Развитие озимой пшеницы под влиянием химического мутагена фосфемида

Размещено на http://www.allbest.ru/

Развитие озимой пшеницы под влиянием химического мутагена фосфемида

Боме Н.А.

Вайсфельд Л.И.

Арсентьев С.В.³

¹Доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заведующий кафедрой ботаники, биотехнологии и ландшафтной архитектуры, Институт биологии, Тюменский государственный университет; ²Научный сотрудник, Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук; ³ Аспирант, Тюменский государственный университет

Аннотация

Изучено влияние химического мутагена фосфемида на растения трех сортов мягкой озимой пшеницы из мировой коллекции Института растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР). Мутагенные свойства препарата подтверждены раннее в исследованиях кариотипов фибробластов человека и мыши и проростков Crepis capillaris L. Сухие семена испытываемых сортов озимой пшеницы обрабатывали растворами фосфемида в концентрациях 1·10^-2 М и 1·10^-3 М. Фосфемид влиял на признаки: 1) качественные - полевая и лабораторная всхожесть семян, перезимовка растений, 2) количественные - морфометрические параметры проростков в лабораторных условиях и растений в полевом испытании. Показано, что фосфемид в исследуемых концентрациях не токсичен для проростков, не препятствует перезимовке и развитию растений в природных условиях. Физиологический эффект фосфемида зависел как от сорта, так и от стадии развития растений.

Ключевые слова: озимая пшеница, фосфемид, химический мутагенез

Abstract

The influence of chemical mutagen phosphemid on plants of three varieties of World Collection soft winter wheat of Institute of Plant. NI Vavilov (VIR). Mutagenic properties of the drug are confirmed earlier in researches karyotypes of human fibroblasts and mouse, and at seedlings of Crepis capillaris L. Dry seeds of winter wheat varieties were treated by solution phosphemidum in concentrations of 1 Ч 10-2 M and 1 x 10-3 M. Mutagen was influenced on following characters: 1) qualitative - the germination (laboratory and field), and winter hardiness of plants, 2) quantitative - morphometric parameters of the seedlings in the lab and after winter. It is shown that concentrations of the mutagen not are toxic for seedlings and do not hinder wintering of plants under natural conditions. Physiological effect the mutagen depends on the kind of plants and stage of their development.

Keywords: winter wheat, phosphamidum, chemical mutagenesis

Возможность и необходимость применения химических мутагенов в селекции сельскохозяйственных растений с целью увеличения их генетического разнообразия и получения нового селекционного материала - эти вопросы были разработаны крупнейшим генетиком нашего времени Иосифом Абрамовичем Рапопортом. С 1959 года до последнего года своей жизни (1990) И.А. Рапопорт проводил совещания в Институте химической физики РАН при поддержке РАН СССР для селекционеров из разных регионов СССР и зарубежных стран. Это была настоящая и единственная в то время генетико-селекционная школа после мрачного периода лысенкоизма. За короткий период в Госреестр было включено около 400 сортов разных сельскохозяйственных культур, созданных методом химического мутагенеза [1, 2]. Ежегодно по результатам совещаний издавались сборники научно-практических исследований. И.А. Рапопорт выявил мутагены, пригодные для селекционных целей [3]. Химический мутагенез на озимой пшенице сорт Мироновская 808 изучался в течение многих лет Н.С. Эйгес с сотрудниками [4]. Применялся мутаген этиленимин.

Свойства мутагена пшеница фосфемид мутаген

В данной работе для получения форм растений озимой пшеницы с новыми и улучшенными признаками применялся препарат фосфемид: ди-(этиленимид)-пиримидил-2-амидофосфорной кислоты (Рис. 1).

Рисунок 1. Фосфемид sin. фосфазин (Phosphemidum, Phosphasin)

Фосфемид содержит две этилениминные группы. Этиленимин обладает цитотоксическим действием. В состав фосфемида входит пиримидиновое основание, соединенное с амидофосфорной кислотой [5]. Препарат представляет собой белый кристаллический порошок, растворимый в горячей воде, спирте и уксусной кислоте. Фосфазин был синтезирован во Всесоюзном химико-фармацевтическом научно-исследовательском институте [6] и испытан В.А. Черновым и сотрудниками [7] в качестве антиракового средства благодаря его антистатическим свойствам. В настоящее время фосфемид является медицинским препаратом [8, 9].

Мутагенный эффект фосфемида на цитогенетическом уровне

Первичная культура эмбриональных тканей [10].

Анализировали аберрации хромосом в фибробластах мыши и человека после однократной обработки культуры фосфемидом в концентрациях 1 · 10^-3 и 1 · 10^-4 M. Фосфазин (тогда он так назывался) задерживал вступление клеток в митоз, подавлял митотическую активность фибробластов в течение периода роста культуры. В среднем частота митозов составляла 54% по отношению к контролю при относительно невысоком уровне перестроек хромосом. Фосфазин вызывал перестройки хромосом в течение длительного (72-96 часов) культивирования фибробластов. Число перестроек достигало максимума 52% в клетках мыши, 40% в клетках человека. В контроле средний уровень перестроек был 1,99% в клетках мыши и 0,72% в клетках человека. Выявлено различие естественного и индуцированного уровней мутагенеза в разных биологических системах. Клетки, меченные тимидином H³ (в фазе синтеза ДНК), появлялись с задержкой на 3 часа по сравнению с соответствующими контролями, т. е. с приходом в митоз из фазы синтеза ДНК

Результаты обработки семян Crepis capillaris L. [11].

Для анализа повреждений хромосом идеальным объектом служат семена Cr. capillaris (L.) Wallr. (скерда) [12, 13]. Растение имеет три пары хорошо различимых хромосом.

В проростках после обработки фосфемидом семян наблюдали статистически значимое подавление митотической активности и высокий уровень хроматидных перестроек при концентрациях мутагена 2 · 10^-3 M и 1 · 10^-2 М [11]. Мутаген действовал в фазе синтеза ДНК.

Генетические опыты на озимой пшенице

Фосфемид был синтезирован в лаборатории физических и химических методов анализа на Химическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова профессором Евгением Вениаминовичем Бабаевым.

Работа проводилась на трех сортах озимой мягкой пшеницы из мировой коллекции ВИР: Крошка (к-63059), Гунистан (к-64283), Безенчукская 1 (к-64278).

Сорт Крошка. Оригинатор Краснодарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства им. П.П. Лукьяненко. Высокоинтенсивный полукарлик, устойчив к полеганию, болезням, засухе. Сорт Гунистан. Оригинатор Кубанский Государственный аграрный университет. Полукарлик с высоким качеством зерна, устойчив к переувлажнению. Сорт Безенчукская 1. Оригинатор Самарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства. Обладает засухоустойчивостью, зимостойкостью, полигенной системой адаптивности.

Данные сорта ежегодно в течение 2007-2012 гг. проходили полевые испытания в коллекционном питомнике на экспериментальном участке биостанции “Озеро Кучак” Тюменского государственного университета (Тюменская область, Нижнетавдинский район). Сорта наряду с достоинствами (устойчивость к полеганию, высокое качество зерна) имели недостатки (недостаточно стабильная по годам урожайность, поражение растений снежной плесенью в период перезимовки).

В 2013 году воздушно-сухие семена озимой пшеницы обрабатывали водным раствором препарата фосфемид в концентрациях 1·10^-2 М и 1·10^-3 М, при экспозиции 4 часа, затем семена промывали в проточной водопроводной воде в течение 60 мин. Проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге при температуре 25°С по 50 семян; повторность опыта 4-кратная. Контролем служили семена, обработанные дистиллированной водой. Определяли лабораторную всхожесть семян (на 7-е сутки). В августе 2013 года был заложен полевой опыт. Семена контрольных и опытных вариантов высевали на делянках с длиной рядка 1 м, число рядков 3, междурядье 15 см, глубина посева 5-6 см, по 150-200 семян на вариант, повторность опыта 4-кратная. Определяли полевую всхожесть семян, выживаемость растений, морфологические признаки в фазе выхода в трубку растений (высота растений, морфометрические параметры флагового листа, число листьев на побеге), элементы продуктивности.

Влияние фосфемида на показатели всхожести семян

Биологическая активность химического мутагена оценивалась в лабораторном и полевом экспериментах.

В контроле лабораторная всхожесть семян изменялась от 85,0% (Безенчукская 1, Гунистан) до 91,0% (Крошка). При сравнении средних значений всхожести обнаруживаются различия в реакции сортов на мутагенный фактор. После обработки фосфемидом показатели всхожести у сортов Гунистан и Безенчукская 1 при сравнении с соответствующими контролями были ниже при более высокой концентрации и приближались к контролю при более слабой концентрации. У сорта Крошка отмечена активация ростовых процессов на самых ранних стадиях в обоих опытных вариантах, максимальный эффект был при слабой концентрации мутагена (Рис. 2). Изменения лабораторной всхожести семян в сторону понижения или повышения в вариантах с применением фосфемида показали, что мутаген проникал в зародыш и воздействовал на него во время обработки.

Рисунок 2. Лабораторная всхожесть семян озимой пшеницы при проращивании в стандартных условиях после обработки семян фосфемидом, %. 2013 г.

Примечание: * - различия между контрольным и опытным вариантами статистически достоверны.

Наибольшей полевой всхожестью (Рис. 3) характеризовались семена сорта Гунистан (86,5%) в контроле, а наименьшей - сорта Крошка в варианте с мутагеном в 1?10^-2 М (49,0%). В лабораторном опыте (см. Рис. 2) отмечена стимуляция ростовых процессов.

В полевых условиях в большинстве случаев наблюдалось угнетающее воздействие фосфемида за исключением сорта Безенчукская 1 при концентрации раствора в 1?10^-2М. У сортов Крошка и Гунистан полевая всхожесть семян снижалась с увеличением концентрации фосфемида.

Уровни полевой всхожести семян свидетельствуют о способности семян прорастать и давать полноценные всходы в природных условиях и о том, что зародыши не были повреждены химическим мутагеном во время обработки, следовательно, фосфемид в данных концентрациях нетоксичен.

Рисунок 3. Всхожесть семян озимой пшеницы в полевых условиях в контроле и после обработки фосфемидом, %. 2013 г.

Таким образом, уже в фенофазе всходов проявились различия между сортами как в контроле, так и по реакции на действие мутагена.

Весной 2014 года (5-9 мая) после отрастания растений озимой пшеницы проведена оценка перезимовки опытных сортов (Рис. 4). Оценку проводили визуально в баллах: 5 - отсутствие изреженности; 4 - заметна слабая изреженность, при этом количество погибших растений не превышает 25%; 3 - значительная изреженность (около 50%); 2 - количество погибших растений от 50 до 75%; 1 - очень высокая изреженность, количество живых растений не превышает 25%.

В контроле уровень перезимовки изученных сортов колебался от 2,5 до 3 баллов. В вариантах с фосфемидом максимальная оценка составила 4 балла у сорта Гунистан в обеих концентрациях и у сорта Безенчукская 1 при действии мутагена в концентрации 1·10^-3 М. Важно отметить различия между показателями полевой всхожести семян и весенней оценки сорта Гунистан. Осенью мы наблюдали угнетение относительно контроля, а весной значительную стимуляцию ростовых процессов. Растения сорта Крошка по сравнению с контрольными и опытными вариантами других сортов характеризовались низкими адаптивными свойствами в период перезимовки. Одной из причин гибели растений было поражение снежной плесенью (возбудитель Fusarium nivale). Следует отметить, что в вариантах с высоким баллом оценки растения были менее восприимчивы к патогену.

Рисунок 4. Результаты перезимовки сортов озимой пшеницы в контроле и после обработки фосфемидом, балл. 2014 г.

Изменчивость количественных признаков под влиянием фосфемида

Изучаемые в данной работе сорта имеют различное генетическое происхождение, что нашло отражение в их реакции на действие мутагена уже в первом поколении по изменчивости морфометрических параметров проростков в лабораторном эксперименте.

Различия между сортами по числу зародышевых корней в контроле были незначительны. При действии мутагена обнаружены достоверные различия с контролем у сортов Крошка и Гунистан. На формирование корней у сорта Безенчукская 1 мутаген в обеих концентрациях оказал угнетающее действие (Табл. 1).

Таблица 1 - Влияние фосфемида на морфометрические параметры проростков трех сортов озимой пшеницы

Примечание: *- различия между контролем и опытным вариантом статистически достоверны.

Фосфемид в большинстве случаев оказывал ингибирующее воздействие на массу зародышевых корней. Наибольшую чувствительность к мутагену проявил сорт Гунистан, у которого данный показатель был существенно ниже контроля. Эффект стимуляции наблюдался у сорта Крошка при обработке мутагеном в 1·10^-3 М. В этом же варианте отмечен самый большой коэффициент вариации (CV) - 69,54% (Табл. 2), что свидетельствует о высокой степени изменчивости признака, средняя степень изменчивости наблюдалась у сорта Гунистан при обработке раствором 1·10^-3 М.

Таблица 2 - Изменчивость морфометрических параметров проростков трех сортов озимой пшеницы под влиянием фосфемида, CV,%

Примечание: степень изменчивости признака: слабая - CV>10%; средняя - CV=10-20%; сильная - CV<20%.

Важным признаком является и длина зародышевых корней, так как от способности корней проникать на разную глубину зависит способность растения получать почвенную влагу и различные элементы питания.

У сортов Гунистан и Безенчукская 1 отмечалась стимуляция роста зародышевых корней проростков, полученных из семян, обработанных мутагеном. Различие между контрольным вариантом сорта Безенчукская 1 и вариантом с мутагеном в концентрации 1?10^-3 М является достоверным (см. Табл. 1). Угнетение корневой системы наблюдалось на опытных проростках сорта Крошка.

Из Табл. 2 видно, что наименьший коэффициент вариации по данному признаку обнаружен у сорта Безенчукская 1 при концентрации мутагена 10^-3М (CV=14,60%). Наибольшая степень изменчивости признака выявлена у сорта Гунистан (CV=28,28%) в концентрации 1·10^-2 М, что может быть связано с высокой чувствительностью сорта к стрессовому фактору. Степень изменчивости длины зародышевых корней. варьировала от слабой до высокой CV=4,44 - 32,35%.

В ходе эксперимента наблюдалось отрицательное влияние мутагена на массу побегов озимой пшеницы. Ярко выраженной реакцией на мутаген характеризовались проростки сорта Гунистан (см. Табл. 1), масса побегов которых при концентрации мутагена 1?10^-2 М составила 120 мг, тогда как у проростков этого же сорта, выращенных в стандартных условиях, этот показатель был выше - 200 мг.

Степень изменчивости данного признака во всех вариантах была высокой, кроме одного варианта с фосфемидом (1?10^-2М) у сорта Безенчукская 1.

Наблюдалось неоднозначная реакция разных сортов озимой пшеницы на воздействие мутагена по длине побегов (см. Табл. 1). В стандартных условиях средняя длина побегов изученных сортов варьировала от 10,9 см (сорт Гунистан) до 12,9 см (сорт Крошка). У проростков, выращенных из семян, обработанных мутагеном в концентрации 1?10^-2 М, данный показатель изменялся от 10,8 см (сорт Гунистан) до 11,8 см (сорт Безенчукская 1).

Разность между контрольными и опытными вариантами по длине побега была достоверной у сорта Крошка при двух концентрациях, у сорта Безенчукская 1 при концентрации 1?10^-3 М, у сорта Гунистан существенных различий с контролем не выявлено. Степень изменчивости признака была в пределах от средней (CV=19,67%) до высокой (CV=40,38%).

В полевых условиях при определении высоты растений озимой пшеницы достоверное снижение признака под влиянием фосфемида (на 27,2% по сравнению с контролем) наблюдалось только у сорта Крошка (концентрация 1?10^-3 М). Ингибирующее действие мутагена у этого сорта проявилось и в лабораторном опыте по длине побега. Снижение значений признака высоты растений в опытных вариантах было у сорта Гунистан и увеличение - у сорта Безенчукская 1, хотя статистически это не подтвердилось (Рис. 5).

Рисунок 5. Высота растений в фазе выхода в трубку в контроле и под влиянием фосфемида, см (полевой опыт)

Примечание: *- различия между контрольным и опытным вариантами статистически достоверны.

В исследованиях, проведенных в условиях юга Тюменской области [14] и предгорной зоны Северного Кавказа [15] на различных сортах озимой пшеницы (в том числе и на сорте Крошка), показана зависимость семенной продуктивности растений от морфометрических параметров и площади флагового листа.

В полевой оценке выявлены различия по линейным размерам листовой пластинки между сортами и вариантами опыта (Рис. 6 а,б).

Рисунок 6. Длина (а) и ширина (б) флагового листа в фазе выхода в трубку в контроле и под влиянием фосфемида

Показатели длины флагового листа были выше контроля в вариантах с фосфемидом у сортов Крошка (на 18,6%) и Гунистан (на 9,5%) при концентрации раствора мутагена 110^-2 М, что может указывать на стимулирующий эффект препарата. У сорта Безенчукская 1 существенных различий по данному признаку не обнаружено. В контрольных и опытных вариантах более крупные листья формировались у сортов Крошка и Безенчукская 1.

У сорта Крошка мутаген в концентрации 1 10^-2М оказал положительное влияние на ширину флагового листа, превышение над контролем составило 18,4%. Достоверное снижение ширины листа (на 27,8%) отмечено у сорта Гунистан при увеличении длины. Выявленные различия по фенотипическому проявлению морфотипа листа могут быть связаны с генотипическими особенностями сортов и нормой их реакции на мутагенный фактор.

Анализ развития некоторых количественных признаков, определяющих продуктивные свойства озимой пшеницы, выявил неоднозначное влияние мутагена на развитие растений (Табл. 3).

Таблица 3 - Влияние фосфемида на некоторые признаки продуктивности трех сортов озимой пшеницы

Статистически достоверным ингибирующее действие мутагена на продуктивную кустистость, длину колоса и число зерен в колосе было у сорта Гунистан. Значимых различий между контрольными и опытными вариантами у сортов Крошка и Безенчукская 1 не выявлено.

Полученные данные по обработке семян трех сортов озимой мягкой пшеницы из мировой коллекции ВИР сложным по химическому составу мутагеном фосфемидом в концентрациях 1·10^-2М и 1·10^-3 М показали его эффективность в отношении индукции биологического разнообразия уже в первом поколении обработанных семян.

Показано, что фосфемид в исследуемых дозах нетоксичен для проростков и не препятствует перезимовке и дальнейшему развитию растений в природных условиях.

Фосфемид оказывал влияние на признаки качественные: всхожесть семян в лабораторных и полевых условиях, выживаемость (перезимовка) растений и количественные: морфометрические параметры проростков, высоту растений, размеры флагового листа, число продуктивных стеблей, длину колоса, число зерен в колосе. В изученных концентрациях мутагена перезимовка растений была выше, чем в контроле, в трех вариантах составляла 4 балла.

Физиолого-морфологический эффект фосфемида зависел как от сорта, так и от стадии развития растений. Подтверждается различие объектов по реакции на данный мутаген на клетках человека и мыши. Различия изученных сортов по реакции на воздействии химического мутагена обусловлены особенностями их генотипов.

Литература

1. Рапопорт И.А. Избранные труды. Гены, эволюция. М.: Наука, - 1996. - 250 с.

2. Рапопорт И.А. Химический мутагенез. Теория и практика. М.: Наука, - [Репринт 1993, 87с.]

3. Рапопорт И.А. Признаки и механизм действия супермутагенов. М.: Знание, - 1966. - С. 19-23.

4. Eiges N.S. Role of Chemical Mutagenesis in Enhancement of Biological Diversity and Sources of Rare and New Characters of Wheat. / N.S. Eiges, L.I. Weisfeld, G.A. Volchenko / Biotechnology, Agriculture and the Food Industry. Ed. G.E. Zaikov. New York: Nova Science Publishers, Inc., - 2006. - P. 127-131.

5. Рос В. Биологические алкилирующие вещества. Химия и пути поисков соединений с избирательной токсичностью / Ред. А.Я. Берлин. М.: Медицина, - - 260 с.

6. Кропачева А.А. Производные этиленимина. Диэтиленимидопиримидил амидофосфорная кислота / А.А. Кропачева, Н.В Сазонов. // Журнал общей химии, - 1961, № 11, с. 3601-3605.

7. Чернов В.А. Цитотоксические вещества в химиотерапии. М.: Медицина, - 1964.- 320 с.

8. Фосфемид. Методы применения в онкологии. [Электронный ресурс] URL: http://www.medicportal.ru/meddir/preparathtml

9. Фосфемид. Описание препарата. [Электронный ресурс] URL: http://medprep.info/drug/medicament/2512

10. Вайсфельд Л.И. Цитогенетическое действие фосфазина на клетки человека и мыши в культуре // Генетика, - 1965, № 4. - С. 85-92.

11. Weisfeld L.I. About cytogenetic mechanism of chemical mutagenesis / Ecological consequences of increasing crop productivity. Plant breeding and biotic diversity. Toronto - New Jersey. - Apple Academic Press. - 2015. - P. 249-269.

12. Навашин М.С. Проблемы кариологии и цитогенетическое изучение рода Crepis. М.: - Наука, - 1985. - 349 с.

13. Дубинина Л.Г. Структурные мутации в опытах с Crepis capillaris. М.: Наука, - 1978. - 188 с.

14. Боме Н.А. Формирование листовой поверхности озимых форм Triticum aestivum в различных погодно-климатических условиях/ Н.А. Боме, Е.А. Тюменцева, А.Я. Боме //Вестник Тюменского государственного университета. Экология и природопользование. Тюмень: ТюмГУ, - 2011, №12. - С. 132-137.

15. Гудкова Г.Н. Связь морфотипов листа с урожайностью у сортов озимой пшеницы // Вестник Адыгейского государственного университета, 2008. Вып. 4 (32). С. 105-107.

Размещено на Allbest.ru