В зимне-весенний период при низкой отрицательной температуре происходит процесс постепенного обезвоживания протопластов плодовых растений, вследствие того, что свободная вода в межклетниках кристаллизуется и рост кристаллов в межклетниках происходит за счет свободной воды, поступающей из протопласта клеток [1, 2, 3]. В результате обезвоживания в протопласте растет концентрация электролитов, приводящая к денатурации белков, нарушению функций мембран и клеточных органелл. Одновременно усиливается окисление сульфгидрильных групп в белках, изменяющее их функциональные свойства. Потеря воды молекулами белков при обезвоживании стимулирует их сближение, агрегацию, потерю биохимических свойств и выпадение в осадок. Поэтому гидрофильные группы, включая сульфгидрильные, удерживая воду в гидратных оболочках, препятствуют сближению молекул белков, усиливая, таким образом, морозоустойчивость клеток растений. Здесь существует положительная связь между содержанием сульфгидрильных групп и морозоустойчивостью растений. Образование кристаллов льда в межклетниках растительных тканей вызывают нуклеаторы льда, а именно: полисахариды, белки, бактериальные клетки любой природы. Постепенная дегидратация протопластов является одним из необходимых условий выживания растений при отрицательных температурах [2,4]. Таким образом, внеклеточное образование льда - важная возможность жизни растений в условиях отрицательных температур [4]. Кроме того древесные растения в результате эволюции приобрели способность тормозить внутриклеточное образование кристаллов льда при низкой температуре, ой вследствие образования в протопластах высоких концентраций антинуклеаторов льда, протопласты при этом находятся в состоянии глубокого переохлаждения.

геноплазма криосохранение черенок почка плодовый

Согласно Конвенции по биоразнообразию, сохранение биологического разнообразия от исчезновения возможно двумя путями: in situ, т.е. в естественных условиях - лесах, полях, садах, и ex situ - в заповедниках, коллекционных садах и питомниках, различных генетических банках животных, рыб и т.д. (http://www.chd. int/). Классический способ хранения плодовых культур путем посадки в садах дорогой и не обеспечивает 100% сохранность коллекционного материала. Однако существует альтернативная возможность длительного сохранения коллекций игенплазмы различных частей растений, при сверхнизких температурах методом криоконсервации, с последующим определением их жизнеспособности после длительного хранения в парах жидкого азота.

Для проведения криоконсервации генплазмы растений (плодовых, ягодных культур) при сверхнизких температурах ( - 1850С) влияния природного количества антинуклеаторов недостаточно, необходимо понизить в клетках количество воды аккуратным подсушиванием растительной ткани при определенной отрицательной температуре до 30% остаточной влажности, что занимает несколько недель (метод Форслайна) (12). При криоконсервации объектов небольших размеров (растительных меристем, почек растений, яйцеклеток, сперматозоидов) для защиты клеток от действия сверхнизких температур применяют криопротекторы. Следует отметить, что криоконсервация в жидком азоте или его парах при - 183°С… - 185єС, это перспективный и дешевый способ сохранения геноплазмы растений [9,10, 11]. При консервации также используют различные части растений - побеги (черенки), почки, пыльцу, меристемы и семена диких видов [12]. На примере черной смородины мы изучали способность подсушенных при - 50С черенков выдерживать сверхнизкие температуры при хранении их в парах жидкого азота, параллельно с этим были проведены исследования по хранению почек черемухи, обработанных перед замораживанием криопротекторами различной концентрации. Криозащитные вещества не только уменьшают размеры кристаллов льда в растительных тканях и их количество, но снижают токсические и другие вредные эффекты обезвоживания [13]. При закладке растительного материала на длительное хранение оценивали режимы замораживания-размораживания и условия вывода сохраняемой геноплазмы из состояния глубокого покоя.

Помимо длительного многолетнего хранения коллекционного материала при сверхнизких температурах, существует потребность в сезонном хранении плодов и ягод. Здесь применяются низкие положительные температуры, которые позволяют сохранить плоды свежими, без потери товарного качества. При таком типе хранения растительной продукции окислительно-восстановительные процессы в растительных тканях имеют большое значение, так как основные потери, связанные с жизнедеятельностью, происходят от процессов окисления в тканях плодов. Защиту плодов от избыточного образования активных форм кислорода осуществляют антиоксиданты и ферментные системы. Наиболее эффективными водорастворимыми антиоксидантами являются аскорбиновая кислота и глутатион, которые способны перехватывать различные кислородсодержащие радикалы и синглетный кислород, где антиоксидантное действие аскорбиновой кислоты и глутатиона реализуется в ферментном аскорбат-глутатионовом цикле. Положительной функцией витамина С и глутатиона является восстановление окисленных форм других низкомолекулярных антиоксидантов, например фенолов, которые могут окислятся радикалами или ферментативно. Окисление фенольных соединений сопровождается образованием хинонов, которые далее восстанавливаются аскорбатом и глутатионом. Данное восстановление обеспечивает детоксикацию продуктов окисления фенолов [4, 5]. В то же времябиохимический состав плодов и, следовательно, активность окислительно-восстановительных процессов в плодах в значительной степени зависят от состояния древесины плодовых деревьев в различные периоды вегетации. В результате появляется возможность раннего прогнозирования способности растительной продукции (плодов и ягод) к сезонному хранению в холодильниках при +1°С…+3°С с минимальными потерями [6,7,8]. В нашей работе мы исследовали возможности прогнозирования потерь плодово-ягодной продукции при хранении плодов в зависимости от состава древесины плодовых деревьев и наличия в ней антиоксидантов.

Криоконсервацию черенков и почек проводили на образцах черной смородины и черемухи, взятые в коллекционном саду филиала Павловской опытной станции ВИР им.Н.И. Вавилова (г. Павловск). Нарезали черенки смородины 8 гибридов европейского и сибирского подвидов Ribes nigrum L. в ноябре-декабре месяце, когда растения находились в состоянии глубокого покоя. Перед закладкой на хранение черенки с 2-3 почками подсушивали в шкафу "INCUBATOR - 818" при - 4-5єС до влажности 28-32%, затем замораживали в замораживателе фирмы "Sanyo Medikal Freeser" до - 48… - 50єС и помещали на длительное хранение в пары азота. В работе с криопротекторами применяли проникающие в почки протекторы - 25% и 40% глицерин и 25% и 40% сахарозу. Почки инкубировали в криопротекторах 1ч при 20єС, затем постепенно замораживали в замораживателе "Sanyo Medikal Freeser" до - 48… - 50єС и помещали в пары азота на хранение. После 1,5-2 месяцев хранения в парах жидкого азота почки размораживали, отмывали от протекторов и после проращивания на питательной среде (MS), определяли процент жизнеспособности.

Потери массы плодов во время холодильного хранения, связанные с жизнедеятельностью, определяли весовым методом, а их хранение проводили при температуре + 1°С… + 3єС. Содержание органических кислот и аскорбиновой кислоты в плодах и древесной ткани растений (черенках) анализировали согласно принятым методикам в декабре - мае [14]. Исследования проводили в 3-х кратной повторности на таких плодовых культурах, как груша (сорт Чижовская), яблоня (сорт Белый налив), рябина (сорт Бурка и сорт Бусинка), жимолость (сорт Голубое веретено).

Лето 2012-2014гг было влажным, достаточное количество зимне-весенней влаги в почве в весенний период способствовало укоренению высаженных после хранения в парах азота черенков черной смородины, что положительно отразилось на росте растений - высота молодых побегов у сильнорослых гибридов достигала 30 - 50см. В целом все опытные гибриды после посадки в почву прижились - процент приживаемости весной и в летний периоду них находился на уровне 70,0% - 80,0%, только у двух гибридов ПУ 18-5 (Нарядная х №2) и Неосыпающаяся х№6 жизнеспособность черенков составляла 50,0%, 60,0% соответственно.

Почки черемухи, обработанные криопротекторами различной концентрации, различались по жизнеспособности. У обработанных 25% раствором сахарозы почек сорта Августина процент жизнеспособных почек составил 72,0%, а при увеличении концентрации криопротектора до 40%, процент жизнеспособных почек увеличился до 80,0%. После пересадки в большие стаканчики со средой почки хорошо развивались, формируя зеленые побеги. Обработка почек глицерином показала, что на 25% -й концентрации процент жизнеспособных почек составлял 54,8%, а на 40% концентрации процент жизнеспособных почек увеличился до 69,6%. Результаты обработки почек черемухи различными криопротекторами приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Влияние криопротекторов на жизнеспособность почек черемухи сорта Августина после хранения в парах жидкого азота ( - 183 - 185єС)

Cтабильность ответной реакции почек после криохранения на обработку взятыми криопротекторами, позволяет сделать вывод о возможности применения их для долговременного хранения генплазмы растений. В зависимости от состава растительного материала, сортов, культур, можно подбирать различные криопротекторы, которые будут нетоксичные по своему химическому составу, что, в конечном итоге, положительно повлияет на качество сохраняемого растительного материала.

В результате проведенных исследований по сезонному хранению плодов было установлено, что при увеличении витамина С в древесных тканях растений, которое определяли в декабре - мае, уменьшается естественная убыль массы урожая при холодильном хранении. Аналогичная зависимость сохраняется для самих плодов и ягод - чем больше содержание витамина С в плодах на начальном этапе хранения, тем меньше величина естественной убыли массы плодов при хранении. Рост содержания органических кислот в древесной ткани растений, которые также определяли в декабре - мае, сопровождается уменьшением убыли массы урожая при холодильном хранении. При сохранении урожая плодов и ягод, наблюдалась аналогичная зависимость: чем больше содержание в них органических кислот на начальном этапе хранения, тем меньше величина естественной убыли массы плодов в дальнейшем хранении. Синхронный характер изменения зависимости убыли массы плодов и ягод при хранении от содержания витамина С и органических кислот обусловлен стабилизирующим влиянием органических кислот на аскорбиновую кислоту. Следовательно, исходя из сопоставления содержания витамина С и органических кислот в древесных тканях плодовых растений, определенных в зимнее - весенний период, т.е. задолго до сбора урожая, можно делать прогноз о способности плодовой продукции к холодильному хранению.

По результатам криохранения черенков в парах жидкого азота следует отметить, что все опытные гибриды черной смородины после хранения прижились и показали хорошую жизнеспособность. Обработанные криопротекторами почки черемухи после хранения в азоте и проращивания в стерильных условиях на питательной среде показали различный процент жизнеспособности, более высокий процент жизнеспособности у почек, обработанных 40,0% - ной сахарозой. Увеличение содержания витамина С и органических кислот в растительных древесных тканях является следствием особенностей метаболических процессов, протекающих в клетках растений. Рост восстановительного потенциала растительной ткани обеспечивает возможность растениям переносить неблагоприятные условия зимне-весеннего периода с меньшими повреждениями. Минимизация повреждений, возникающих в растительной ткани в зимне-весенний период создает необходимые предпосылки для роста продуктивности растений и формированию урожая, способного храниться более длительное время с меньшими потерями.

Список литературы / references

1. Туманов И.И. Физиология закаливания и зимостойкости растений. М.: Наука, 1979.350 с.

2. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А., Физиология растений. М.: Высшая школа, 2005.736 с.

3. Трунова Т.И. Растение и низкотемпературный стресс. М.: Наука, 2007.60 с.

4. Кошкин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур. М.: Дрофа, 2010.638 с.

5. Бобко А.Л., Мурашев С.В., Вержук В.Г. Влияние антиоксидантов в древесной ткани плодовых растений в зимнее-весенний период на холодильное хранение собранного урожая. Сборник научных работ // Низкотемпературные и пищевые технологии в XXIвеке. Санкт-Петербург, 2013. С.381-383.

6. Бобко А.Л., Мурашев С.В., Вержук В.Г. Способ предварительного прогнозирования лежкости плодов и ягод при хранении. Патент РФ, № 2485759. Опубл. Бюл.27.06.2013.

7. Мурашев С.В., Бобко А.Л., Вержук В.Г. Способ прогнозирования хранения плодово-ягодной продукции (варианты). Патент РФ, № 2485754. Опубл. Бюл.27.06.2013.

8. Вержук В.Г., Мурашев С.В., Бобко А.Л. Способ диагностики растительных тканей для раннего прогнозирования хранения плодов и ягод. Патент РФ, № 2486417. Опубл. Бюл. 20.06.2013.

9. Вержук В.Г., Павлов А.В., и др. Криоконсервация побегов и почек черемухи (PadusMill) cприменением различных криопротекторов и режимов замораживания. - Киев., 2011, С.233-237.

10. Вержук В.Г., Павлов А.В., Тихонова О. А, Новикова Л.Ю. Жизнеспособность геноплазмы черной смородины (RibesnigrumL.), обработанной криопротекторами и без них после хранения в парах жидкого азота. - Киев., 2012. С.417-421.

11. Вержук В.Г., Мурашев С.В., Тихонова Н.Г., Жестков А.С., Бобко А.Л., Дорохов Д.С. Влияние эндогенных веществ моно - и дисахаридов на жизнеспособность плодовых растений после хранения в парах жидкого азота. // Плодоводство и ягодоводство России. - М.: 2011, т. XXVI. - С.17-23.

12. Forsline P. et al. Recovery and longevity of cryopreserved dormant apple buds // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1998. V.123. № P.365 - 370.

13. Попов А.С. Криоконсервация культивируемых клеток. Методы культивирования клеток. СПб., 2008. С.236-250.

14. Ермаков А.И., и др. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987.430 с.

Размещено на Allbest.ru