Сравнительная оценка методик электрофоретического анализа у разных культур

Размещено на http://www.allbest.ru/

Сравнительная оценка методик электрофоретического анализа у разных культур

Н.Н. Петрова

В статье рассмотрены разработанные критерии оценки методики электрофореза с использованием приоритета оперативности, точности и высокой разрешающей способности. Даются характеристики методик, разработанных в УО БГСХА, идентификации генотипов, составлении каталогов и разработки СТБ в сортовом контроле.

The article examines the criteria of the estimation of electrophoresis method, developed with the use of speed, accuracy and high resolution. We have characterized the methods applied in the Belarusian State Agricultural Academy for the identification of genotypes, formation of catalogues and development of variety testing.

Введение

Первоначально метод электрофоретического анализа (ЭФА) был рекомендован для оценки семян в международном масштабе [15]. В настоящее время встает вопрос о необходимости использования данного метода для проверки качества собственных семян с целью поддержания их сортовой чистоты на высоком уровне. Для осуществления работы в этом направлении созданы аккредитованные лаборатории. От метода требуется информативность, которая должна быть достоверной, доступной, оперативной и экономически оправданной как в получении результата, так и в массовом применении анализа. При проверке семенного материала методом ЭФА используются международные методики: ВИРа, ИОГен и стандарты: ISO 8981:1993, ОСТ 10.003-93, а также разработанные в Республике Беларусь Государственные стандарты: СТБ 1710-2006, СТБ 1759-2007 [2, 3, 14] и методики УО БГСХА [9, 10, 11, 12, 17], каталог [8].

Анализ источников.

В период массовых анализов в весенний период для выполнения больших объемов проверки семян особо остро стоит проблема повышения производительности труда, сокращения времени на проведение анализа. В связи с этим при организации работ важен выбор методики анализа. Правильный подбор методики позволяет повысить экономическую эффективность (рентабельность) работы. На основании многолетнего опыта по использованию метода ЭФА в создании и организации работы испытательной лаборатории качества семян УО БГСХА [5] были оценены разные методики. Нами была осуществлена разработка собственных стандартных методик с учетом преимуществ применяемых химических реактивов, оборудования и достигнутого усовершенствования технических условий проведения анализа [16, 17].

Метод ЭФА позволяет определить индивидуальные особенности сорта через сертификацию, которая возможна только с применением лабораторного контроля. Данный метод буквально «читает» сорт как книгу, позволяя определить внутреннюю структуру сорта (количество биотипов и частоту их встречаемости) [17]. Одним из недостатков методики ISTA [20] является использование при экстракции 2 токсичных препаратов - хлорэтанола и меркаптоэтанола. У методики ВИРа [4] слабым местом является мягкий непрочный гель; длительная полимеризация, требующая особой тщательности сборки прибора; проведение предварительного электрофореза (ЭФ) для удаления из геля персульфата аммония. У методики ИОГен [6] используется крахмальный гель (КГ), что создает дополнительные затраты времени на приготовление геля; более удобным и прочным является полиакриламидный гель (ПААГ); форма геля - трубки, используемые с КГ, при методике ПААГ сейчас не используются [13]. Преимущества методик УО БГСХА: ПААГ с хорошими механическими свойствами, с высокой разрешающей способностью и быстрой полимеризацией; сокращено время прохождения белка в геле; краска не содержит токсичных веществ [13, 15, 16]. Актуальность исследования состоит в том, что правильно подобранная методика позволяет сократить затраты на проведение анализа за счет экономии электроэнергии, реактивов, повысить точность анализа, производительность труда и дать логистическую оценку закупаемому оборудованию. В настоящее время при выполнении ЭФА применяется дорогостоящее импортное оборудование. В то же время оно имеет простое устройство и не требует для своего производства сложных технологий. Результаты исследований показывают, что в перспективе возможна организация производства необходимого оборудования на территории Республики Беларусь. Это позволит, в частности, сократить время ремонта оборудования в случае поломки.

Цель исследований - разработать критерии оценки для сравнения технических условий методик ЭФА разных культур; оценить использование методик УО БГСХА для достижения оперативности, определения индивидуальности объекта.

Методы исследования.

К сожалению, нет универсальных приборов для проведения ЭФА. В стандартных международных методиках не приводятся торговые марки используемых приборов. Поэтому потребовалось рассмотрение особенностей методик с выявлением критериев их оценки к гелю, оборудованию, точности и продолжительности анализа. Установленные требования к оборудованию, возможно, послужат в качестве необходимой информации для развития собственного производства. В исследованиях испытывались методики ВИРа [4], ISO 8981:1993 [23], ISTA [18; 20-25], ИОГен [6] и УО БГСХА [9-12; 17]. Для сравнения были составлены характеристики методик по условиям ЭФА каждой культуры: концентрация геля; напряжение; температура - основные показатели, от которых зависит время выполнения ЭФ. Также учитывался размер пластин, указывающий на расход реактивов. Особое внимание обращалось на высоту пластины геля, так как по этому параметру формируется длина ЭФС, от которой зависит разрешающая способность. Достаточная длина пластины (не менее 115 мм по ISO 8981:1993 [23]) позволяла раздельно выделить компоненты в спектре, распознать их позиции.

В исследованиях оценивались методики пшеницы и тритикале ВИРа, ISO 8981:1993, ИОГен, УО БГСХА; кукурузы ВИРа, ISTA, УО БГСХА; бобовых ВИРа, ISTA, УО БГСХА; овса ВИРа, ISTA, УО БГСХА; ячменя ВИРа, ISTA, ИОГен, УО БГСХА.

электрофорез идентификация генотип сортовый

Основная часть

В табл. 1 проведено сравнение условий электрофореза глиадинов пшеницы и тритикале по методикам ВИРа [4], ISO 8981:1993 [23], ИОГен [6] и УО БГСХА [10].

Таблица 1. Сравнение технических условий электрофореза глиадинов пшеницы и тритикале по методикам ВИРа, ISO 8981:1993, ИОГен и УО БГСХА

- х) - крахмальный гель;

- хх) - используются трубки

По методике УО БГСХА проводится взвешивание зерновки, что позволяет повысить точность анализа для нахождения объема экстрагирующего раствора. Количество раствора должно соответствовать 1:10 (масса/объем). Обязательным является включение стандарта, что служит для подтверждения сортовой принадлежности семян, установления биотипного состава сорта. Приводится дополнительная отмывка для осветления пластин геля, придания яркости и четкости спектру. По напряжению и силе тока при основном ЭФА большинство методик предлагает поэтапное изменение характеристики вследствие особенности ЭФ. Время выполнения ЭФ зависит от выбранной методики и оборудования.

Общая продолжительность анализа тесно связанна с вышеперечисленными характеристиками методик, включая продолжительность экстракции, фиксации и окрашивания в ночное время. Такая ситуация не является отрицательной, но увеличивает общую продолжительность анализа и не позволяет своевременно получать результат. По методике УО БГСХА общая продолжительность анализа составляет 27-33,5 ч, что меньше на 2,5 ч по сравнению с ВИРом, но больше чем по ISO 8981:1993 на 20,5-11,5 ч и по ИОГен на 0,5-3,5 ч.

Использование методики УО БГСХА для оценки индивидуальности объекта показало, что она позволяет проидентифицировать разнообразие районированных, инорайонных сортов и сортообразцов озимой пшеницы и тритикале [10]. Все выявленные спектры по анализируемым образцам оказались индивидуальными. Последнее определяется компонентным составом и степенью интенсивности каждого компонента. Результатом исследования является составленный краткий каталог матриц (схем) ЭФС глиадина сортов и сортообразцов [10]. Выявлена аллельная изменчивость, выраженная белковыми биотипами. Каждый биотип представляет аллельный вариант ЭФС глиадинов сорта. На рис. 1 представлены матрицы ЭФС глиадина первого (основного) биотипа сортообразцов Авангардной (линии №89); Академической; Приозерной (линии №119 (177)); Могилевской (линии №227 (168)), находящихся в Государственном сортоиспытании.

Рис. 1.Матрицы ЭФС глиадинов сортообразцов озимой мягкой пшеницы

При использовании ЭФА зеинов в определении гибридности, оценки типичности и маркирования инбредных линий семян кукурузы разработан Государственный стандарт СТБ 1710-2006 [2, 14] на основе методики УО БГСХА [17]. Стандарт сравнивался с двумя методиками других государств (ВИР [4] - Россия, ОСТ 10.003-93 [7] -Украина), показатели которых приведены в табл. 2.

Таблица 2.Сравнение условий электрофореза зеинов кукурузы по методикам ВИРа, ОСТ 10.003-93, СТБ 1710 - 2006

По техническим условиям СТБ 1710-2006 [2] отличается повышением продолжительности анализа на 7-9 ч за счет увеличения времени на фиксацию и окрашивание. Проводится также дополнительная отмывка, повышающая качество ЭФС, разрешающую способность (рис. 2). Было обнаружено, что выполнение анализа позволяет использовать разные гребенки для формирования карманов геля, в которые заносится белок. Как показали исследования, применение гребенок на 18 карманов увеличивает на 38,5% исследуемых генотипов на пластину к уровню исходных 13-ти, приведенных на рис. 2 в сравнении с рис. 3.

Рис. 2. Пластина геля гибрида кукурузы Бемо 172 СВ с восемнадцатью спектрами, с дополнительной отмывкой в 7%-ой уксусной кислоте

Рис. 3. Пластина геля гибрида кукурузы Молдавский 257 СВ с тринадцатью спектрами без отмывки.

В табл. 3 произведено сравнение условий ЭФ запасных белков бобовых по методикам ВИРа [4], ISTA [18] и УО БГСХА [9]. При сравнении продолжительности анализа выделяется методика ISTA в ускорении ЭФ до 70 мин. В уменьшении высоты и толщины пластины по методике ISTA прослеживается меньшая концентрация геля, снижение энергозатрат и повышенная точность. Минимальная продолжительность полимеризации наблюдается в методике УО БГСХА, что сокращает ход анализа до 50-40 мин.

Для лучшего вхождения белка в гель предусмотрено понижение параметров по силе тока и напряжению в 1-ый час ЭФ (УО БГСХА). Во всех методиках востребовано включение стандарта, что вводится для сравнения со спектром оригинального образца (ВИР, УО БГСХА) при установлении подлинности сорта. При идентификации генотипов используется известный сорт, протеиновая шкала (ISTA) или соевая шкала УО БГСХА.

Таблица 3. Сравнение условий электрофореза полипептидов бобовых по методикам ВИРа, ISTA и УО БГСХА.

Составлены схемы (матрицы) ЭФС запасных белков идентифицируемых сортов, биотипов зернобобовых, изложенные в приложении методики УО БГСХА [9]. Составленные матрицы ЭФС приведены на рис. 5. Для нахождения позиции компонентов в ЭФС анализируемого образца, используется эталонный спектр сои. На рис. 5 показано сопоставление компонентов спектра сои с анализируемым спектром люпина.

А

Б

Рис. 5. Матрица ЭФС полипептидов семян люпина узколистного Митан (биотип 1) [Б] в сравнении с эталонным спектром сои [A]

Условные обозначения:

Размещено на http://www.allbest.ru/

Следует отметить, что наименьшая продолжительность ЭФ (2 ч) выявлена при методике ISTA, тогда как в ВИРе, УО БГСХА выполнение за 4,5 ч. Общая продолжительность анализа по ISTA - 4,3 ч, что меньше в 4,3-4,7 или 6,9-7,7 раза к ВИРу и в 6,6-7,9 раза к УО БГСХА. Длительность анализа в методиках ВИР, УО БГСХА складывается за счет прохождения этапов экстракции, фиксации и окрашивания обычно в ночное время, что составляет 13-14 ч или допускает свыше суток (24-29 ч). Прогрессивным пунктом методики УО БГСХА является сокращенное время полимеризации геля (5-10 мин.), что меньше на 50-55 мин. к ВИРу и на 35-40 мин. к ISTA.

При суммировании времени полимеризации и ЭФ выявляется, что методика УО БГСХА позволяет выполнять на 50-55 мин. быстрее анализ по сравнению с ВИРом.

В табл. 4 произведено сравнение условий ЭФА авенинов овса по методикам ВИРа [4], ISTA [22] и УО БГСХА [15]. В сопоставлении обнаруживаются некоторые преимущества методики УО БГСХА. Они состоят в следующем: значительное сокращение продолжительности ЭФ - до 1 ч 45 мин. (без префореза) по сравнению с 5-ю часами по ISTA, и с 24-мя часами по ВИРу (префорез, хранение в течение ночи и основного ЭФ). По методике УО БГСХА ускоряется процесс ЭФ и за счет этого сокращается время на одни сутки. Отличие также состоит в параметрах напряжения, которые изменяются в ходе ЭФ - первые 15 мин. 150 В и в последующие 1,5 ч - 550 В, что способствует лучшему распределению белка в геле. Поэтому в методике ВИРа также напряжение имеет два параметра: первый час - 300 В и в последующие 3-3,5 ч- 600 В. В методике ВИР предусматривается взвешивание зерновки, что указывает на повышение точности анализа.

Таблица 4. Сравнение условий электрофореза авенинов овса по методикам ВИРа, ISTA и УО БГСХА

Использование методики УО БГСХА послужило для составления матриц ЭФС изученных районированных сортов, для их характеристики и паспортизации. На рис. 6 приведены матрицы ЭФС авенинов первого и второго биотипов овса Юбиляр и монотипного сорта Запавет, что позволяет видеть индивидуальность генотипа, достаточную информативность по составу и степени интенсивности компонентов.

Овес Запавет(2006)1)Овес Юбиляр (2002) 1биотип Овес Юбиляр 2 биотип

Рис. 6. МатрицыЭФС авенинов первого и второго биотипов овса Юбиляр и монотипного сорта Запавет

В табл. 5 приведено сравнение условий ЭФ белков ячменя по методикам ВИРа [4], ISTA [20, 21], ИОГен [6] и УО БГСХА [13].Выделены преимущества методики УО БГСХА в следующем: гель получается с хорошими механическими свойствами, разрешающая способность при этом не уменьшается [13]; гель быстро полимеризуется. Достигнуто сокращение времени прохождения белка в геле на 1,0-1,5 ч по сравнению с методиками ВИР, ISTA. Сокращено время фиксации и окрашивания до 2-3 ч. Для повышения разрешающей способности ведется в течение 30 мин. отмывка пластин геля со спектрами.

Таблица 5.Сравнение условий электрофореза белков ячменя по методикам ВИРа, ISTA [22], ИОГен и УО БГСХА

* ПААГ - полиакриламидный гель

Белки - гордеины имеют особые спектры вариабельности (полиморфизма) у изученных сортов ячменя, которые удобно использовать для характеристики и паспортизации селекционного материала [6, 13]. По результатам исследований составлен краткий каталог генетических формул гордеинов сортов ярового ячменя [12], некоторые контрастные из них представлены в табл. 6. Блок компонентов, включающий две позиции, имеет прописанные варианты через знак «+» (плюс) 18+23 по HRDA, что характеризует гетерогенность. У сорта Бровар такое представлено по трем блокам, связанное с широким спектром полиморфизма. Таким образом, посредством генетических формул выявляется запас внутрисортовой изменчивости. Гетерогенность блоков компонентов гордеина характеризует широкую экологическую пластичность сорта.

Таблица 6. Генетические формулы гордеина современных сортов ярового ячменя

Примечание: (2007) - год включения в Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород Республики Беларусь [1]; п - пивоваренный ячмень; 1) - формулы составили в соответствии с принципом записи, руководствуясь установленными вариантами блоков, приведенными в методике ИОГен [6]; 2) - блоки не обнаружены

Заключение

1. Метод ЭФА позволяет определить индивидуальные особенности сорта через сертификацию, которая возможна только с применением лабораторного сортового контроля. Народнохозяйственное значение конкретной методики определяется техническими условиями проведения анализа, трудоемкостью и экономической эффективностью.

2. Многолетняя работа с методом ЭФА позволила провести исследование по выявлению положительных (поэтапное изменение параметров силы тока, напряжения; дополнительная отмывка; взвешивание зерновки, включение стандарта) и отрицательных (большая продолжительность анализа, необоснованное повышение расхода реактивов, высокие расходы электроэнергии) технических сторон основных существующих методик.

3. Предложены критерии выбора методики ЭФА с использованием приоритета минимизации затрат. Последнее предусматривает получение статистически достоверного результата различными методиками с меньшими затратами. Метод статистического анализа изложен в методиках УО БГСХА [9-12; 17], стандартах [23], статье [13]. В качестве важного аспекта следует признать общую продолжительность ЭФ. Для оборудования, непрерывно подключенного к сети, энергосбережение является ключевым показателем экономической эффективности процесса.

4. Суммируя результаты сопоставления, можно утверждать, что от методики зависит продолжительность анализа, точность, качество спектра и оборудование. Составлены матрицы ЭФС запасных белков сортообразцов и районированных сортов озимой пшеницы, ячменя, овса, зернобобовых, гибридов сахарной свеклы. Разработаны стандартные методики с краткими каталогами [5, 6, 7, 18], каталогом ЭФС гибридов сахарной свеклы [4], СТБ [21, 22, 23], что обеспечило создание нормативной базы для работы с методом ЭФ в сортовом контроле.

5. Методики УО БГСХА отличаются использованием только ПААГ, более быстрой полимеризацией и прочностью геля, повышенной разрешающей способностью[13]. Для бобовых достигнута минимальная продолжительность полимеризации (5-10 мин.), что сокращает анализ на 50-40 мин. Для ячменя сокращено время ЭФ на 1,0-1,5 ч и на 2,0-3 ч для фиксации, окрашивания. Для овса ведется ЭФ за 1,45 ч, что ускоряет процесс на сутки. Для пшеницы, тритикале ЭФ составляет 3,0-3,5 ч, что меньше на 2,5 ч по сравнению с ВИРом.

6. Технические характеристики методик УО БГСХА позволяют сократить время на проведение анализа, не требуют больших капиталовложений. Перспективным направлением является освоение выпуска оборудования в Республике Беларусь. При создании своих приборов ЭФ рекомендуется ориентироваться на размеры пластин, указанные в испытанных методиках.

7. Выявлено, что при определении подлинности сорта в качестве стандарта целесообразнее использовать оригинальный образец, а при идентификации генотипов - протеиновую (ISTA) или соевую шкалу (УО БГСХА). Составлены матрицы ЭФС запасных белков сортов биотипов зернобобовых, овса, пшеницы, тритикале.

8. Для записи ЭФС ячменя применен генетический способ посредством выделения блоков компонентов в составлении белковых формул образца.

Литература

1. Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород / отв. ред. С.С. Танкевич.2010. 189 с.

2. Семена кукурузы. Метод определения уровня гибридности и маркирование инбредных линий:ГОСТ СТБ 1710-2006. Введен в действие Постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 30 декабря 2006 г. №66. Минск, 2006. 11 с.

3. Семена сахарной свеклы. Определение подлинности гибрида и сортовой принадлежности методом электрофоретического анализа запасных белков 11S-глобулинов:ГОСТ СТБ 1759-2007. Введен в действие Постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 28 июня 2007 г.№35. Минск, 2007 14 с.

4. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян / под ред. акад. РАСХН В.Г. Конарева. СПб.: ВИР, 2000. 186 с.

5. Инновационные разработки Белорусской государственной сельскохозяйственной академии / авт.-сост. А.Р. Цыганов, М.В. Шалак, В.М. Лившиц. Могилев: Могилевская обл. укруп. тип. им. С. Соболя, 2005. 240 с.

6. Методика проведения лабораторного сортового контроля по группам сельскохозяйственных растений / сост. А.А. Поморцев [и др.]. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2004. 96 с.

7. Семена кукурузы. Метод определения типичности самоопыленных линий и уровня гибридности семян первого поколения гибридов кукурузы:ОСТ 10003-93. Введ. 1993-11-01. М.: Изд-во стандартов, 1993. 17 с.

8. Петрова, Н.Н. Каталог электрофоретических спектров и белковых формул гибридов сахарной свеклы / Н.Н. Петрова, С.В. Егоров. Горки: Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, 2009. 33 с.

9. Петрова, Н.Н. Семена бобовых. Определение сортовой принадлежности, сортовой чистоты и генетического качества методом электрофоретического анализа запасных белков: методика определения / Н.Н. Петрова, С.В. Егоров. Горки: Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, 2009. 29 с.

10. Петрова, Н.Н.Семена пшеницы и тритикале. Определение сортовой принадлежности, сортовой чистоты и генетического качества методом электрофоретического анализа запасных белков: методика определения и краткий каталог спектров глиадина / Н.Н. Петрова, С.В. Егоров. Горки: Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, 2009. 40 с.

11. Петрова, Н.Н. Семена сахарной свеклы. Определение уровня гибридности семян гибридов первого поколения и оценка сортовой чистоты методом электрофоретического анализа запасных белков 11S-глобулинов: методика определения / Н.Н. Петрова, Т.В. Кардис, М.П. Акулич. Горки:Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, 2005. 18 с.

12. Петрова, Н.Н. Семена ячменя. Определение сортовой принадлежности и оценка сортовой чистоты методом электрофоретического анализа запасных белков зерна: методика определения и краткий каталог спектров гордеина / Н.Н. Петрова, С.В. Егоров.Горки:Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, 2009. 36 с.

13. Петрова, Н.Н. Улучшенный ПААГ метод для идентификации гордеина генотивов ячменя / Н.Н. Петрова, Т.В. Кардис, С.В. Егоров// Вестник БГСХА. 2009. №2. С. 53-59.

14. Разработка государственных стандартов Республики Беларусь: отчет о НИР / Белорусская государственная сельскохозяйственная академия; Горки, 2006. 67 с.№42.

15. Разработка и внедрение стандартных методик электрофоретического анализа белков семян ячменя, овса, льна для проверки качества семенной продукции и биохимической паспортизации сортов: отчет о НИР / Белорусская государственная сельскохозяйственная академия; Горки, 2008. 107 с.№35/2.

16. Разработка и внедрение современных методик по стандартизации семенной продукции на основе лабораторного, сортового контроля, биохимической паспортизации сортов зерновых и зернобобовых культур: отчет о НИР /Белорусская государственная сельскохозяйственная академия. Горки, 2007. 110 с.№35/2.

17. Семена кукурузы. Определение уровня гибридности семян гибридов первого поколения и оценка однородности и маркирование инбредных линий: методика определения / Белорус. гос. с.-х. акад.; сост. Н.Н. Петрова, Т.В. Кардис, М.П. Акулич. Горки: БГСХА, 2005. 15 с.

18. Стандартный эталонный метод верификации видов гороха (Pisum) и райграса (Lolium) посредством метода электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) // Международные правила контроля качества семян. ISTA, Цюрих, Швейцария, 1996 г.

19. Сидорова, В.В. Анализ и регистрация линий, сортов и гибридов кукурузы по зеину методом электрофореза: методические указания и каталог белковых формул / В.В. Сидорова, Г.В. Матвеева, Г.И. Тимофеева // ВИР. СПб, 1998. 50 с.

20. Cook, R.J. Handbook of variety testing. Electrophoresis handbook: variety identification. ISTA, 1992. 25p.

21. Coopke, R..J. Modern methods for cultivation and the trasgenetic plant challenge / R.J. Cooke // Abstracts of 25th Intern. Seed Testing Congress (Pretoria, Aopril 15-24, 1998), ISTA. Zurich, 1998. P. 9-10.

22. Internatsional Rules for Seed Testing / Internatsional Seed Testing Association, 1996. SeedSci. Technol., 24, Supplement.

23. ISO 8981:1993. Пшеница. Определение сортов методом электрофореза. Изданиепервое. Официальный перевод БелГИСС, 1993. 16 с.

24. Konarev, V. Biochemical Identification of Varieties / V. Konarev, I. Gavriljuk Mater. of III Int. Symp. ISTA (1987). L., 1988. 257 p.

25. Sustar-Vozlic, J. 4th ISTA / FAO Workshop - Electrophoretic & PCR-based methods for Varietal Verification & GMO Detection. - Ljubljana, Slovenia, July 10-14, 2004.

Размещено на Allbest.ur