0	0	0
13.	Линии	443	13	2,94	3	23,08	2	15,38
14.		234	2	0,85	0	0	0	0
15.		222	9	4,05	0	0	0	0
16.		375	7	1,87	0	0	0	0
НСР0,05 = 0,03	НСР0,05= 0,25	НСР0,05= 0,23

Максимальную частоту регенерации среди линий наблюдали у № 13 - полученной на основе сорта Hanna самоопыленной линии со стерильной цитоплазмой (15,38 %). Сорт Hanna (№ 10) также проявил способность к индукции морфогенного каллуса и образованию ростовых почек (11,11 %). Наибольшей склонностью к индукции гаплоидии среди сортов ярового рапса обладал № 9 (Липецкий) - 6,67 %.

Часть генотипов (№ 1, 10, 14, 15, 16) формировала нерегенерационный каллус. Многие генотипы, например, № 4, 5, 11, обнаруживали относительно высокий выход ростовых почек (10,71 %, 12,5 % и 11,11 % соответственно), однако, при пересадке их на среду для регенерации дальнейшего развития отмечено не было. Таким образом, у ярового рапса способность к каллусообразованию и регенерации растений в культуре неоплодотворённых семязачатков зависела от генотипа донорского растения.

Маркерные признаки растений-доноров. Результаты исследований показали, что гетеростилия третьего и четвертого типов и недоразвитость пыльников встречаются у генотипов №№ 3, 7, 8, 13, обладающих лучшей регенерационной способностью в культуре неоплодотворенных семязачатков in vitro. Частота встречаемости аномальных форм цветка колебалась в зависимости от происхождения материала и достигала 73% у линии № 13, в то время как в норме она составляла не более 35,3 %. Кроме того, у гибрида № 8 отмечались случаи срастания соседних цветоножек и уменьшение их длины с 2,1 см до 1,2 см, т.е. почти в 2 раза.

Цитологические наблюдения показали, что данный селекционный материал отличался наличием изменений при формировании мужских гамет. Аномалии проявлялись в формировании микроспор, где были отмечены триады и тетрады с аномальным развитием. Также было отмечено наличие пыльцевых зерен измененной формы и увеличенного размера до 49,5 мкм, что превышало размеры нормальных зерен примерно в 1,5-2 раза.

Проведенные исследования позволили выявить зависимость регенерационной способности селекционного материала от количества аномальных пыльцевых зерен. Так, у гибрида № 3 при наличии 3,5 % аномальных пыльцевых зерен регенерационная способность достигала 8,33 %, а у гибрида № 8 данные показатели составили соответственно 32,9 % и 17,65 % (рис. 1).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Зависимость регенерационной способности от количества нарушений при формировании мужских гамет у растений-доноров

Следовательно, морфологические изменения формы цветка и генеративных органов, а также качественные признаки пыльцевых зерен и микроспор можно использовать как маркерные признаки при отборе донорских генотипов для индуцирования гаплоидов.

Зависимость регенерационной способности семязачатков от длины бутонов и расположения ветвей на побеге. Другим существенным фактором, влияющим на регенерационную способность неоплодотворенных семязачатков является стадия развития зародышевого мешка при введении эксплантатов. Анализ полученных результатов показал, что морфогенетическому развитию в большей степени подвержены семязачатки, изолированные из бутонов длиной 2,0 - 4,0 мм, частота образования каллуса у которых составляла 3,3 %, а выход регенерантов колебался от 0,3 до 0,7 %.

Результаты исследований показали, что семязачатки из бутонов с центральной кисти обладали максимальной способностью к каллусообразованию (5,7 %) и регенерации (1,3 %). Экспланты из бутонов с ветвей первого порядка, образовывали в два раза меньше каллусных структур (2,6 %) и регенерантов (0,7 %), а бутоны с побегов второго порядка практически не были способны к регенерации. Возможно, полученные результаты связаны с повышенной активностью всех физиологических процессов, происходящих в основных побегах ярового рапса.

Таким образом, наибольшей способностью к индукции новообразований обладают семязачатки, эксплантированные с бутонов центральной кисти основного побега ярового рапса длиной 2 - 4 мм. Данные наблюдения следует использовать при введении в культуру эксплантов с большей регенерационной способностью.

Влияние экзогенных факторов на индукцию гаплоидии

Подбор оптимального стерилизующего агента. Результаты сравнения действия различных стерилизующих агентов показали, что использование 10 %-х растворов хлорамина и Domestos обеспечивало 100 % стерильность материала. Однако, при этом отмечено угнетение развития регенерантов.

Таблица 2 - Эффективность стерилизации бутонов различными дезинфицирующими веществами при введении неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в культуру in vitro (2004-2005 гг.)

Дезинфицирующий раствор	Концентрация раствора, %	Введено в культуру семязачатков, шт.	Инфицировано семязачатков, %	Получено регенерантов, %	Развитие регенерантов (по 5-бальной шкале)
			грибной инфекцией	бактерииальной инфекцией
Хлорамин	7	123	9,8	21,1	0,8	3
	10	119	0	0	2,5	3
Domestos	5	120	0	12,5	4,2	3
	7	125	0	0	8,0	5
	10	198	0	0	5,1	4
Анолит	рН=6	118	0	0	12,7	5
Анолит+ католит	рН=7	200	0	0	21,0	5
	рН=9	124	0	0	14,5	5
Итого:	1278	0,9	6,9	8,1

Наибольшее число регенерантов (8,0 %) и их нормальное развитие наблюдали при стерилизации 7 %-ным раствором Domestos (табл. 2).

Выявлено, что количество семязачатков, поражённых бактериальной инфекцией, составило 6,9 % против 0,9 % эксплантов, подверженных воздействию грибной инфекцией.

Обработка бутонов ярового рапса раствором анолита и смесью анолита с католитом не только уничтожила инфекцию, но и стимулировала развитие семязачатков. При стерилизации бутонов смесью анолита с католитом (рН=7) у каллусов получили максимальное количество регенерантов - 21,0 %. При этом образование каллуса и ростовых почек наблюдалось на 7 - 10 дней раньше, чем при использовании других дезинфицирующих веществ, что согласуется с отмеченным другими исследователями благоприятным влиянием на растения активированной воды (Васильченко, 2005).

Таким образом, при культивировании неоплодотворённых семязачатков in vitro наряду с 7 %-ным раствором Domestos эффективными дезинфицирующими агентами являются экологически чистые электроактивированные водные растворы анолит и смесь анолита с католитом (рН=7), ускоряющие развитие неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в культуре in vitro.

Влияние сроков введения в культуру и предобработки бутонов на индукцию гаплоидии. При изучении регенерационной способности неоплодотворенных семязачатков ярового рапса, выращенного в условиях теплицы и поля, выявлено, что количество каллусных структур в 2004 - 2005 гг. колебалось от 5, 6 % до 0,58 % при введении эксплантов с донорских растений, вегетировавших в поле. Условия теплицы были более стабильными, в связи с чем и частота каллусообразования колебалась незначительно и составляла в среднем 2,34 %.

Наибольшее количество проростков (0,26 %) было получено в 2004 г. при эксплантации семязачатков с растений, При зимне-весенней эксплантации частота образования проростков была меньше и составляла 0,03 %, в 2005 г. - 0,19 %.

Экспериментальные данные по обработке неоплодотворённых семязачатков холодом в течение 24 часов показали максимальную склонность эксплантов к образованию каллусов - до 61,1 % и наибольшее количество регенерантов (3,1 %). Частота регенерации находилась в прямой зависимости от экспозиции обработки и понижалась с 3,1 % (1 день) до 0,8 % (3 день воздействия). Следовательно, обработка холодом в течение суток повышала морфогенную способность семязачатков.

Зависимость регенерационной способности неоплодотворённых семязачатков от условий культивирования. Еще одним экзогенным фактором, от которого зависит эффективность получения гаплоидных растений в культуре in vitro, является состав питательной среды.

Максимальная частота каллусообразования (5,7 %) была получена при добавлении в питательную среду 20 % сахарозы. Увеличение концентрации сахарозы до 30 г/л снижало частоту каллусообразования до 1,2 %, а наличие в питательной среде 40 г/л сахарозы оказывало ингибирующий эффект, что согласуется с данными других исследователей (Zhou, Yang, 1981).

При изучении влияния минерального состава среды на регуляцию роста и развития культивируемых семязачатков ярового рапса не было выявлено достоверных различий по частоте каллусообразования на средах с минеральной основой В5 и MS при 5 %-ном уровне значимости по результатам дисперсионного анализа двухфакторного опыта (рис. 3).

В результате исследований было выявлено, что наибольшая частота образования каллуса (5,81 %) и достоверные различия по сравнению с контролем наблюдались в варианте № 5 питательной среды MS с добавлением 0,3 мг/л 6-БАП, 0,01 мг/л ИУК и 0,3 мг/л ГК. На остальных вариантах сред частота каллусообразования существенно не превышала стандарт и находилась на одном с ним уровне. В связи с этим в дальнейших исследованиях применялась среда с минеральной основой MS.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3. Действие гормональных добавок на частоту каллусообразования в зависимости от минерального состава среды

Изучение гормонального состава питательной среды показало, что наибольшая способность к каллусообразованию (15 %) и достоверные различия по сравнению с контролем наблюдались в варианте № 21 питательной среды (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние ростовых веществ в питательной среде на каллусогенез ярового рапса в культуре неоплодотворённых семязачатков (2004 - 2005 гг.)

Вариант сред	Соотношение БАП:кин:ИУК:ГК:гидр.каз.:2,4-Д	Введено семязачатков, шт.	Образование каллуса
			шт.	%
1.(st)	Без гормонов	561	2	0,36
13	1: 0,1 : 0 : 0,5 : 0 : 0	300	1	0,33
14	2: 0,1 : 0 : 0,5 : 0 : 0	300	0	0
15	3 : 0,1 : 0 : 0,5 : 0 : 0	300	0	0
16	1 : 0,1 : 0,01 : 0,5 : 0 : 0	300	16	5,33
17	2 : 0,1 : 0,01 : 0,5 : 0 : 0	300	9	3,00
18	3 : 0,1 : 0,01 : 0,5 : 0 : 0	300	4	1,33
19	0,5 : 0,1 : 0,1 : 0 : 100 : 0	200	2	1,00
20	0,5 : 0,1 : 0,1 : 0 : 300 : 0	240	2	0,83
21	0 : 1 : 0,1 : 1 : 10 : 0	200	30	15,00
22	0 : 1 : 0,1 : 1 : 0 : 0	140	10	7,14
23	0,5 : 1 : 0,5 : 0,5 : 0 : 0,5	215	3	1,40
24	1 : 0,5 : 1 : 1 : 0 : 1	244	2	0,82
25	0,5 : 1 : 0,5 : 0,5 : 0 : 0,1	680	28	4,12
26	0 : 1 : 0,1 : 0,5 : 0 : 0,5	275	5	1,82
			НСР0,05=4,03

Только морфогенные каллусы, образовавшиеся на средах № 16 и 23 - 26 обладали способностью к формированию ростовых почек. Максимальное количество ростовых почек (71,4 %) формировалось на питательной среде (вариант № 25) с превышением концентраций цитокининов по отношению к ауксинам более, чем в 2 раза (1,5 : 0,6).

Оптимальной для индукции проростков оказалась среда № 25, частота регенерации на которой составила 58,8 % (табл. 4).

Таблица 4 - Формирование регенерантов из каллусных структур в зависимости от состава питательной среды (2004 - 2006 гг.)

Вариант среды, №	Число каллусных образований, шт.	Получено	Характеристика состояния
		ростовых почек	регенерантов из ростовых почек
		шт.	%	шт.	%
1.(st)	2	0	0	0	0	-
16	16	5	31,3	0	0	Бесцветные почки, нет развития
23	3	2	66,7	1	50,0	Проростки с листьями
24	2	1	50,0	1	100,0	Витрифицированные проростки с широкими листьями и утолщенным стеблем
25	28	20	71,4	11	58,8	Нормально развивающиеся проростки с листьями
26	5	2	40,0	1	50,0
Итого:	54	30	64,5	14	25,0	-

Бульшее количество кинетина и меньшая концентрация 6-БАП (превосходящего кинетин по активности) в составе данной среды способствовало росту регенерантов и их нормальному развитию из ростовых почек.

При пересадке на среду для регенерации не все ростовые почки, полученные в культуре неоплодотворенных семязачатков, развивались в растения. Частота регенерации широко варьировала в зависимости от генотипа и составляла от 0 до 100 %.

Регенеранты с признаками обводнения погибали в течение 2-х недель от появления проростка. Больше 50 % растений с изменённым морфотипом обладало способностью к образованию вторичных регенерантов на разросшихся тканях гипокотиля. Ростовые почки формировались в количестве от 1 до 7 на первичный регенерант. При пересадке вторичных регенерантов на безгормональную среду В5 они развивались в нормальные растения.

При изучении светового режима культивирования эксплантов выявлено, что в темновых условиях активнее, чем на свету проходило формирование каллусов - 59,5 % и 44,3 % соответственно. Однако при этом наблюдалось угнетение развивающихся эксплантов, а количество регенерантов сокращалось в 2,2 раза, что составляло 1,0 %.

Таким образом, процесс воспроизведения гаплоидных растений в условиях in vitro определяется прежде всего на генетическом уровне, но реализуется в зависимости от конкретных физиологических условий и различных по действию индуцирующих факторов.

Гаплоидия как ускоренный метод создания гомозиготных линий ярового рапса

Формирование гаплоидных линий. Исследования показали, что на начальных стадиях роста гаплоидные регенеранты отличались слабым развитием и жизнеспособностью вследствие одинарного набора хромосом. Гибель регенерантов на этой стадии составляла в зависимости от генотипа растений-доноров до 62 %.

Культивирование гаплоидных проростков с признаками витрификации на средах с гормонами не приводило к формированию нормальных растений, а чаще всего влекло за собой их гибель. Для формирования гаплоидных линий многими исследователями было предложено проведение этапа стабилизации, (Таратонов, 1999). Согласно нашим исследованиям, использование чередования гормональной и безгормональной сред позволяло регенерантам приобрести способность образовывать пазушные побеги, благодаря чему количество регенерантов гибрида № 3 увеличилось от 3 до 32 растений к 4 пассажу.

Установлено, что для нормально развитых гаплоидных растений этап стабилизации заключался в чередовании следующих сред: гормональная - безгормональная - гормональная. Для слабо развитых или витрифицированных адвентивных побегов необходимо сначала культивирование на безгормональной среде, а затем на гормональной.

Доказательством стабилизации и выравненности гомозиготных линий является анализ плоидности. У каждого из полученных регенерантов в 100 клетках была определена длина замыкающих клеток устьиц и подсчитано число хлоропластов в них. Установлено различие в размерах замыкающих устьичных клеток у растений с разным уровнем плоидности. Отношение длины замыкающих клеток устьиц листа гаплоидов к клеткам ди- и триплоидной форм составило 1 : 1,58 и 1 : 2,21 соответственно.

В результате подсчёта числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц выявлено, что у гаплоидных растений встречалось от 8 до 11 хлоропластов на две замыкающие клетки устьица, у диплоидных - от 12 до 14. У триплоидных форм отмечалось более 14 хлоропластов (табл. 5).

Кроме того, у гаплоидных растений наблюдалось возникновение деформированных устьичных клеток и отсутствие в них хлоропластов.

Данные признаки можно использовать в качестве морфологических маркеров для отбора гаплоидных регенерантов на самых ранних этапах развития, когда анализ хромосомного набора крайне затруднителен.

Таблица 5 -Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц листа и длина клеток у растений ярового рапса при различных уровнях плоидности

Уровень плоидности	Количество хлоропластов, шт.	Длина замыкающих устьичных клеток, мкм
	Среднее значение	Мини-максимальные средние
Гаплоидный (n)	9,8 ± 1,45	8,3 - 11,2	14,6 ± 1,12
Диплоидный (2n)	13,0 ± 1,05	11,9 - 14,0	23,1 ± 1,87
Триплоидный (3n)	15,2 ± 1,10	14,1 - 16,2	32,2 ± 1,65

Диплоидизация гаплоидов и формирование реституционных линий. Для создания гомозиготных линий, способных участвовать в селекционном процессе, гаплоидные растения необходимо перевести на более высокий уровень плоидности. В связи с этим изучалась возможность колхицинирования в культуре in vitro.

Исследования показали, что выживаемость регенерантов, подвергнутых воздействию колхицином в зависимости от генотипа составляла от 50 % до 100 %. Для предотворащения возврата регенерантов на гаплоидный уровень их культивировали на среде с кинетином. Наиболее развитые диплоидные растения размножали на среде с БАП, кинетином и гиббереллином до необходимого количества и укореняли на среде с 1 мг/л НУК. Процесс корнеобразования длился 2-4 недели, при этом частота формирования корней зависела от генотипа и колебалась в пределах 35,6 - 97,4 %. Затем растения переносили в грунт теплицы или в полевые условия.

В результате проведенных нами исследований был разработан метод получения гомозиготных линий ярового рапса на основе индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков, заключающийся во введении неоплодотворенных семязачатков в культуру, формировании каллуса и регенерации на нем ростовых почек, стабилизации и микроразмножении гаплоидов, их колхицинировании in vitro (диплоидизации); стабилизации, микроразмножении полигаплоидов и корнеобразовании; пересадке в грунт теплицы, акклиматизации и высадке в полевые условия.

Способ получения восстановителей фертильности ярового рапса. В результате применения метода культуры неоплодотворенных семязачатков было получено 5 реституционных линий, в том числе линии РЛ 7 и РЛ 8, донорские растения которых имели стерильную цитоплазму типа Polima и гены восстановления фертильности. В условиях теплицы и поля полученные растения цвели, и после опыления пыльцой линии РЛ 8 формы, обладающей цитоплазматической мужской стерильностью, завязались семена. Эффективность гибридизации при этом достигала 65,3 %.

Семена реституционных линий были высеяны в теплице, и у растений в период цветения проведен анализ фертильности. Установлено, что фертильность донорского растения № 8 повысилась в результате индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков in vitro с 78,7 % до 94,5 %, что свидетельствует о том, что линия РЛ 8 может быть использована в качестве восстановителя фертильности в гетерозисной селекции ярового рапса.

Полученные данные позволили разработать способ получения восстановителей фертильности рапса, состоящий из следующих этапов:

1. Получение гомозиготных линий ярового рапса от исходных форм, обладающих свойством восстановления фертильности, с помощью индуцирования гаплоидии посредством культуры неоплодотворенных семязачатков in vitro. 2. Посев семян полученных реституционных линий в поле и обычный уход за растениями. 3. Опыление форм с цитоплазматической мужской стерильностью пыльцой реституционных линий. 4. Посев полученных семян в поле и анализ фертильности пыльцевых зерен.

Характеристика полученных реституционных линий

Каждую линию по средним значениям показателей в зависимости от того, насколько они превышают значения донорских растений, оценивали по пятибалльной системе. В результате выявили, что по всем исследованным элементам структуры урожая выделилась линия РЛ 8 с максимальным количеством баллов (44). Минимальную оценку получила РЛ 7 (29 баллов), значения которой резко колебались по разным показателям.

Сравнение реституционных линий, полученных в культуре неоплодотворенных семязачатков, с донорами по элементам структуры урожая показало уменьшение высоты полученных растений примерно в 1,5 раза, повышающее устойчивость растений к полеганию с 3 до 5 баллов.

Кроме того, у полученных линий ярового рапса интерес представляло изучение качества масла и семян. Основным требованием, предъявляемым к современным сортам, принимаемым в производство пищевого рапсового масла, является содержание менее 0,6 % глюкозинолатов в семенах и снижение практически до нуля эруковой кислоты в масле.

Биохимический анализ семян полученных линий выявил, что у трех из пяти линий (РЛ 3, РЛ 8, РЛ 9) содержание глюкозинолатов не превышает 0,6 %. При этом две из них (РЛ 3, РЛ 8) являются и низкоглюкозинолатными, и безэруковыми, т.е. принадлежат к «00» типу и имеют увеличенное содержание линолевой кислоты (23,7 и 20, 0 % соответственно) по сравнению со стандартом (18,5 %) и пониженное содержание линоленовой кислоты по сравнению с сортом-стандартом Ратник (9,4 %) - 8,4 и 8,1% соответственно. Помимо этого, у данных линий суммарное содержание олеиновой и линолевой кислот составляет более 80,0 %, что представляет большой интерес для селекции на качество пищевого масла. Кроме того, линия РЛ 8 отличалась повышением содержания олеиновой кислоты по сравнению с гибридом-донором с 63,1 % до 66,0 %.

Линия ГЛ 9 с содержанием эруковой кислоты 39,9 % может быть рекомендована в качестве исходного материала для селекции высокоэруковых сортов рапса для производства биотоплива, где высокое содержание эруковой кислоты важно для устойчивости топливной смеси к окислению (Дубовская и др., 2005).

Таким образом, полученные линии являются перспективным исходным материалом для создания высокопродуктивных линейных сортов типа «00», а также для использования в гетерозисной селекции.

Эмбриокультура в условиях in vitro

Влияние направления скрещивания на выживаемость гибридных зародышей в условиях in vitro

Основной задачей межвидовых и межродовых скрещиваний являлся перенос рапсу признаков крупности семян и желтой окраски семенной оболочки, а также устойчивости к альтернариозу.

Получение истинных межродовых гибридов горчицы белой с рапсом в полевых условиях затруднено. Проведенные исследования показали, что эффективность гибридизации находилась на низком уровне и достигала 1,2 % в прямом и 0,2 % в обратном скрещивании. Предполагается, что низкая завязываемость семян обусловлена несовместимостью пыльцы и рылец (Ripley, Arnison, 1990). Применяя культуру незрелых зародышей, удалось получить гибридные проростки (1,9 %) при использовании рапса в качестве материнской формы, в обратных скрещиваниях регенерация гибридных зародышей не отмечалась. Морфогенез осуществлялся через прямую регенерацию, ведущую к формированию ростовых побегов.

Скрещивания рапса ярового с горчицей сарептской в полевых условиях проходили более успешно, но эффективность гибридизации находилась на невысоком уровне - 5,6 % и 1,7 % в обратных скрещиваниях.

Увеличить жизнеспособность зародышей в 1,8 раза в прямом и в 2,9 раза в обратном скрещивании удалось с применением эмбриокультуры. При использовании рапса в качестве отцовского компонента скрещивания средняя частота образования проростков (16,4 %) была в 5,3 раза больше, чем в прямых скрещиваниях (3,1 %). Кроме того, в обратных скрещиваниях было получено 33,3 % растений с гибридным морфотипом, что составило 4 растения из 12.

Таким образом, в скрещиваниях рапса с горчицей белой наиболее эффективным оказалось культивирование гибридных зародышей от прямых скрещиваний, а с горчицей сарептской - от обратных скрещиваний.

Влияние возраста зародышей и условий культивирования на процесс регенерации

Результаты проведенных исследований показали, что на развитие незрелых зародышей в культуре in vitro оказывает влияние целый комплекс лимитирующих факторов, одним из которых является возраст эксплантов. Недифференцированные гибридные 5-дневные зародыши (ранняя глобулярная стадия) не прорастали на питательной среде ни в одной из комбинаций скрещивания. Наиболее эффективным было введение в культуру недоразвитых зародышей на 10 - 17 дни после опыления.

Для скрещиваний B. napus Ч B. juncea наибольшее количество регенерантов было получено при эксплантировании зародышей через 13 дней после опыления (25 %). В остальных комбинациях скрещивания у зародышей, изолированных на 17 день после опыления, наблюдалась наибольшая частота регенерации как в скрещиваниях рапса ярового с горчицей белой (3,5 %), так и с горчицей сарептской (54,5 %) (рис. 4).

Максимальная частота регенерации (60 %) была получена у зародышей того же возраста от скрещивания сурепицы яровой и капусты. Данные скрещивания, как и предыдущие, также применялись для получения желтосемянных форм рапса посредством его ресинтеза и увеличения генетического разнообразия внутри рода Brassica. Применение эмбриокультуры в данном случае увеличило жизнеспособность гибридных зародышей, так как эффективность гибридизации была небольшой и составляла всего 3,5 %. Следовательно, на развитие оплодотворенных семязачатков в культуре in vitro большое влияние оказывал возраст экспланта.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Количество дней после опыления

Рис. 4. Влияние возраста зародышей на их жизнеспособность в условиях in vitro (2005-2006 гг.)

При изучении состава питательной среды было установлено, что большое количество цитокининов в варианте среды № 2 (6-БАП - 0,3 мг/л, кинетин -0,1 мг/л) снижало частоту регенерации до 1,1 % и количество нормально развитых проростков - до 0,7 %.

Добавление НУК и ГК стимулировало регенерацию 4,5 % зародышей. Уменьшение концентрации 6-БАП с 0,3 до 0,2 мг/л и увеличение концентрации ГК до 0,2 мг/л позволило получить максимальное количество нормально развитых проростков (12,0 %). Оптимальным являлось содержание в составе среды 0,2 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК и 0,2 мг/л ГК.

Определение светового режима показало, что незрелые зародыши в условиях культуры тканей развивались как в темноте, так и на свету. При относительно равном количестве общего числа полученных проростков (4,0 % и 4,2 % соответственно) образование нормально развитых регенерантов повышалось с 1,3 % в условиях темноты до 3,7 % на световом режиме. Проростки затем проходили этап микроразмножения, укоренения и пересадки в грунт.

Характеристика полученных гибридов

Гибриды рапса ярового и горчицы сарептской. В результате исследований было получено 16 растений, большинство из которых (69 %) имели морфологические признаки материнской формы. Как в условиях in vitro в фазе 2-3 листьев, так и взрослые растения не отличались от горчицы сарептской по окраске, волнистости и зубчатости края листа, его положению на стебле, наличию опушенности и другим признакам.

Гибриды сурепицы яровой и капусты. Растения, полученные в результате ресинтеза, принадлежали либо к материнскому, либо к промежуточному морфотипу. У гибридов доминировали такие признаки отцовской формы, как гофрированность, толщина и темно-зеленая окраска листовой пластинки. Было получено два растения, которые образовали семена, 78 % которых были невыполненными, а остальные нормальные семена имели коричневую окраску.

Гибриды рапса ярового и горчицы белой. Гибридные растения на стадии 2-3 листьев по некоторым морфологическим признакам были аналогичны горчице (отцовской форме): имели сильное опушение, среднюю степень антоциановой окраски семядолей. Данные результаты подтверждают истинность полученных гибридов.

Проведенное в полевых условиях морфологическое описание гибридов F1 горчицы белой и рапса ярового показало промежуточное наследование некоторых признаков (число долей, волнистость и зубчатость края листа изгиб верхушки листа, опушенность края первого листа). Полученные гибриды отличались большим числом ветвей первого порядка (до 12 шт.) и обильным цветением. При их скрещивании с яровым рапсом наблюдалось завязывание семян и образование стручков с промежуточной между родительскими формами длиной створки (табл. 6).

Таблица 6 - Промежуточное наследование некоторых признаков гибридов F1 горчицы белой и рапса ярового

Признаки	Brassica napus	Brassica napus Ч Sinapis alba	Sinapis alba	НСР0,05
1. Семядоли: - длина, мм - ширина, мм	6,9 ± 0,27 13,8 ± 0,41	7,2 ± 0,13 15,9 ± 0,74	7,6 ± 0,71 18,1 ± 0,33	0,69 0,81
2. Морфология листа: - число долей - опушенность края первого листа - характер изгиба верхушки	4,5 ± 0,65 редкая средний	4,9 ± 0,73 средняя слабый	5,8 ± 0,17 густая отсутствует	0,34 - -
3. Опушенность стебля	отсутствует	слабая	сильная	-
4. Высота ветвления, см	47,3 ± 1,93	40,0 ± 1,13	35,4 ± 1,65	1,89
5. Длина створки стручка, мм	54,1 ± 0,29	17,6 ± 0,67	14,7 ± 0,65	1,31

Среди полученных гибридов рапса ярового и горчицы белой выявлены образцы (28 %), устойчивые к тле, на которых отмечалась наименьшая плотность заселения растений (1 балл, менее 25 % поверхности листьев) наряду с растениями горчицы белой. На остальных экземплярах в зависимости от генотипа данный показатель колебался от 26--50 % (2 балла) до более 50 % (3 балла) заселенности всей поверхности листьев тлей. Предполагается, что устойчивость к тле связана с опушением гибридов, которое они унаследовали от отцовской формы (горчицы белой).

У 82,3 % гибридных семян отмечалась желтая семенная оболочка, причем среди желтоокрашенных семян были чисто желтые, с темным рубчиком и крапинками. Расщепление по окраске гибридов F1 объясняется тем, что желтую окраску семян определяет гомозиготное рецессивное состояние аллелей трех локусов, а исходные растения желтосемянного рапса, участвующего в скрещиваниях, имели сложную гибридную природу с участием ресинтезированных форм. Необходим отбор в последующих поколениях чистых желтоокрашенных семян, дающих полностью светлосемянное потомство. Таким образом, полученный в результате проведенных исследований гибридный материал требует дальнейшего изучения и использования в селекционном процессе.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что генотип растения-донора определяет cпособность неоплодотворенных семязачатков ярового рапса к дальнейшему развитию. Более отзывчивы к индуцированию гаплоидов материалы гибридного и линейного происхождения (в среднем 4,72 и 3,85 %) по сравнению с сортами (1,67 %).

Морфологические изменения формы цветка и наличие аномальных структур при формировании мужского гаметофита можно использовать как маркерные признаки при отборе донорских генотипов. Установлена прямая зависимость регенерационной способности селекционного материала от количества аномальных структур. Наибольшей способностью к регенерации (1,3 %) обладают семязачатки, эксплантированные с бутонов центральной кисти основного побега ярового рапса длиной 2 - 4 мм.

2. Показано, что смесь анолита с католитом (рН=7) ускоряет развитие неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в культуре in vitro на 7 - 10 дней. Предобработка бутонов холодом в течение суток повышает морфогенную способность семязачатков до 3,1 %.

3. Гормональный состав питательных сред определяет пути морфогенеза женского гаметофита и образование морфологических структур при культивировании неоплодотворенных семязачатков ярового рапса. Установлено, что тотипотентность клеток каллуса различается, и реализация морфогенеза происходит по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней.

Максимальный выход морфогенного каллуса достигается путём культивирования неоплодотворенных семязачатков ярового рапса на среде, содержащей 1 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 1 мг/л ГК и 10 мг/л гидролизата казеина. Наличие в среде 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л БАП, ИУК, ГК и 1 мг/л кинетина способствует образованию максимального количества ростовых почек (71,4 %) и регенерантов (58,8 %). Культивирование неоплодотворённых семязачатков на свету более чем в 2 раза по сравнению с условиями темноты стимулирует появление проростков.

4. Определены параметры стабилизации гаплоидных форм в зависимости от морфологического развития регенерантов. Стабилизацию гаплоидов проводят одновременно с микроразмножением в течение 3-4 пассажей с чередованием ростовой (ГК, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л) - безгормональной - ростовой сред для нормально развитых регенерантов, и безгормональной - ростовой - безгормональной для слабо развитых регенерантов.