Размещено на http://www.allbest.ru/

ИММУНОБИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КРОВИ ПТИЦЫ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА

Специальности: 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

ОРЕХОВ ДМИТРИЙ АНДРЕЕВИЧ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2007

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии и кафедре биологической химии ФГОУ ВПО “Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины”

Научные руководители:

доктор биологических наук Сухинин Александр Александрович

доктор ветеринарных наук, профессор Конопатов Юрий Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Розенгарт Евгений Викторович

доктор ветеринарных наук, профессор Калишин Николай Михайлович

Ведущая организация - ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства».

Защита диссертации состоится «22» февраля 2008 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО “Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины” по адресу: 196084, Санкт-Петербург, Черниговская ул., 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО “Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины”.

Автореферат разослан «____»________2008 года и размещён на сайте http://spbgavm.ru «____»________2008 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Белова Л.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Колибактериоз птиц - инфекционная болезнь всех видов и возрастов птиц, которую в большинстве случаев можно охарактеризовать, как септицемию. Возбудителем является патогенная Escherichia coli (Кэлнек Б.У., 2003).

Болезни, вызываемые энтеробактериями, являются одной из ключевых проблем промышленного птицеводства. Концентрация огромного числа особей в одном помещении приводит к стрессовым состояниям, что усиливает вирулентность условно-патогенной микрофлоры, и, как следствие, развитие инфекционного процесса (Бочкарёв В.Н., 1992; Виноходов В.О., 2000; Соколова Л.Н. и др., 2005; Кузьмин В.А. и др., 2006; Джавадов Э.Д., 2006; Борисенкова А.Н., 2007).

В комплексе мер борьбы с инфекционными болезнями, включающими соблюдение ветеринарно-санитарных правил, условий содержания и кормления, вакцинопрофилактика занимает ведущее место (Соколов В.Д., 1989; Садовников Н.В., 1995; Бурдейный В.В., 1998; Бакулин В.А., 2006). Для профилактики колибактериоза в настоящее время применяются вакцины: инактивированная вакцина против колибактериоза птиц, вакцина инактивированная сорбированная против колибактериоза птиц, ассоциированная инактивированная сорбированная вакцина против колибактериоза и пастереллеза птиц (Романов Е.А., 2005). Имеется много сообщений об успешном приготовлении и применении инактивированных вакцин против колибактериоза птиц из серотипов О78:К80 и О2:К1 (Arp L. H., 1987; Lynne A.M. et al., 2006; Виноходов В.О., 2000).

В технологии изготовления инактивированных вакцин одно из главных мест отводится блокированию инфекционной активности микроорганизмов. С этой целью наиболее широко применяется формалин. Однако, одним из возможных подходов к решению вопроса инактивации возбудителя может быть использование азиридинов, а именно аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) (Бородина О.В., 2005; Ширяев Ф.А., 2005; Русалеев В.С., 2005).

При изготовлении инактивированной вакцины против колибактериоза в качестве адъюванта применяют гидроокись алюминия, которая наряду с положительными показателями имеет и ряд недостатков. В тоже время многочисленные исследования показали целесообразность использования в качестве адъюванта липосом, так как вакцины на их основе обладают более выраженной безвредностью, антигенной и иммуногенной активностью (Шанская А.И. и др.,1997; Сухинин А.А., 2003; Придыбайло Н.Д. и др., 2006).

Цель исследований - разработка инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур и изучение иммунобиохимических характеристик крови при её применении.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

-разработать режим инактивации E. coli, используя аминоэтилэтиленимин; курица вакцина липосомальный колибактериоз

-изготовить экспериментальные образцы инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур;

-сравнить биологические характеристики инактивированной липосомальной вакцины и гидроокись алюминиевой формолвакцины против колибактериоза кур;

-определить иммунизирующую дозу, напряжённость и продолжительность иммунитета после применения вакцины на цыплятах;

-определить влияние инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур на иммунобиохимические показатели сыворотки крови кур.

Научная новизна работы. В результате проведённых исследований нами впервые определены оптимальные параметры и режим инактивации E. coli аминоэтилэтиленимином.

Впервые разработана экспериментальная инактивированная липосомальная вакцина против колибактериоза птиц с использованием штамма E. coli №389 (О78), полученного из ФГУ “ВГНКИ”. Показано, что данная вакцина безвредна, обладает выраженной антигенной и иммуногенной активностью. Установлено, что после вакцинации липосомальной вакциной содержание общего белка, гамма-глобулинов, а также титр специфических антител в сыворотке крови цыплят увеличивались в динамике и были достоверно выше, чем при иммунизации гидроокись алюминиевой формолвакциной. Получено положительное решение формальной экспертизы по заявке на патент РФ № 016893 от 11.07.2007 (приоритет от 25.04.2007).

Практическая значимость работы.

Разработана эффективная экспериментальная инактивированная липосомальная вакцина против колибактериоза на основе штамма E. coli №389 (О78).

На основании полученных результатов разработана нормативно-техническая документация по изготовлению и контролю инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур.

Материалы диссертации используются в учебном процессе по курсу “Ветеринарная микробиология и иммунология” и курсу “Биологическая химия” в ФГОУ ВПО “Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины”.

Апробация работы. Основные материалы исследований диссертационной работы доложены и обсуждены на:

· Всероссийской научно-практической конференции ”Ветеринарная медицина - теория, практика и обучение” (Санкт-Петербург, 2006, 2007);

· Научно-практической конференции ”Болезни птиц в промышленном птицеводстве. Современное состояние проблемы и стратегия борьбы” (Санкт-Петербург, 2007);

· Международном научно-практическом конгрессе ”Актуальные проблемы ветеринарной медицины” (Санкт-Петербург, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ инактивации E. coli аминоэтилэтиленимином.

2. Использование липосом при конструировании вакцины против колибактериоза кур.

3. Влияние инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза на иммунобиохимические характеристики крови цыплят.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения. Список использованных литературных источников включает 224 наименования, в том числе 100 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 12 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Экспериментальна часть работы была выполнена в течение 2004 - 2007 гг. на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии и кафедре биологической химии ФГОУ ВПО “Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины”.

Штамм микроорганизма. В работе использовали штамм Escherichia coli №389 (серовар О-78), полученный из ФГУ “ВГНКИ” (г Москва).

Подопытные животные. В экспериментальных исследованиях были использованы 28-сут. цыплята кросса “Радонит”. Определена безвредность, антигенная и иммуногенная активность инактивированной липосомальной вакцины, проанализирована динамика изменений содержания общего белка и белковых фракций в сыворотке крови птицы после вакцинаций.

Вирулентность культуры E. coli определяли путём постановки биопробы на белых мышах в соответствии с методическими указаниями Минсельхоза России (2000).

Питательные среды, краски. При проведении исследований применяли общепринятые питательные среды и краски. Для культивирования кишечной палочки использовали МПА, МПБ.

Проведение инактивации. Для отработки режима инактивации возбудителя E. coli аминоэтилэтиленимин вносили в бактериальную суспензию, исходя из концентрации бактерий в определённом объёме, а также процентного содержания основного активного вещества в водном растворе инактиванта.

Характеризуя кинетические закономерности гибели микроорганизмов, производили расчёт постоянной (константы) скорости инактивации (k) по формуле экспоненты (Мейнелл Д., Мейнелл Э., 1967):

K- константа скорости инактивации (ч^-1);

T- время инактивации (ч);

X₀ - исходная концентрация живых микробных клеток (Ig КОЕ/см³);

X_i - остаточное количество живых микробных клеток (Ig КОЕ/см³);

отсюда:

С учётом показателя k производили расчёт времени инактивации микробной суспензии (t) до определённого уровня остаточного вирулентного материала по формуле (Мейнелл Д., Мейнелл Э., 1967):

t= где

K- константа скорости инактивации (ч^-1);

T- время инактивации (ч^-1);

X₀ - исходная концентрация живых микробных клеток (Ig КОЕ/см³);

X_пр - прогнозируемая концентрация живых микробных клеток после инактивации (Ig КОЕ/см³);

Определение концентрации микробных клеток. Количество КОЕ в бактериальных суспензиях определяли визуально по стандарту (эталону) мутности, в соответствии с инструкцией по применению, и путём высева на плотные питательные среды.

О вирулентности штамма кишечной палочки для мышей и кур судили по LD₅₀ и выражали в КОЕ/мл. Белых мышей заражали подкожно, а кур внутрибрюшинно в объёме 0,5 см³ десятикратными разведениями (10^-1-10^-9) суточных бульонных культур кишечной палочки в забуферном физиологическом растворе.

Световую микроскопию бактериальных клеток проводили под окуляром микроскопа марки МБИ-15 "Биолам" при увеличении х700 раз в мазках, фиксированных на предметном стекле и окрашенных различными методами.

Электронно-микроскопическое исследование нативных и инактивированных бактерий проводили методом позитивного окрашивания уранилацетатом. Препараты просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100C (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 100 кв.

Методы бактериологических исследований.

С целью выделения микроорганизмов рода Escherichia, после заражения вакцинированных и не вакцинированных птиц, проводили морфологические, культуральные, иммунобиохимические, серологические исследования культур E. coli в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» (2000).

Методы получения и контроля лабораторных серий инактивированной вакцины.

Опытные серии жидкой формы моновалентной инактивированной липосомальной вакцины были приготовлены из антигенов клеток E. coli штамма №389 (О78), инактивированных формальдегидом, или 2% раствором аминоэтилэтиленимина, в течение 24 часов при температуре 37^оС и соединенных с адъювантом - липосомами или гелем гидроокиси алюминия. Липосомы смешивали в различных сочетаниях с инактивированными бактериальными антигенами (1:5, 1:10, 1:20).

Сыворотку крови получали от всех цыплят подопытной (n = 10) и контрольной групп (n = 10).

Контроль качества липосом. Контроль качества стерильности липосомальных суспензий осуществляли в соответствии с ГОСТ 28085-90 “Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности”.

Стабильность вакцины определяли по характеру изменений иммуногенной активности вакцинных препаратов при хранении в различных режимах: при температуре 37^оС в течение 30 суток и при 2 - 4^оС в течение 6 и 12 месяцев.

Определение стерильности готовой вакцины и полноты инактивации бактериальных суспензий проводили в соответствии с ГОСТ 28085-90 “Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности”. При проверке на бактериальное загрязнение проводили посев на среды: Эндо, МПА, МПБ, МППБ, а при исследовании на грибную контаминацию - на среду Сабуро. О стерильности судили по отсутствию роста микроорганизмов на питательных средах.

Испытуемые образцы вакцины проверяли на контаминацию микоплазмами путем высева в пробирки со средой Эдварда (жидкая, полужидкая и плотная). Об отсутствии роста микоплазм в среде судили по сохранению цвета среды.

Определение безвредности. Безвредность вакцины определяли по ОСТ 9380-076-00008064-96 “Препараты ветеринарные. Методы определения безвредности. Основные положения”. Сущность метода заключается в выявлении реактогенного действия вакцины на привитых цыплятах по клиническому состоянию и сохранности подопытной птицы.

Антигенную активность вакцины оценивали методом серологических исследований сыворотки крови иммунизированных птиц. Напряженность иммунитета оценивали с помощью реакции агглютинации (РА). С этой целью через определенные интервалы времени от иммунизированных птиц брали кровь, получали сыворотку и исследовали на содержание антител.

Иммуногенные свойства инактивированных вакцин изучали в лабораторных опытах на белых мышах и цыплятах. Животных иммунизировали однократно. Через 21 сутки после вакцинации всех иммунизированных и контрольных (не вакцинированных) животных заражали E. coli штамм №389 (О78). Об уровне специфической защиты судили по отсутствию у привитых птиц клинических признаков, характерных для колибактериоза.

Влияние вакцинации на биохимические показатели сыворотки крови изучали в лабораторных опытах на цыплятах. Вакцину вводили птице внутримышечно, однократно. Для выявления иммунобиохимических реакций организма у птиц брали кровь до кормления, непосредственно перед иммунизацией, а затем через 5, 10, 15 и 25 дней после вакцинации.

В сыворотке крови вакцинированных цыплят определяли концентрацию общего белка биуретовым методом, соотношение белковых фракций - нефелометрическим методом по Оллу и Маккорду.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методом математической статистики, предложенным Ашмариным И.П. (2000) и с помощью программ Microsoft Excel 97 и Statistika/W v.5.773, SPSS v.7.58.

Цифровой материал диссертации обработан по критерию Стьюдента для проверки достоверности различий. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при Р 0,05 (Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Инактивация клеток Escherichia coli

В качестве исходного материала использовали суспензию клеток E. coli штамм №389 (О78) с концентрацией 210¹⁰ КОЕ/см³. Инактивацию осуществляли при температуре 37⁰С в режиме постоянного перемешивания. Концентрацию микробных клеток определяли при помощи стандарта мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Для инактивации клеток E. coli использовали аминоэтилэтиленимин с конечной концентрацией 2% по активному веществу. Данные фиксировали через каждый час путём титрования отбираемых проб с чашек Петри со средой Эндо.

Кинетическая кривая, построенная на основании данных эксперимента, наглядно демонстрирует процесс инактивации E. coli.



Рис. 1 Жизнеспособность клеток E. coli при воздействии 2% АЭЭИ

Прямолинейная форма её указывает на экспоненциальный характер гибели бактерий.

Константу скорости инактивации (k) определяли по формуле экспоненты (Д. Мейлелл, Э. Мейлелл, 1967).

Таким образом, константа скорости инактивации составила -2,95 час^-1.

Необходимо отметить, что величина эмпирического коэффициента является справедливой только для 2% концентрации аминоэтилэтиленимина. С изменением концентрации E. coli №389 (O78) в суспензии, равно как и инактиванта изменятся как продолжительность, так и константа скорости инактивации.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что при изготовлении инактивированного антигена E. coli №389 (О78) инактивацию микробных клеток целесообразно проводить 2% аминоэтилэтиленимином в течение 5-6 часов при температуре 37°С.

2.2.2. Влияние аминоэтилэтиленимина и формалина на морфологию бактерий E. Coli

Морфологические свойства интактных и инактивированных бактерий исследовали с помощью световой и электронной микроскопии. Сравнительный анализ методом световой микроскопии, окрашенных по Граму препаратов нативных и инактивированных аминоэтилэтиленимин культур E. сoli №389 (О78), выявил различия в форме и размерах бактериальных клеток. В мазках, приготовленных из инактивированных клеток, наряду с характерными для данного вида возбудителя палочками, отмечали структуры округлой формы более бледной окраски, которые, по всей вероятности, представляли собой пустые «клеточные тени», оставшиеся после разрушения клеток.

Результаты сравнительного электронно-микроскопического анализа морфологических свойств клеток E. coli №389 (О78) до и после инактивации формалином и аминоэтилэтиленимином представлены на рисунках 2, 3, 4 соответственно.

Установлено, что морфологические свойства клеток E. coli №389 (О78) в контрольных препаратах соответствуют норме (рис.2), о чем свидетельствует характерная форма и размеры клеток, а также наличие поверхностных структур: часть клеток снабжена пилями и жгутиками. Клетки не имели деструктивных изменений и большая часть популяции (около 97% клеток) находилась в физиологически активном состоянии.

Рис. 2 Морфологически интактные клетки E. сoli №389 (О78)

Увеличение 20000.



Рис. 3 Инактивированные формалином Рис.4. Инактивированные

клетки E. coli №389 (О78). аминоэтилэтиленимином

Контроль - увеличение 20000. клетки E. coli №389 (О78).

Увеличение 20000.

На электронограмме (рис.3) видны деструктивные изменения формы клеток, происходящие в результате сжатия белково-рибосомального компонента цитоплазмы и его преобразования в электронно-плотные включения. Деструкция бактерий сопровождалась уменьшением размеров и повышенной агрегацией клеток.

Морфологические свойства клеток E. coli №389 (О78), инактивированных аминоэтилэтиленимином, свидетельствуют о потери ими физиологической активности и переходе в электронно-плотное состояние. У большинства бактериальных клеток наблюдаются деструктивные изменения, что проявляется, в основном, в отслоении наружной и цитоплазматической мембран (рис.4).

Таким образом, посредством электронной микроскопии были выявлены различия в форме, размерах и ультраструктуре клеток E. coli №389 (О78), до и после воздействия инактиванта.

2.2.3. Изготовление моновалентной инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птиц

Получаемый вакцинный препарат представляет собой суспензию, содержащую инактивированный аминоэтилэтиленимином антиген бактерии E. coli штамм №389 (О78), адсорбированный на липосомальных везикулах. Вместо штамма E. coli №389 (О78) может быть использован и другой патогенный штамм E. сoli, вызывающий колибактериоз птиц.

Вакцину готовили по следующей методике: 0.45 л суспензии клеток E. coli штамм №389 (О78) с концентрацией 210¹⁰ КОЕ/см³ смешивали при температуре 37⁰С в режиме постоянного перемешивания с 50 мл 20% раствора аминоэтилэтиленимина в течение 20 мин. Полученный препарат содержал антиген и не содержал жизнеспособных клеток бактерий. 20 мл препарата, содержащего антиген, смешали с 2.0 г суммарных фосфолипидов растительного лецитина, 0.5 г бутилоксианизола и 0.5 г лактозы. Смесь гомогенизировали в течение 10 минут при скорости вращения 700 g и температуре смеси 22 - 24⁰ С, после чего использовали для вакцинации.

Препарат вводили внутримышечно в грудную или бедренную мышцу птицы в дозе 0,5 мл на 1 голову.

Вакцину проверяли на безвредность, антигенную и иммуногенную активность. Напряженность поствакцинального иммунитета определяли через 7, 28, 45, 60, 90 суток после прививки в реакции агглютинации.

2.2.4. Результаты сравнительной оценки инактивированной липосомальной вакцины и гидроокись алюминиевой формолвакцины против колибактериоза птицы

Установили, что липосомальная вакцина против колибактериоза птицы была безвредна и не вызывала патологоанатомических изменений в органах и тканях при введении 10-кратной дозы. Она обладала выраженной антигенной активностью и индуцировала в организме иммунизированной птицы образование специфических антител. Динамика формирования иммунитета представлена в таблице 1.

Таблица 1

Уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированных цыплят (титры антител в log₂, M m).

№№ группы	Дни исследований после иммунизации
	7	28	45	60	90
1	6,10.2	9,50,3	9,90,2**	9,8**	9,80,2**
2	5,40,5	7,70,5	7,40.5	7,2	6,80,3
3	Н/О	Н/О	Н/О	0,50,1	0,70,1

** По сравнению с контролем вакцины.

Примечание. Н/О - не обнаружено.

Группа 1 - цыплята, вакцинированные инактивированной липосомальной вакциной.

Группа 2 - цыплята, вакцинированные ГОА формолвакциной.

Группа 3 - контроль.

Обе вакцины были антигенно-активными и формировали напряженный иммунитет у подопытной птицы в течение всего периода наблюдения.

В сравнительном аспекте было изучено проявление местных тканевых реакций на внутримышечное введение вакцин (таблица 2, 3). Контроль клинического состояния птицы в ходе эксперимента не выявил существенных отклонений общего и местного характера. Не обнаружено отклонений в её поведении при введении 10-кратной дозы препарата.

Таблица 2

Оценка места введения вакцин против колибактериоза через 10 суток после инъекции (n = 10)

№№ группы	Видимые изменения в местах введения вакцин, %
	Степень поражения	Следы вакцины	Гранулёмы	Отёчность
1	легкая	Н/О	Н/О	20
2	средняя	60	Н/О	40

Примечание:

группа 1 - цыплята, вакцинированные инактивированной липосомальной вакциной;

группа 2 - цыплята, вакцинированные ГОА формолвакциной;

Н/О - не обнаружено

Таблица 3

Оценка места введения вакцин против колибактериоза через 90 суток после инъекции ( n = 10 )

№№ группы	Видимые изменения в местах введения вакцин,%
	Степень поражения	Без видимых изменений	Незначит. кол-во. вакцины	Фибрин
1	легкая	Н/О	Н/О	Н/О
2	средняя	40	60	Н/О

Примечание:

группа 1 - цыплята, вакцинированные инактивированной липосомальной вакциной;

группа 2 - цыплята, вакцинированные ГОА формолвакциной;

Н/О - не обнаружено

После вакцинации в течение первых 5 суток проводили убой птиц и визуально оценивали место инъекции. Установлено, что при использовании липосом местные реакции тканей были минимальными. Нами установлено отсутствие воспаления и инкапсулированных остатков вакцины, лёгкое побледнение тканей на площади 0,7 см в диаметре.

В случае использования гидроокиси алюминия в качестве адъюванта регистрировали: отёчность, побледнение окружающих тканей, гиперемию в зоне воспалительной реакции до 2 см в диаметре вокруг места инъекции, отмечали присутствие остатков инкапсулированной вакцины.

Поствакцинальной реакции не наблюдали. Все птицы были клинически здоровы.

Коэффициент иммунологической эффективности инактивированной липосомальной вакцины при внутримышечном способе вакцинации цыплят, в лабораторных условиях спустя 28 дней после иммунизации составлял 100%. При применении ГОА формолвакцины коэффициент иммунологической эффективности был - 95%.

От всех павших после заражения патогенными штаммами птиц была выделена исходная культура кишечной палочки.

2.2.5. Влияние инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы на иммунобиохимические показатели сыворотки крови цыплят подопытной и контрольной групп

Исследования иммунобиохимических показателей сыворотки крови цыплят показали, что под влиянием липосомальной вакцины концентрация общего белка в сыворотке крови цыплят возросла на 4,31% по сравнению с контролем, под влиянием ГОА формолвакцины в тот же период этот показатель был выше контроля на 10,45% (Р>0,05).

В контрольной группе цыплят с возрастом отмечена тенденция снижения концентрации гамма - глобулинов сыворотки крови, тогда как в сыворотке крови вакцинированных цыплят установлено достоверное увеличение концентрации этой фракции общего белка, начиная с 5-го дня после вакцинации. Так, концентрация гамма - глобулинов сыворотки крови цыплят, вакцинированных ГОА формолвакциной, на 25 день составила 10,08 ± 0,93 г/л, против 6,96 ± 0,64 г/л - в контроле (Р<0,05). Концентрация гамма - глобулинов сыворотки крови цыплят, вакцинированных инактивированной липосомальной вакциной, оказалась максимальным в этот возрастной период - 12,23 ± 1,20 г/л (Р<0,05). Таким образом, под влиянием вакцин происходило перераспределение фракций общего белка в сторону увеличения синтеза гамма - глобулинов (рис. 5).



Рис. 5 Содержание гамма - глобулинов в сыворотке крови цыплят

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод инактивации штамма E. coli №389 (О78), обеспечивающий гибель бактерий при сохранении их антигенных и иммуногенных свойств. Изучено в сравнительном аспекте влияние аминоэтилэтиленимина и формалина на морфологию клеток штамма E. coli №389 (О78).

2. Установлено, что инактивация клеток штамма E. coli №389 (О78) аминоэтилэтиленимином происходит прямолинейно, т.е. с постоянной скоростью.

3. Разработан метод изготовления инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур. Определена иммунизирующая доза, напряжённость и продолжительность иммунитета после применения вакцины на цыплятах.

4. При использовании вакцины с адъювантом на основе липосом местная реакция тканей при иммунизации цыплят была минимальной, не наблюдались воспаление и инкапсулированные остатки препарата.

5. Опытные образцы вакцин были антигенно-активными в течение всего периода наблюдения, иммунная реакция проявлялась на 7 день после вакцинации и достигала максимальных значений к 45 дню с момента иммунизации, стабильно удерживаясь в течение 3-х месяцев (срок наблюдения). Однако, инактивированная липосомальная вакцина обладала более выраженной антигенной активностью, индуцировала образование высокого уровня специфических антител, по сравнению с ГОА формолвакциной (P < 0.01).

6. Определена иммунобиохимическая характеристика крови цыплят при применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза. Установлено, что в ответ на введение вакцин (липосомальной и ГОА формолвакцины) происходит нарастание общего белка (P > 0,05), которое в основном достигалось за счёт увеличения фракции гамма-глобулинов. При этом содержание гамма-глобулинов, а также титр специфических антител в сыворотке крови птиц вакцинированных инактивированной липосомальной вакциной были достоверно выше, чем при иммунизации ГОА формолвакциной (Р < 0,05).

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработаны технические условия на инактивированную липосомальную вакцину против колибактериоза птицы, а также наставление по её применению.

2. Инактивированную липосомальную вакцину предлагается использовать для профилактики колибактериоза птиц в условиях птицехозяйств.

3. Результаты исследований по изучению иммунобиохимической характеристики крови птицы при применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии, и кафедре биохимии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», а также в ветеринарной практике.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Орехов Д.А. Применение формалина, теотропина и аминоэтилэтиленимина для инактивации возбудителя колибактериоза // Мат. 60-й науч. конф. молодых учёных и студентов СПбГАВМ. СПб, Изд-во ФГОУ ВПО “СПбГАВМ”, 2006. С. 84-85.

2. Орехов Д.А., Конопатов Ю.В., Сухинин А.А. Применение липосом при конструировании инактивированной вакцины против колибактериоза птицы // Ветеринарная медицина теория, практика и обучение: Мат. науч. практич. конф. Спб., Изд-во ФГОУ ВПО “СПбГАВМ”, 2006. С. 22-24.

3. Орехов Д.А. Изготовление и лабораторные испытания инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птиц // Ветеринарная медицина теория, практика и обучение: Мат. Втор. Всероссийской науч. практич. конф. Спб., Изд-во ФГОУ ВПО “СПбГАВМ”, 2007. С. 52-55.

4. Орехов Д.А. Инактивация Escherichia coli аминоэтилэтиленимином // Мат. 61- й науч. конф. молодых учёных и студентов СПбГАВМ. СПб., Изд-во ФГОУ ВПО “СПбГАВМ”, 2007. С. 64-66.

5. Орехов Д.А. Вакцинный препарат против колибактериоза птиц: Тезисы докл. научно-практич. конгресса ”Актуальные проблемы ветеринарной медицины”. СПб. 2007. С. 164-166.

6. Орехов Д.А., Конопатов Ю.В., Сухинин А.А. Инактивированная липосомальная вакцина и гидроокись алюминиевая формолвакцина против колибактериоза птиц // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2007. №4. С. 77-79.

7. Орехов Д.А., Конопатов Ю.В., Сухинин А.А., Рыбальченко О.В. Использование аминоэтилэтиленимина при конструировании липосомальной вакцины против колибактериоза птиц // Ветеринарная патология. 2007. №2. С. 66-69.

8. Конопатов Ю.В., Сухинин А.А., Пилаева Н.В., Орехов Д.А. Иммунобиохимическая характеристика крови птиц при применении липосомальной вакцины против колибактериоза // Ветеринарная практика. 2007. №2(37).- С. 22-26.

9. Сухинин А.А., Конопатов Ю.В., Орехов Д.А. Инактивированная липосомальная вакцина против колибактериоза птиц // Болезни птиц в промышленном птицеводстве. Современное состояние проблемы и стратегия борьбы: Мат. науч. практич. конф., посвящённой памяти академика Россельхозакадемии Р.Н. Коровина. СПб.: ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии. ВВМ. 2007. С. 235-240.

Размещено на Allbest.ru