Ідентифікація нових ентомопатогенних штамів бактерій роду Bacillus за ключовими ознаками фенотипу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ідентифікація нових ентомопатогенних штамів бактерій роду Bacillus за ключовими ознаками фенотипу

Ентомопатогенні бактерії роду Bacillus, зокрема виду B. thuringiensis, є значним біологічним агентом щодо контролю комах - шкідників рослин (ряд Lepidopteran, Coleptera, Hymenoptera, Homoptera, Mallophaga, Diptera тощо) [1-4]. Безпечність для флори та корисної фауни, природне походження, відсутність утворення стійкості цільових об'єктів роблять їх унікальним інструментом в екологічно безпечному органічному землеробстві [2]. Ефективність дії B. thuringiensis ґрунтується на здатності бактерії в процесі спороутворення синтезувати ендо- та екзотоксини, що активуються в кишків- нику листогризучих комах, зупиняють їх живлення та зумовлюють фізіологічні зміни, не сумісні з життям, під час переходу до форми імаго. Зокрема, спектр та рівень синтезу цих токсинів кодується комплексом Cry генів, що містяться на мегаплазміді і забезпечують цілий спектр біологічної активності: цитолітичну, гемолітичну, ентомоцидну тощо [1]. З літературних джерел відомо про підвидову та штамову специфічність представників виду B. thuringiensis до певних шкідників [1, 3, 4]. У різних країнах світу великі компанії займаються виробництвом біопрепаратів, дія яких заснована на ентомотоксичних властивостях штамів B. thuringiensis: Monsanto (США), Mycogen (США), Hoechst (Німеччина), Novo (Данія), ICI (Великобританія), Sandor (Швейцарія) та ін. Але, зважаючи на штамову гетерогенність представників цього виду, неухильне зростання інтересу до продукції органічного походження та тотальне забруднення агроекосистем отрутохімікатами [5], пошук ефективних штамів продуцентів біоінсектицидів та всебічне дослідження їх властивостей набуває дедалі більшої актуальності.

Метою наших досліджень було виділити в чисті культури та дослідити ключові ознаки фенотипу бактерій роду Bacillus з ентомопатогенними властивостями.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У ході досліджень використано 9 нових штамів, ізольованих нами із кишківника листогризучих комах. Для порівняльного аналізу в роботі використано колекційні штами B. thuringiensis 297, 293 та 239, що були надані нам доктором сільськогосподарських наук Т.І. Патикою. Штам B. thuringiensis 98 використали як еталонний, оскільки він становить основу препарату Бітоксибацилін, виробником якого є Росія [6]. Нові штами бактерій ізолювали із внутрішніх тканин личинок колорадського жука (Leptinotarsa decemlineata, ряд Coleoptera) та американського білого метелика (Hyphantria cunea Dryri, ряд Lepidoptera) з наступним їх накопиченням у чистій культурі на картопляному агарі (КА). Скринінг комах проводили на полях приватних господарств та науково-дослідних установ, що не підлягають обробці хімічними чи біологічними інсектицидними препаратами, розташованих на території Київської, Черкаської, Житомирської областей та АР Крим.

Культуральні та фізіологічні властивості бактерій, морфологію клітин та колоній вивчали загальновизнаними методами [7]. Зокрема колір, форму і консистенцію колоній визначали за ростом на КА. Забарвлення клітин встановлювали за Грамом, форму клітин та особливості розташування спор - шляхом мікро- скопіювання. Культуральні та біохімічні властивості штамів досліджували за характером росту на стерильному м'ясо- пептонному бульйоні (МПБ) та желатині. Протеоліз на середовищі з желатином визначали за рівнем його розрідження. Редукцію нітратів до нітритів виявляли за допомогою додавання реактиву Грісса до бактеріальної культури, вирощеної на МПБ, який містив 0,1% азотнокислого калію. Почервоніння бактеріальної маси свідчило про здатність бактерій редукувати нітрати до нітритів. Оксидазну активність визначали методом Ковакса [8]. Каталаз- ну активність у бактерій вивчали за допомогою 10%-го перекису водню. Здатність засвоювати вуглеводи, органічні кислоти або амінокислоти, як єдине джерело вуглецевого живлення, досліджували за ростом бактерій та зміною забарвлення середовища Омелянського, яке містило індикатор бром-тимол синій. Як єдині джерела живлення випробували 0,5%-ий розчин вуглеводів та 0,1%-ий - багатоатомних спиртів, а також амінокислот. Засвоєння тих чи інших сполук оцінювали на 3, 7, 14 та 21 добу культивування за зміною кольору індикатора, що відбувалася внаслідок зміни величини pH.

Ентомопатогенні властивості досліджуваних штамів характеризували відповідно до методу Лескової. Для цього у скляний посуд поміщали личинки колорадського жука молодшого віку. Впродовж трьох днів їх годували листям картоплі, обробленим рідкою споровою культурою титром 109. Потім листя змінювали на необроблене. Рівень ентомопатогенності досліджуваних штамів розраховували як відсоток загиблих личинок до контролю на 3-5-ту добу експозиції [9].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У ході досліджень з кишківника лис- тогризучих комах було виділено понад 50 бактеріальних ізолятів, з яких за результатами первинного скринінгу ключових фенотипових ознак для подальших досліджень було відібрано 9 штамів.

Як колекційні, так і ізольовані штами під час росту на КА продемонстрували здатність до утворення колоній кремового кольору (табл. 1). За морфологією клітин усі досліджувані штами є прямими короткими паличками із заокругленими кінцями, що розташовуються попарно або ланцюжками. Характеризуються як грампозитивні, некапсульовані та рухливі внаслідок наявності перетрихальних джгутиків.

Штами, що здатні утворювати ендос- пори, розташовуються субтермінально. Всі досліджені культури утворюють лише каталазу та редукують нітрати до нітритів, розріджують желатин та ростуть при незначних концентраціях NaCl (табл. 1). Подібність цих ознак зближує ізольовані штами з колекційними, а також типовими представниками роду Bacillus. Як видно з таблиці 2, за ключовими біохімічними ознаками ізольовані нами штами також споріднені з колекційними B. thuringiensis 297, 293, 239 та еталонним штамом B. thu ringiensis 98.

Зокрема, на мінеральному середовищі Омелянського, до якого додавали як єдине джерело вуглецевого живлення глюкозу, усі досліджувані штами утворюють кислоту, натомість не зброджують лактозу, рафінозу, манітол, та є варіабельними за здатністю утилізувати саліцин і сахарозу. Подібність перелічених вище ознак не суперечить науковим даним та вказує на спорідненість як колекційних, так і ізольованих нами штамів з типовими представниками виду B. thuringiensis [1, 4, 10].

бактерія bacillus thuringiensis комаха

Таблиця 1 Фізіологічні та біохімічні властивості досліджуваних штамів

Однак незважаючи на подібність деяких ознак (табл. 2) до колекційних штамів, згідно з літературними джерелами, для представників цього виду такі властивості є специфічними залежно від штамів. Отже, за ключовими морфолого-культуральними та фізіолого-біохімічними ознаками ізольо-

Таблиця 2 Використання досліджуваними штамами деяких сполук як єдиного джерела живлення

?Частка загиблих личинок порівняно з контролем на 3 день .

? Частка загиблих личинок порівняно з контролем на 4 день

?Частка загиблих личинок порівняно з контролем на 5 день

Ентомотоксична дія ізольованих штамів B. thuringiensis на личинки Leptinotarsa decimlineata Say

Але з огляду на значну внутрішньовидову гетерогенність B. thuringiensis, ізольовані штами можуть бути коректно ідентифіковані на рівні виду із залученням додаткових фенотипових, а можливо, і ге- нотипових ознак. Саме тому на наступному етапі досліджень були перевірені ентомо- патогенні властивості виділених штамів (рисунок).

У процесі досліджень було з'ясовано, що тестовані штами B. thuringiensis є гетерогенними за токсичним впливом на личинки колорадського жука. Зокрема, найбільшим токсичним впливом на його личинки характеризувались штами B. thuringiensis 9 та 6, які на 5-й день експозиції спричиняли загибель 100% личинок. Доволі високою ентомотоксичною дією характеризувалась і культуральна рідина ізольованих штамів 1, 3, 4, 8. Натомість, аналогічна обробка культуральною рідиною штамів 2, 5 та 7 призводила до загибелі лише 72,5-80% личинок колорадського жука.Отже, досліджені нами штами характеризуються високою та середньою патогенністю щодо личинок колорадського жука. Це наближує їх до ентомопатогенних видів роду Bacillus, зокрема виду B. thuringiensis[1, 3].

ВИСНОВКИ

Результати досліджень засвідчили, що за комплексом ключових ознак фенотипу ізольовані бактерії роду Bacillus є спорідненими з типовими представниками виду B. thuringiensis. Але для остаточного з'ясування їх таксономічного статусу необхідно залучити додаткові фенотипові та генотипові ознаки. Встановлений високий рівень патогенності деяких штамів відкриває перспективи для подальшого їх дослідження з метою розробки нових вітчизняних біоінсектицидних препаратів для потреб сільського господарства.

ЛІТЕРАТУРА

1. Characterization of Bacillus thuringiensis soil isolates from Cuba, with isecticidal activity against mosquitoes / A. Gonzalez, R. Diaz, M. Diaz et al. // Revista de biologia tropical. - 2011. - Vol. 59, no. 3. - P. 1007-1016.

2. Bacillus thuringiensis. A genomic and proteomics perspective / M.A. Ibrahim, N. Griko, M. Junke, L.A. Bulla // Bioengineered bugs. - 2010. - No. 1. - P. 31-50.

3. Kati H. Characterization of highly pathogenic Bacillus thuringiensis strain isolated from Common Cockchafer, Melolontha melolontha / H. Kati, K. Sezen, Z. Demirgbag // Folia Microbiol. - 2007. - Vol. 52, no. 2. - P. 146-152.

4. Keshavarzi M. Isolation, Identification and differentiation of local Bacillus thuringiensis strains / M. Keshavarzi // J. Agric. Sci. Technol. - 2008. - Vol. 10, no. 2. - P. 493-499.

5. Сільськогосподарська мікробіологія і збалансований розвиток агроекосистем / В.Ф. Петриченко, І.А. Тихонович, С.Я. Коць та ін. // Вісник аграрної науки. - 2012. - № 8. - С. 5-11.

6. Вплив різних липкогенних композицій на спороутворення та синтез білка колекційними штамами Bacillus thuringiensis / В.В. Круть, Л.А. Данкевич, С.К. Воцелко, В.П. Патика // Мікробіол. журн. - 2014. - Т. 76, № 5. - С. 34-41.

7. Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Гер- хардта. - М.: Мир, 1983. - Т. 1. - С. 365-373.

8. Kovacs N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction / N. Kovacs // Nature. - 1956. - No. 178. - P. 703.

9. Лескова А.Я. Идентификация культур Bacillus thuringiensis и оценка их патогенных свойств (Методические указания) / А.Я. Лескова. - Л., 1984. - 21 с.

Размещено на Allbest.ru