Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

06.01.05 - селекция и семеноводствосельскохозяйственных растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА МОРФОГЕНЕЗ И РЕГЕНЕРАЦИОННУЮ СПОСОБНОСТЬ СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ГОРОХА ПОСЕВНОГО (PISUM SATIVUM L.)

САЩЕНКО М.Н.

Рамонь - 2013

Диссертационная работа выполнена в отделе биотехнологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы имени

А.Л. Мазлумова» в 2007-2010 гг.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Жужжалова Татьяна Петровна

Официальные оппоненты: ГНУ ВИР Россельхозакадемии,зав. отделом генетических ресурсов зернобобовых культур, доктор биологических наук, профессор Вишнякова Маргарита Афанасьевна

ФГБОУ ВПО ВГАУ имени Императора Петра I профессор кафедры селекции и семеноводства доктор сельскохозяйственных наук Заслуженный деятель науки РФ Павлюк Николай Трофимович

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт» зернобобовых и крупяных культур Россельхозакадемии

Защита состоится «15» ноября 2013 года в 10-00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.065.01 при Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы имени А.Л. Мазлумова» РАСХН по адресу: 396030, Воронежская область, Рамонский район, п. ВНИИСС, д. 86; тел./факс (47340) 5-33-26;

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВНИИСС.

Автореферат разослан и размещен на сайте gnuvniiss.narod.ru

«11 » октября 2013 г., на сайте ВАК Минобрнауки РФ

«11» октября 2013 г.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета, Стогниенко кандидат биологических наук Ольга Ивановна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Горох (Pisum sativum L.) - одна из важнейших зернобобовых культур в мире. Одним из важных направлений в селекции гороха является создание новых сортов, обладающих высокой урожайностью, устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессорам, повышенным содержанием белка (Амелина, 2012). Дальнейшее развитие селекции гороха требует внедрения в работу новых методов биотехнологии, позволяющих повысить эффективность селекции за счет создания новых форм с ценными признаками, длительного сохранения отдельных ценных генотипов и гибридов, а также ускорения отдельных этапов селекции путем быстрого размножения необходимых линий и сортов (Атанасов, 1993).

Работы по применению методов биотехнологии в селекции гороха немногочисленны. Ведутся исследования по изучению устойчивости к стрессовым факторам (засуха, засоление), технике и условиям клонирования бобовых культур (Суворова, Бобков, Соболева, 2005), получению регенерантов из каллусов, обеспечивающих широкое разнообразие исходных форм (Соболева, 2006), применению генетической трансформации на горохе (Нифонтова и др., 2005; Bean, Mullineaux, Davies, 1997).

Вместе с тем исследования по культивированию органов и тканей очень ограничены и свидетельствуют о недостаточной изученности морфогенетических свойств растений (Кучук, 1997). Исследование особенностей онтогенеза гороха, продолжительности фенологических фаз, выявление связей между внешней формой и экзогенными воздействиями факторов среды служат успешному ведению селекционных работ (Панарина, 2011).

В связи с этим возникает потребность в разработке и совершенствовании различных методов биотехнологии, позволяющих создавать новый и сохранять ценный селекционный материал в культуре изолированных органов и тканей такой важной культуры, как горох. Это и определяет актуальность данной работы.

Цель исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении влияния гидротермических условий на возрастные периоды онтогенеза гороха и оценке морфогенной активности растительных тканей in situ для формирования жизнеспособных растений-регенерантов в условиях in vitro.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определить основные отличительные особенности возрастных состояний онтогенеза у растений гороха в условиях ЦЧР и установить их взаимосвязь с органообразовательными процессами и фазами развития.

2. Выявить корреляционную зависимость между формированием элементов продуктивности и гидротемическими условиями выращивания.

3. Усовершенствовать метод микроклонального размножения гороха.

4. Установить лимитирующие факторы получения регенерантов гороха при культивировании незрелых и зрелых зародышей методом эмбриокультуры.

Научная новизна исследований. Впервые установлена возрастная периодизация жизненного цикла гороха и определена взаимосвязь с этапами органогенеза и фазами развития растений. Показано, что у индетерминантных форм гороха виргинильное возрастное состояние продолжается в течение всего онтогенеза, а высокая влажность и оптимальная температура способствуют образованию большего количества репродуктивных узлов и бобов. Детерминантный тип характеризуется быстрым прохождением периодов цветения, плодообразования и созревания семян. Данные исследования расширяют и углубляют теоретические представления о природе онтогенеза гороха.

Выявлена высокая чувствительность растений гороха к стрессовым факторам внешней среды в период формирования репродуктивных органов, фазе цветения и налива зерна, что подтверждено высокой корреляционной зависимостью (r=0,905-1,0).

Разработана оптимальная схема стерилизации, обеспечивающая стерильность эксплантов до 90 % при дальнейшем формировании хорошо развитых регенерантов.

Определены методические подходы к стимулированию развития инициальных верхушечных меристем гороха, позволившие ускорить процесс микроклонирования в два раза и усовершенствовать метод микроклонального размножения.

Впервые разработаны основные режимы культивирования незрелых зародышей, позволяющие получать потомство от трудно скрещиваемых генотипов в системе in vitro и повышать всхожесть длительно хранившихся семян ценных сортообразцов.

Практическая значимость и реализация результатов исследований.

Установленные основные морфологические особенности возрастных состояний гороха могут служить надежными критериями при целенаправленных скрещиваниях и создании новых высокопродуктивных сортов, адаптированных к определенным условиям возделывания, а также при проведении биотехнологических исследований. Разработанные эффективные схемы стерилизации различных видов эксплантов (семена, меристема растений, незрелые зародыши) могут найти широкое применение при проведении биотехнологических исследований на горохе.

Усовершенствованный метод микроклонирования гороха позволяет в короткий срок размножать новый ценный исходный материал до требуемого объема и может широко использоваться в практической селекции. Параметры культивирования незрелых и зрелых зародышей гороха дают возможность использовать метод эмбриокультуры для получения растений от трудно скрещиваемых генотипов и восстановления длительно хранившегося в семенах селекционного материала. Установленные режимы культивирования незрелых зародышей гороха и усовершенствованный метод микроразмножения позволили получить 2 линии от внутривидовой гибридизации (VSB 128.132 х Рамонский-77 и wi 7106 х АМЗК-99) и 2 селекционно-ценные по ряду признаков линии (№ 377-02, № 1065-02), которые зарегистрированы в селекцентре ВНИИСС и переданы селекционерам для селекционной работы.

Разработанные в процессе исследований методические подходы могут применяться в различных областях биологии и биотехнологии, в учебных программах по биологии, биотехнологии, селекции в высших и средних учебных заведениях.

Положения, выносимые на защиту:

1. Морфологические особенности возрастной периодизации жизненного цикла гороха служат для диагностики и отбора ценных высокопродуктивных генотипов при экзогенных воздействиях окружающей среды.

2. Усовершенствованный метод микроразмножения гороха дает возможность ускорить процесс размножения в два раза при сохранении генотипической однородности ценного селекционного материала.

3. Культивирование незрелых и зрелых зародышей гороха в условиях in vitro определяется сортовыми особенностями донорского материала и способствует успешной гибридизации трудно скрещиваемых сортообразцов различного происхождения.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых (Воронеж, 2007), IX, Х Международной конференции «Биология клеток растений и биотехнология» (Звенигород, 2008; Казань, 2013), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы АПК» (Адыгея, 2008), IX, X, XI, XIII Молодежных конференциях «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2009, 2010, 2011, 2013), Российско-германской научно-практической конференции «Перспективы развития сельского хозяйства: наука, образование, практика» (Воронеж, 2009), II Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны» (Пенза, 2012), VII Международной научно-практической конференции «Аграрная наука сельскому хозяйству» (Барнаул, 2013), Всероссийской научно-практической конференции «Глинковские чтения» (Воронеж, 2013) и заседаниях Ученого Совета ВНИИСС (2007-2010 г.г.).

Публикация результатов исследований. Основные материалы диссертации изложены в 15 печатных работах, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах, определенных перечнем ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложений. Основной текст изложен на 147 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, 51 рисунок. Список цитируемой литературы состоит из 297 наименований, из них 70 на иностранных языках.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обобщены литературные данные, касающиеся традиционных направлений селекционной работы по гороху. Показано, что применение современных методов биотехнологии позволяет расширить генетический спектр исходного материала. Представлены данные о наличии лимитирующих факторов, влияющих на ростовые процессы регенерантов в условиях in vitro. На основании имеющихся в современной отечественной и зарубежной литературе данных делается вывод о необходимости разработки и совершенствования современных методов биотехнологии, повышающих эффективность селекционных работ по гороху.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Настоящая экспериментальная работа выполнена в 2006-2010 годах во Всероссийском научно-исследовательском институте сахарной свеклы им. А.Л. Мазлумова Россельхозакадемии (Рамонь, Воронежская область). Исследования проводились согласно тематическому плану ВНИИСС в 2005-2010 годах по теме 04.03.04. «Разработать новые и усовершенствовать существующие методы клеточных технологий, обеспечивающие эффективную регенерацию с целью создания сельскохозяйственных растений с заданными признаками».

В качестве исходного материала использовались сорта и селекционный материал лаборатории селекции зернобобовых культур ВНИИСС: Рамонский- 77, Амур, Зенит, АМЗК - 99, № 377 - 02, № 1065 - 02.

Полевые исследования проводились в условиях лесостепной зоны Воронежской области, Рамонского района на выщелоченном черноземе в севообороте «Э» ВНИИСС. Исследования по биотехнологии проводились на базе отдела биотехнологии ВНИИСС.

Для отработки метода стерилизации использовались различные экспланты: зрелые семена гороха, проростки, полученные при проращивании семян в термостате при температуре +20-25 °С, верхушечные части побегов вегетирующих растений (1,0-1,5 см), незрелые семена (3-20 день после опыления), части черешков, корней и листовые пластинки. В качестве стерилизующего агента изучались хлор - и ртутьсодержащие вещества в различных концентрациях и экспозициях обработки.

После обработки стерилизующими веществами материал 3-4 раза промывали стерильной дистиллированной водой в течение 60 минут. При введении в культуру и дальнейшем культивировании применяли технику приготовления питательных сред согласно методике Р.Г. Бутенко (1975). Влияние состава питательной среды на жизнеспособность и размножение эксплантов и микроклонов определялось на среде с минеральной основой Мурасиге, Скуга (MS) (Murashige, Skoog, 1962). Соотношение гормонов и их концентрация колебались по вариантам питательных сред в зависимости от задач исследований. рН рабочей среды поддерживался на уровне 5,8-6,0. В качестве контроля применяли безгормональную питательную среду.

Культивирование эксплантов осуществлялось в термальном помещении с регулируемыми условиями. Стерильность обработки определяли после 5-7 дней культивирования. Фенологические наблюдения проводились еженедельно. При разработке метода эмбриокультуры на питательные среды вводили семязачатки гороха на 3, 5, 8, 12, 16 и 20 день развития. Повторность каждого опыта 2-х - 3-х кратная. Определение фертильности пыльцевых зерен производили путем окрашивания препаратов в 1 % растворе кармина по методике В.Н. Юрцевой и В.А. Пухальского (1968). Цитологические препараты при изучении возрастных состояний гороха просматривались и фотографировались на микроскопе МБИ - 15 и Ienaval, окуляр 8-10х, объектив-12,5х, 25х, 40х.

При обработке экспериментальных данных использовали однофакторный и многофакторный дисперсионный анализ (Доспехов, 1979).

3. МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ ГОРОХА

Морфология растений в развитии является важнейшим интегральным показателем биологических особенностей, закрепленных в генотипе, и отражает реакцию растений на изменения факторов внешней среды, которые прямо или косвенно воздействуют на биологический ритм, что имеет большое значение в селекции. В связи с этим наши исследования были направлены на определение взаимосвязи основных морфологических особенностей возрастных периодов жизненного цикла гороха с органогенезом в ходе индивидуального развития растений в условиях лесостепи Воронежской области.

Возрастные изменения растений гороха в онтогенезе. В ходе онтогенеза любого растительного организма одновременно протекают возрастные и органообразовательные процессы. Определенное возрастное состояние растения находит свое непосредственное отражение в формировании соответствующих возрасту организма тех или иных органов. В результате изучения процессов морфогенеза и видимых морфологических изменений у растений гороха в онтогенезе нами была определена взаимосвязь этапов органогенеза и возрастных состояний растений гороха в условиях Воронежской области (табл. 1).

Таблица 1 - Взаимосвязь возрастных состояний с фазами развития растений и этапами органогенеза у гороха посевного (Pisum sativum L.)

Возрастной период	Возрастное состояние	Фазы развития растений	Этап органогенеза
		название	продолжительность, дней
Латентный	Семена	Покоящееся семя	До 15 лет	-
Прегенеративный	Проросток	Всходы	10-14	I
	Ювенильное, имматурное	Первый настоящий лист	1-8	II
	Виргинильное	Стеблевание, ветвление	12-16	II, III
Генеративный	Раннее генеративное	Бутонизация в закрытой почке	7-12	IV, V
		Зеленый бутон		VI, VII
	Зрелое	Бутонизация видимая	2-6	VIII
	Позднее генеративное	Цветение	4-7	IX
		Формирование бобов	12-15	X
		Налив семян	12-15	XI
		Созревание семян	5-10	XII
Постгенеративный	Сенильное	Отмирание растений	-	-
Продолжительность периода вегетации 65-85

Латентный период связан с покоем семян, который у гороха продолжается до 15 лет. Семена гороха крупные, диаметром 3,5-7,0 мм, масса 1000 зерен колеблется в пределах 150 и более 250 г. В покоящемся состоянии семена гороха могут находиться достаточно долго, однако после 8-12 лет происходит значительное изменение белков и теряется всхожесть.

Прегенеративный период продолжается около 40 дней, соответствует I-II этапам органогенеза и включает следующие возрастные состояния растений гороха: проросток, ювенильное, имматурное, виргинильное.

Состояние проростка начинается с прорастания семени, что соответствует I этапу органогенеза, когда в основном происходит внутрипочечное развитие побега. Фаза всходов продолжается в среднем 10-14 дней.

Ювенильное возрастное состояние соответствует II этапу органогенеза и характеризуется появлением всходов над поверхностью почвы. У растений гороха верхушечный конус нарастания главного побега и затем боковых побегов в течение почти всего онтогенеза остается на II этапе органогенеза. Такой конус нарастания называется открытым, а растения характеризуются индетерминантным типом роста стебля. Вегетативные органы у него формируются на протяжении всего периода вегетации, несколько замедляясь к началу плодообразования. Границы этапов в этом периоде проявляются не совсем четко.

Имматурное возрастное состояние продолжается на II этапе органогенеза. Продолжительность периода составляет около 8 дней. На растении формируются до 4-6 междоузлий.

Виргинильное возрастное состояние соответствует завершению II этапа органогенеза и наступает у растений гороха с момента активного роста наземной и корневой части, которое отмечается в среднем на 12-16 день после появления всходов.

Поскольку сорт гороха селекции ВНИИСС Рамонский-77 характеризуется индетерминантным типом роста стебля, вегетативные органы формируются у него на протяжении всего периода вегетации, несколько замедляясь к началу плодообразования. Растения детерминантного сорта АМЗК-99 отличается некоторым замедлением ростовых процессов к концу фазы цветения, что вызывает быстрое прохождение периодов цветения, образования и созревания семян.

Следует отметить, что в конце вергинильного возрастного состояния конус нарастания верхушечной почки увеличивается в размерах и наблюдается закладка меристематических бугорков оси будущего соцветия, что соответствует III этапу органогенеза.

Генеративный период включает в себя три возрастных состояния - раннее генеративное, зрелое и позднее генеративное, в течение которых происходит формирование соцветий, образование цветков, оплодотворение, формирование и созревание семян и длится 30-55 дней.

Раннее генеративное состояние начинается с IV этапа органогенеза, когда наблюдается формирование соцветий. Отличительной особенностью данного этапа органогенеза гороха является формирование генеративной сферы растений, дифференциация которой проходит в закрытой почке. Цветковые бугорки превращаются в цветки, что определяет начало V этапа органогенеза. По состоянию роста отдельных органов цветка и дифференциации цветковых бугорков V этап делится на 3 подэтапа: V0 - заложение чашелистиков, V1 - заложение, рост тычинок и пестика, V2 - рост лепестков. VI, VII этап органогенеза характеризуется прохождением микро- и мегаспорогенеза. В это время усиленно растут все органы цветка. К концу данного этапа сначала зеленые, а потом белые лепестки выступают за края чашечки. В узле плодоношения одновременно могут находиться зеленые и белые бутоны.

Зрелое возрастное состояние совпадает с VIII этапом органогенеза и соответствует фазе видимой бутонизации, которая длится 2-6 дней. К этому времени венчик выступает за края чашечки больше, чем наполовину. Лепестки окрашены и полностью сформированы. Опыление наступает за 24-36 часов до распускания цветка, от опыления до оплодотворения проходит 4-12 часов.

Позднее генеративное состояние соответствует IX- XII этапам органогенеза и характеризуется формированием и созреванием плодов и семян. IX этап органогенеза - фаза цветения растений гороха (4-7 дней). Поскольку опыление происходит в закрытом бутоне в конце фазы видимой бутонизации, то в фазу цветения тычинки и столбик с рыльцем уже увядают. Завязь начинает усиленно расти. Сам процесс цветения сводится лишь к раскрытию цветка. Для Х этапа органогенеза характерен рост створок боба в длину и формирование зародыша семени. Развитие створок боба длится около 12-15 суток после опыления, в зависимости от сорта и, особенно, условий вегетации. На ХI этапе активно растут семена за счет отложения запасных веществ в семядолях, происходит дифференциация зародыша. Семена достигают фазы молочной спелости, стенки плода (боба) становятся тонкими и менее сочными. Период созревания семян (ХII этап органогенеза) связан с созреванием плодов и семян (продолжительность его в среднем около 5-10 дней). Происходит отток веществ в семядоли из всех органов растения. Наблюдается побурение створок боба, за счет подсыхания семена уменьшаются в размерах.

Постгенеративный период наступает у гороха в конце вегетации и характеризуется побурением, усыханием листьев и стеблей и приводит к сенильному состоянию растений. Растения отмирают. Период вегетации гороха в условиях Воронежской области колеблется в пределах 65-85 дней.

Таким образом, органообразовательные процессы в период онтогенеза Pisum sativum тесно взаимосвязаны и последовательно следуют друг за другом, зависят от возрастных состояний и фаз развития растения. Характер прохождения этапов органогенеза определяет свойства будущего организма. Выявление отличительных особенностей онтогенетического развития растений гороха даёт возможность использовать морфогенетическую оценку при разработке методов и режимов культивирования различных видов эксплантов в условиях in vitro, направленных на создание нового исходного материала. Для проведения биотехнологических исследований на горохе необходимо учитывать морфологическое состояние растений. Для микроразмножения использовать растения, находящиеся на I-III этапах, когда идет активное образование меристем и XII этапе - зрелыми семенами, так как при гибридизации наблюдается низкая их завязывемость. При введении в культуру незрелых зародышей желательно использовать их на VIII-IX этапах органогенеза.

Влияние погодных условий на фенологические фазы развития гороха

Среди многочисленных факторов внешней среды тепло- и влагообеспеченность рассматриваются как важнейшие, поскольку существует тесная связь между продуктивностью и физиологическими ограничениями их приспособительных возможностей к данным экзогенным стрессорам (Жуков, 2001).

В результате исследований установлена длительность периода вегетации изучаемых образцов, которая колебалась за период 2007-2010 гг. от 75 до 85 дней. В этот период большое значение имело количество выпавших осадков и изменения температуры воздуха. Особенно это было заметно в периоды посев-всходы, цветение - созревание. Дефицит влаги (2010 г.) и высокие температуры (24,3 оС) вызывали резкое сокращение этих периодов до 10 и 30 дней, соответственно.

Проведенные исследования показали, что количественные значения, определяющие формирование репродуктивных органов растений и элементов продуктивности, находятся в прямой зависимости от наличия осадков (0,47-0,74) и в обратной - от средней температуры воздуха в данный период (0,40-0,85) (табл.2).

Таблица 2 - Коэффициенты корреляции гидротермических условий с элементами продуктивности растений гороха (2007-2010 гг.)

Показатели	Температура	Осадки	Множественная корреляция
Количество репродуктивных узлов на растении	-0,85	0,47	0,998
Количество бобов на 1 узел	-0,98	0,74	1,000
Количество зерен в 1 бобе	-0,58	0,56	0,588
Масса 1000 семян	-0,59	0,64	0,905
Урожайность	-0,40	0,32	0,999

Таким образом, проведенные исследования позволили определить критические по отношению к высокой температуре и недостатку влаги периоды онтогенеза, что способствует прогнозированию продуктивности гороха на ранних этапах развития растений и повышению результативности селекционной работы.

4. МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ГОРОХА

Метод культивирования in vitro растительных клеток, тканей и органов в настоящее время все шире используется для селекции. Применение метода позволяет оздоровить посадочный материал, быстро размножить ценный образец, получить растения из недозрелых семян, что позволяет значительно ускорить селекционный процесс.

Методические рекомендации по микроклонированию растений гороха в культуре ткани in vitro были предложены В.А. Внучковой в 1988 году. Однако, разработанная методика оказалась громоздкой и не нашла широкого применения. В связи с этим, наши исследования были направлены на усовершенствование методики микроклонального размножения гороха в культуре in vitro.

Выбор экспланта и разработка схемы стерилизации

В результате наших исследований установлено, что при обработке семян Хлорамином Б в концентрации 5-10 % и экспозиции 30, 60, 90 стерильность эксплантов не превышала 20 %. У полученных проростков формировались недоразвитые корешки и листики. Растения имели низкую жизнеспособность и погибали через 7-10 дней. Увеличение концентрации до 15 % и времени экспозиции до 90 минут приводило к некротизации тканей семян и гибели проростков.

Применение в качестве стерилизующего агента Хлоргексидина в концентрации 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 % при экспозиции 30, 60 минут не обеспечивало стерильности материала. Максимальная стерильность на уровне 15 % отмечалась на варианте с обработкой 3,0 % Хлоргексидином и выдержкой семян в растворе в течение 60 минут.

Использование Белизны в концентрации 2 - 6 % при экспозиции семян 30-60 минут обеспечивало получение от 5 до 37 % стерильности эксплантов. Жизнеспособность стерильных регенерантов была низкой. Повышение концентрации до 8 и 10 % вызывало ожог тканей у 25 - 100 % эксплантов.

Стерильность вводимого материала от 20 до 40 % обеспечивала обработка семян гороха Анолитом в течение 30, 60, 90, 120 минут. Отмечено хорошее развитие эксплантов. Длина корешка достигала 4 - 8 см, наличие многочисленных боковых корешков, проростки имели насыщенную зеленую окраску, утолщенный стебель и достигали 5 - 6 см в высоту. Совместное применение Анолита и Католита также не позволило получить высокой степени стерильности эксплантов.

Изучение в качестве стерилизующего вещества ртутьсодержащего препарата Мертиолят в концентрации 0,01 и 0,02 % выявило его высокую эффективность. Стерильность материала удалость повысить до 90 %. Однако при дальнейшем культивировании эксплантов было отмечено ингибирующее действие Мертиолята на проростки гороха.

При обработке семян Доместосом в течение 30 минут на всех вариантах концентраций была отмечена тенденция роста стерильности. Так, при обработке семян 5, 7, 10 и 15 % раствором Доместоса стерильность составила 5, 10, 80 и 87 % соответственно.

Испытание хлорсодержащего препарата Ломаксхлор в концентрации 0,0075 и 0,015 % на всех вариантах экспозиции не дало положительных результатов, инфицированность материала составила 100 %. Увеличение концентрации до 0,03 % позволило получить 80 % стерильных эксплантов при обработке 60 минут. Стерильность материала при обработке 30 минут не превысила 20 %. При увеличении времени экспозиции до 90 минут (концентрация 0,03 %) наблюдался некроз тканей у 60 % эксплантов. Наиболее высокий стерилизующий эффект был отмечен при применении Ломаксхлора в концентрации 0,05 % и времени экспозиции 30 и 60 минут. Стерильность эксплантов составила 80-90 % соответственно. Аномалий в развитии проростков не наблюдалось.

Разработка метода стерилизации проростков, полученных в условиях термостата, изучаемыми веществами (Хлорамин Б - 10 % раствор, Ломаксхлор - 0,03-0,05 % раствор, Белизна - 4-6 % раствор, Доместос - 10 % раствор, Анолит, Мертиолят - 0,01% раствор) при экспозиции 30, 60 и 90 мин, положительного эффекта не дала. Экспланты на питательной среде имели 100 % инфицированность.

Использование всех изучаемых веществ для стерилизации апикальных верхушек растений гороха, выращенного в условиях закрытого грунта, показало, что только Ломаксхлор в концентрации 0,05 % при экспозиции 30 и 60 минут обеспечивал стерилизацию материала на уровне 60 и 85 % соответственно. На всех остальных вариантах стерильность эксплантов не превышала 15 %. В большинстве случаев наблюдался некроз тканей.

Таким образом, в результате исследований были разработаны параметры стерилизации эксплантов гороха при введении в условия in vitro, включающая в себя обработку апикальных меристем вегетирующих растений или зрелых семян 0,05 % раствором Ломаксхлора при экспозиции в течение 60 минут. Данная схема обработки обеспечивает стерильность материала на уровне 90 %.

Влияние состава питательной среды при микроразмножении

Для исследований была взята питательная среда с минеральной основой Мурасиге, Скуга (MS) с полной нормой минеральных солей и 1/2 нормы. Результаты исследований показали, что растения гороха на среде MS с полным комплексом минеральных солей при культивировании в течение 3-4 недель вытягивались в высоту до 4-6 см. Образование боковых побегов наблюдалось через 2 - 3 недели. При испытании питательной среды с 1/2 нормы минеральных солей регенеранты сохраняли насыщенную окраску, высота варьировала от 2 до 5 см. Микроклоны имели утолщенные стебли, хорошо развитые боковые побеги, что увеличивало коэффициент размножения посредством деления растения.

Следовательно, для культивирования микроклонов гороха оптимальной является питательная среда MS с половинным содержанием минеральных солей. Для уточнения гормонального комплекса было изучено 40 вариантов питательных сред с различным сочетанием и концентрацией гормонов.

Проведенные исследования показали, что добавление в среду кинетина в концентрации 1,0; 1,5; 2,0 мг/л действовало угнетающе на микроклоны - через 1,5 - 2 недели наблюдалось пожелтение и некроз тканей. Увеличение содержания 6-БАП от 1,0 до 2,0 мг/л в сочетании с ИУК, ИМК, НУК по 0,1 мг/л отрицательно влияло на рост и развитие растений гороха. Замена ауксинов на гиббереллин (0,1 мг/л) не вызывала быстрой гибели растений, но и роста отмечено не было. Микроклоны в течение 3-6 недель оставались без изменения.

Наличие в питательной среде небольшого количества 6-БАП в сочетании с различными ауксинами и гиббереллином выявило положительный эффект. Оптимальной оказалась концентрация 6-БАП 0,5 мг/л, обеспечивающая в течение 3-6 недель культивирования формирование многочисленных боковых побегов и выживаемость растений на уровне 80,4 - 96,2 %.

Сочетание гормонов 6-БАП + НУК (среда №3) способствовало слабому росту растений, их высота не превышала 6 см, образование боковых побегов не отмечалось. Добавление к 6-БАП гиббереллина стимулировало рост регенерантов и образование боковых побегов - 1-2 шт./растение, при этом коэффициент размножения не превышал 2.

Наилучшими вариантами оказались среды с 6-БАП (0,5 мг/л) + ИМК / ИУК (0,1 мг/л), где отмечался активный рост и формирование хорошо развитых боковых побегов (до 6) с короткими (до 0,5 см) междоузлиями.

На месте среза регенеранта в питательной среде с 6-БАП + ИУК образовывались каллусы плотной, зернистой структуры зеленого, а затем коричневого цвета. Формирование таких каллусов обеспечивало растениям большую площадь соприкосновения с питательной средой и, по-видимому, лучшее питание минеральными солями и гормонами. Об этом свидетельствовал внешний вид регенерантов и высокий коэффициент размножения, равный 4-5.

Дальнейшее увеличение концентрации 6-БАП до 1,0-2,0 мг/л при наличии прежних гормонов ожидаемого результата не дало. Растения после 2-3 недель культивирования выглядели слабыми, активно развивался некроз тканей, а затем гибель. растение горох продуктивность выращивание

На безгормональной среде (контроль) регенеранты после 1-2 недель культивирования достигали высоты 2-5 см, при дальнейшем культивировании рост растений останавливался из - за отсутствия гормонов. Образование боковых побегов не отмечалось, коэффициент размножения был равен 1.

Таким образом, оптимальной для микроразмножения гороха оказалась питательная среда на основе Мурасиге, Скуга (MS) с половинной нормой минеральных солей и гормональным комплексом, содержащим 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л и ИУК или ИМК в концентрации 0,1 мг/л.

Зависимость регенерационной способности от типа экспланта и его расположения на питательной среде

Анализ литературных источников показал, что при проведении биотехнологических исследований на горохе в качестве эксплантов для получения регенерантов использовали верхушки стеблей, междоузлия, корни и листовые пластинки (Юркова, Левенко, Птичникова, 1977; Внучкова, 1988; Ежова, Багрова, Гостимский, 1985; Уразбахтина, Мардамшин, 1990; Соболева, 2005). Для этого были исследованы питательные среды с большим содержанием гормонов (БАП, НУК, Кн, 2,4 - Д).

В качестве эксплантов нами использовались различные части асептических проростков гороха - апикальная часть стебля, часть стебля с пазушной почкой, и изучалось их расположение на разных питательных средах (вертикальное или горизонтальное).

В ходе исследований было отмечено, что при культивировании верхушечных частей растения с горизонтальным расположением на питательных средах и умеренным гормональным фоном 6-БАП (0,5 мг/л) + ИМК / ИУК (0,1 мг/л) коэффициент размножения равнялся 2 (рис. 1). Изучение повышенных концентраций гормонов положительных результатов не дало.

Рис. 1. Зависимость регенерационной способности эксплантов от гормонального комплекса и положения на питательной среде

Вертикальное расположение проростков (частичное погружение) на питательной среде с 6-БАП (0,5 мг/л) + ИМК (0,1 мг/л) дало возможность повысить выход микроклонов до 3 штук с одного введенного экспланта и до 4 штук при повышенной гормональной нагрузке среды: 6-БАП (5,0 мг/л) + НУК (0,2 мг/л).

Активный рост и развитие эксплантов был отмечен на стебле с пазушной почкой, помещенных горизонтально на поверхность питательной среды (БАП 5,0 + НУК 0,2). Коэффициент размножения на данном варианте среды равнялся 5, в то время как на среде с БАП 0,5 + ИМК 0,1 не превышал 2.

Культивирование частей стебля с пазушной почкой вертикально на среде не привело к повышению коэффициента размножения. На средах с повышенной гормональной нагрузкой отмечалось оводнение тканей, но гибели экспланта не наблюдалось. Коэффициент размножения был на уровне 2 регенерантов с одного введенного.

Таким образом, микроразмножение гороха можно вести на средах с различной гормональной нагрузкой, при этом необходимо учитывать положение эксплантов на среде. Для повышенных концентраций гормонов (БАП 5,0 + НУК 0,2) оптимальным является горизонтальное положение частей стебля, для умеренной (БАП 0,5 + ИМК 0,1) - вертикальное положение апикальной части стебля.

Реакция генотипа при микроразмножении

Влияние генотипа в культуре тканей выразилось в различном морфологическом развитии микроклонов. В условиях культуры тканей при микроразмножении у генотипов № 1065 - 02, Амур, Зенит наблюдался активный рост и развитие растений, их высота варьировала от 2 до 6 см. Количество побегов на 1 растение находилось в пределах 2 - 6 шт. Растения характеризовались более высокой степенью развития, побеги были утолщенные, кустистые. Коэффициент размножения достигал 5. В полевых условиях растения этих генотипов не превышают в высоту 70 см и относятся к короткостебельному (Амур, Зенит) и низкорослому (№ 377 - 02, № 1065 - 02) морфотипу. Сорт Зенит и № 1065 - 02 характеризуются безлисточковым, усатым типом. Селекционный номер 377 - 02 является узколистным. Сорта гороха Рамонский -77 и АМЗК - 99 - высокорослые (до 90 см), имеют среднюю облиственность, относятся к обыкновенному и детерминантному морфотипу, соответственно. В условиях культуры тканей растения активно росли в высоту. Их средняя высота находилась в пределах от 3 до 7 см. Количество побегов на одно растение не превышало 1 - 3 шт., коэффициент размножения составлял 2.

Таким образом, при микроразмножении гороха четко прослеживается роль генотипа. В условиях in vitro микроклоны соответствовали морфологическим характеристикам растений, выращенных в полевых условиях. Наиболее высокий выход хорошо развитых микроклонов с одного введенного растения обеспечивают низкорослые (короткостебельные) и усатые генотипы.

Размножение и укоренение регенерантов в условиях in vitro

Развитие растений и скорость размножения также определялась генотипическими особенностями материала (табл. 3).

Таблица 3 - Результаты микроразмножения разных генотипов гороха

Селекционный материал	Получено микроклонов, шт
	1 пассаж	2 пассаж	3 пассаж
Рамонский 77	40	75	130
377 - 02	34	120	315
Амур	35	112	273
Зенит	38	118	280
АМЗК - 99	41	74	144
1065 - 02	35	105	287

Развитие микроклонов линий 377 - 02, 1065 - 02 и сортов Зенит, Амур происходило активно, что позволило после 3 пассажа получить 315, 287, 280 и 273 растения, соответственно. Высокорослые (Рамонский - 77) и детерминантные (АМЗК - 99) генотипы имели достаточную активность размножения в условиях in vitro. Так, после третьего пассажа все сорта имели достаточное количество размноженного материала.

При индуцировании ризогенеза у размноженных микроклонов выявлено, что максимальное образование корней (84 %) вызывает НУК в концентрации 1,5 мг/л (табл.4). Добавление НУК + ИУК в концентрации 0,2 мг/л в питательную среду способствовало образованию корней у 40 % регенерантов через 20-30 дней.

Наличие в питательной среде ИУК и ИМК не способствовало активному образованию адвентивных корней у микроклонов гороха.

Таблица 4 - Влияние физиологически активных веществ на формирование корней у клонов гороха

Ростовое вещество	Концент- рация, мг/л	Количество введенных эксплантов, шт	Количество укорененных эксплантов, %	Количество и длина корней, шт / см	Высота растения, см
НУК	0,5	50	56	2-3/ 1-2	2-5
	1,0	50	18	1-2/1-2	2-3
	1,5	50	84	2-3/ 2-3	4-6
	2,0	50	0	0	0
ИУК	0,5	50	0	0	0
	1,0	50	20	1-2/1-2	3 -4
НУК+ИУК	0,2+0,2	50	40	2-3/ 1-2	2-5
	0,5+0,5	50	20	2-3/1-2	2-3
	1,0+1,0	50	0	0	0
ИМК	1,0	50	0	0	0
без гормонов	-	50	4	1-2/1-2	2-3
НСР05=1,42

Результаты проведенных исследований явились основанием для усовершенствования метода клонального размножения на основе прямой регенерации гороха в условиях in vitro. Полученная методика микроразмножения состоит из следующих этапов:

- подбор исходного материала и введение в культуру;

- микроразмножение;

- получение пробирочных растений с корнями;

- пересадка в условия закрытого грунта.

В результате исследований было размножено две селекционно-ценные по ряду признаков линии (№ 377-02, № 1065-02). Данный материал был передан селекционерам для проведения гибридизации и создания форм гороха с новыми признаками, что может способствовать ускорению процесса создания и внедрения новых сортов в два раза при меньших затратах труда и времени.

5. ЭМБРИОКУЛЬТУРА В СИСТЕМЕ IN VITRO

Влияние стерилизующих агентов на стерильность и выживаемость эксплантов. Применение в качестве стерилизующих агентов Хлорамина Б и Хлоргексидина в различных концентрациях и при различных экспозициях обработки (30, 60, 90 минут) не обеспечивало стерильности материала и приводило к некротизации тканей и гибели эксплантов.

Использование Белизны в концентрации 2 и 4 % при экспозиции эксплантов 30 и 60 минут позволило получить 20 % стерильность материала. Повышение концентрации до 8 % и 10 % увеличивало стерильность до 35 %, но приводило к ожогу тканей эксплантов и оказывало угнетающее действие на рост и развитие регенерантов. Аналогичный эффект наблюдался при применении Доместоса, хотя стерильность материала достигала 80 %.

Обработка зародышей гороха Анолитом в течение 30, 60, 90 и 120 минут не позволила достичь высокого стерилизующего эффекта. Стерильность эксплантов достигала 25 %.

Изучение в качестве стерилизующего вещества ртутьсодержащего препарата Мертиолят выявило его высокую эффективность. Стерильность материала удалость повысить до 80 %. Однако при дальнейшем культивировании эксплантов было отмечено ингибирующее действие Мертиолята. По истечении 10 - 20 дней у большинства регенерантов отмечалось оводнение и некроз тканей. Высокий стерилизующий эффект наблюдался при применении Ломаксхлора в концентрации 0,05 % и времени экспозиции 60 минут. Стерильность эксплантов достигала 90 %. Аномалий в развитии зародышей не замечено.

Таким образом, наилучший стерилизующий эффект наблюдался при применении раствора Ломаксхлора в концентрации 0,05 % и времени экспозиции 60 минут.

Зависимость регенерационной способности зародышей от стадий их развития

В связи с тем, что незрелые зародыши гороха имеют небольшие размеры и вычленение их без нанесения травм затруднено, введение в культуру производилось семязачатками.

Проведенные исследования показали, что 3 - 5 дневные зародыши в условиях in vitro формировали до 3,8 % нормально развитых проростков (рис. 2).

Рис. 2. Влияние возраста зародышей на получение жизнеспособных проростков гороха

Количество полученных проростков из 5 - 8 дневных зародышей составило 16,8 %, в том числе нормально развитых - 10,5 %. Частота регенерации зародышей возраста 8 - 12 дней после опыления была на уровне 33,4 %, из которых 26,9 % нормально развитых. Максимальная частота регенерации (39,8 %) была отмечена у зародышей старше 12 дневного возраста. Нормально развитые проростки формировались в данном варианте у 28,9 % зародышей. Развитие эксплантов шло быстро, через 14 - 20 дней проростки имели четко выраженный корень и стебель.

Таким образом, применение метода эмбриокультуры дает возможность получать нормально развитые микроклоны из незрелых зародышей разного возраста (3 - 12 дней и более от опыления), причем большую склонность к дальнейшему развитию в условиях культуры тканей проявляли зародыши старших возрастов.

Влияние гормонального состава питательной среды на регенерационную способность эксплантов

Для определения оптимального гормонального комплекса питательной среды было изучено 10 вариантов питательных сред с различными сочетаниями и концентрациями фитогормонов. Установлено, что наибольшая частота образования регенерантов (18,6 %) наблюдалась на питательной среде с добавлением 6 - БАП, ГК, Кин, ИМК по 0,1 г/л. На среде, содержащей 6 - БАП (0,2 мг/л), ГК (1,0 мг / л), образовывалось до 7,1 % нормально развитых регенерантов. При добавлении в питательную среду ИМК или ИУК в концентрации 0,1 мг/л при одинаковом содержании 6 - БАП (0,2 мг/л), ГК (1,0 мг/л) количественных и качественных различий замечено не было. Регенеранты были нормально развиты, имели насыщенную окраску и характерные растению гороха признаки.

Одновременное присутствие в питательной среде 6 - БАП в концентрации 0,5 мг/л и 1,0 мг/л гиббереллина стимулировало лишь каллусообразование в культуре незрелых зародышей. На средах, содержащих 6 - Б АП (0,5 мг/л), ИМК / ИУК (0,1 мг/л), шло активное нарастание каллусной массы с одновременным развитием регенерантов.

Образование регенерантов на питательной среде с добавлением 1,0 мг/л 6 - БАП, 0,1 мг/л ГК и ИМК / ИУК достигнуто не было. Наблюдалось оводнение тканей эксплантов и постепенная их гибель.

На среде, содержащей 6 - БАП (0,5 мг/л), ГК (0,1 мг/л), кинетин (0,5 мг/л), образовывалось 4,3 % аномально развитых регенерантов.

На контрольном варианте (без гормонов) наблюдалось единичное развитие эксплантов. Причем развитие шло у зародышей старше 12 дней после опыления. Это подтверждает мнение А. Атанасова (1993) о том, что, чем моложе зародыш, тем выше требования к гормональному составу питательной среды.

В связи с этим при изучении влияния гормонального состава питательной среды для культивирования незрелых зародышей была выделена питательная среда с гормональным комплексом 6 - БАП : ГК : ИМК / ИУК (по 0,1 мг/л), на которой формировались нормально развитые, жизнеспособные регенеранты.

Определение лимитирующих факторов культивирования незрелых зародышей гороха (стадии развития эксплантов, их стерилизация при введении в культуру тканей, состав питательной среды) позволило разработать режимы культивирования незрелых зародышей в системе in vitro.

Использование разработанных режимов культивирования незрелых зародышей гороха позволяет создавать новый исходный материал для селекции путем получения различных гибридов. Часто невозможность осуществления некоторых скрещиваний связана с приостановкой развития гибридного зародыша, что может быть обусловлено его ранней гибелью или дегенерацией эндосперма (Атанасов, 1993).

В нашей работе по внутривидовой гибридизации использовались сорта и линии гороха разного происхождения (wi 7106 - США, VSB 128.132 - Германия). В проведенных исследованиях эффективность гибридизации находилась на невысоком уровне - до 7 %. Увеличить жизнеспособность зародышей удалось с применением эмбриокультуры.

В опыте было проведено две гибридные комбинации скрещивания (VSB 128.132 х Рамонский-77 и wi 7106 х АМЗК-99). В результате применения культуры незрелых зародышей и дальнейшего микроразмножения на горохе было получено 23 и 31 растений. После самоопыления в условиях закрытого грунта получено 58 семян от комбинации скрещивания VSB 128.132 х Рамонский-77и 69 семян от комбинации скрещивания wi 7106 х АМЗК-99. Семена были зеленого и розового цвета. Полученные семена были переданы селекционерам для дальнейшей селекционной работы.

Таким образом, применение культуры незрелых зародышей может быть широко использовано для создания новых селекционных линий с хозяйственно-ценными признаками.

Восстановление всхожести длительно хранившихся семян методом эмбриокультуры

Проведенные нами попытки получения растений из длительно хранившихся семян гороха с помощью культуры in vitro показали повышение их всхожести, что может способствовать восстановлению селекционного материала ценных сортов.

Так, у 5 изучаемых селекционных номеров (Рамус, Зенит, Амур, Рамонский-77, № 1065) лабораторная всхожесть колебалась от 12 % до 82 % в зависимости от срока хранения.

В литературных источниках указано, что всхожесть значительно падает уже после 5 лет хранения. В наших исследованиях даже после 7 и 10 лет хранения семена гороха имеют всхожесть на уровне 79 % и 54 % соответственно. Образец семян сорта Рамонский-77, хранившийся 18 лет, имел показатели всхожести до 12 %. По-видимому, сохранение всхожести длительно хранившихся семян связано в большей степени с генотипическими особенностями и условиями произрастания растений.

При введении в условия in vitro длительнохранившихся семян были получены нормально развитые проростки. Прорастание семян наблюдалось в пределах 38 - 95 %. Средняя длина корешка достигала 3-6 см. Наблюдалось наличие многочисленных боковых корешков. Проростки имели насыщенную зеленую окраску листьев и стебля. Высота растений достигала 5-6 см. Наличие уродливых или недоразвитых проростков отмечено не было.

Данные показатели свидетельствуют о том, что метод эмбриокультуры позволяет получать нормально развитые проростки из длительно хранившихся семян и повысить показатель всхожести практически в два раза. Это объясняется тем, что в условиях in vitro факторы температуры, влажности и освещенности искусственно регулируются и являются оптимальными. Кроме того, наличие экзогенного минерального и гормонального комплекса питательной среды также обеспечивают благоприятные условия для прорастания семян и нормального развития проростков.

Таким образом, при определении режимов культивирования незрелых и зрелых зародышей гороха было установлено, что:

· наилучший стерилизующий эффект наблюдался при применении раствора Ломаксхлора в концентрации 0,05 % и времени экспозиции 60 минут;

· нормально развитые микроклоны из незрелых зародышей разного возраста (3 - 12 дней и более от опыления), причем большую склонность к дальнейшему развитию в условиях культуры тканей проявляли зародыши старших возрастов;

· для культивирования незрелых зародышей оптимальной является питательная среда с гормональным комплексом 6 - БАП : Гк : ИМК / ИУК (по 0,1 мг/л), на которой формировалось 18,6 % нормально развитых, жизнеспособных регенерантов и применение культуры незрелых зародышей может быть широко использовано для создания новых селекционных линий с хозяйственно-ценными признаками.

ВЫВОДЫ

1. Влияние экзогенных факторов на возрастные периоды развития растений в онтогенезе от заложения вегетативных органов до формирования репродуктивной сферы и зрелых семян определяет особенности формирования жизнеспособных растений-регенерантов в условиях in vitro. Это способствует разработке методов биотехнологии для создания новых форм растений и повышает результативность селекционной работы.

2. Морфогенетические особенности возрастной периодизации жизненного цикла гороха посевного углубляют представления о природе онтогенеза. Установлена продолжительность возрастных состояний и взаимосвязь их с этапами органогенеза и фазами развития растения. Диагностика растительных тканей в онтогенезе дает возможность отбирать ценные морфотипы растений при разработке новых биотехнологических и селекционных методов.

3. Взаимосвязь возрастных состояний с органообразовательными процессами выражается в сопряжении I этапа органогенеза с состоянием проростка и появлением всходов. Во время ювенильного, имматурного и виргинильного состояния (II и III этапы органогенеза) у растений гороха идет активное нарастание главного и боковых побегов. С IV по XII этапы ограногенеза связаны с генеративным периодом развития и затрагивает репродуктивный цикл развития: формирование мужского и женского гаметофитов, самоопыление, образование, налив и созревание семян. Затем следует постгенеративный период, соответствующий отмиранию растений.