Выделение и отбор нетрансдуцирующих бактериофагов E.coli для противоколибактериозных препаратов

Размещено на http://www.allbest.ru/

22

Размещено на http://www.allbest.ru/

Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства

Выделение и отбор нетрансдуцирующих бактериофагов E.Coli для противоколибактериозных препаратов

Скобликов Николай Эдуардович к. мед. н.

Кононенко Сергей Иванович д. с.-х. н., доцент

Осепчук Денис Васильевич д. с.-х. н.

Москаленко Елена Александровна к. техн. н.

Авдиенко Валентина Викторовна м. н. с.

Зимин Андрей Антонович к. б. н.

Аннотация

Было проведено выделение фагов E.coli из проб природных и сточных вод, полученных во время экспедиций в различных регионах РФ (Краснодарский и Приморский края, Астраханская и Московская области). Полученные фаги (286 изолятов) были исследованы на их способность к литической активности в отношении предварительно сформированной коллекции патогенных штаммов кишечной палочки (Escherichia coli, E. coli) - возбудителей колибактериоза у свиней в Краснодарском крае. Была проведена их молекулярно-генетическая характеризация, оценка их способности к трансдукции, биотехнологические параметры. Впервые для конструирования экспериментальных ветеринарных фаговых препаратов отобрано 5 коли-фагов, демонстрировавших литическую активность в отношении спектра патогенных E.coli, при этом не обладающих способностью к трансдукции плазмид. По результатам ПЦР-анализа было показано, что все исследованные фаги являются представителями фагов Т4-типа семейства Myoviridae, различаясь при этом по спектру генов 32 и hoc. Исследование ростовых свойств фагов показал, что все пять отобранных фагов обладают достаточной продуктивностью для использования в качестве основы конструирования фаговых препаратов, предназначенных для контроля колибактериозов.

Ключевые слова: бактериофаги, трансдукция генов, e. coli, колибактериоз, фаготерапия

Бактериофаги - вирусы бактерий - стали использоваться в качестве лечебных средств практически сразу после их открытия, начиная с 1920-х годов [1]. В середине XX века, после открытия антибиотиков, интерес к бактериофагам, как к антибактериальным агентам, значительно снизился, особенно в западных странах [2]. Кроме того, причиной такого забвения были недостатки в методах очистки и выделения бактериофагов и не сложившаяся практика их использования в терапии [3]. Новый интерес к фагопрофилактике и фаготерапии (как и к пробиотикам [4]) возник в 1990-е годы, будучи стимулированным увеличением абсолютного и относительного количества штаммов патогенных бактерий, устойчивых к антибиотикам, а также ростом числа летальных исходов от инфекций, раньше не представлявших такой опасности [3, 5, 6].

По сравнению с антибиотиками, бактериофаги обладают рядом значительных преимуществ: 1) специфично действуют на определенные виды и даже штаммы бактерий, не поражая нормофлору кишечника (благодаря этому могут сочетаться с применением пробиотических препаратов [7, 8]); 2) инертны в отношении эукариотических клеток животного (не оказывают токсического и сенсибилизирующего эффекта); 3) способны к саморазмножению с последующей самоэлиминацией.

Несмотря на очевидные преимущества, препараты на основе бактериофагов обладают рядом недостатков, таких как: 1) возможность развития фагорезистентности; 2) узкий спектр эффективности (в рамках одного рода и даже нескольких штаммов в пределах вида бактерий); 3) относительно небольшая стабильность препаратов; 4) участие фагов в горизонтальном переносе генов. Тем не менее, при развитии инфекционного процесса, вызванного полирезистентными штаммами бактерий, бактериофаги остаются единственным средством эффективной этиотропной терапии. Что касается перечисленных недостатков бактериофагов, то в настоящее время существуют их эффективные решения. Так, фагорезистентность компенсируется чрезвычайным «эволюционным полиморфизмом» бактериофагов: в отношении каждого штамма бактериального патогена активно значительно большее количество бактериофагов. Проблема узкой направленности действия фагов решается сочетанным применением фагов с различным спектром специфичности. Относительно меньшая стабильность получаемых фаговых препаратов сейчас успешно решается с развитием методов биотехнологии, позволяющих стабилизировать хранение препарата и смягчить требования к условиям его применения.

Одним из значимых ограничений фаготерапии является участие бактериофагов в горизонтальном переносе генов - трансдукции - способности передавать от бактерии к бактерии гены, приобретённые в процессе предыдущего цикла литического развития [9, 10], в том числе - гены антибиотикорезистентности [11, 13, 14] и даже биплазмидные системы, содержащие такие гены [12]. В медицине важность определения трансдуцирующего потенциала фагов признана одним из параметров отбора бактериофагов по критерию генетической безопасности [15]. В то же время, несмотря на интенсивный поиск новых средств контроля инфекций [16], определение трансдуцирующего потенциала бактериофагов в области ветеринарии до последнего времени обойдена вниманием.

Поскольку в качестве модели изучения трансдукции традиционно использовался такой объект, как кишечная палочка, Escherichia coli (E. coli), оптимальной моделью изучения применения нетрансдуцирующих фагов в сельском хозяйстве может служить именно эшерихиоз (колибактериоз), в особенности - колибактериозы свиней [17]. Результаты работ по изучению антибактериального потенциала нетрансдуцирующих бактериофагов на модели эшерихиозов (колибактериозов) свиней позволят установить биоразнообразие нетрансдуцирующих фагов, эффективных в отношении патогенных для свиней эшерихий, изучить их эффективность in vivo и разработать генетически безопасные препараты для фаготерапии.

Целью исследований было формирование и характеризация рабочей коллекции нетрансдуцирующих бактериофагов E. coli (колифагов) для последующего их использования в качестве основы экспериментальных фаговых препаратов, применяемых для профилактики колибактериоза.

Новизна исследований заключалась в том, что впервые была сформирована и молекулярно-генетически охарактеризована рабочая коллекция нетрансдуцирующих колифагов, литически активных в отношении патогенных E. coli - возбудителей колибактериоза поросят.

Материал и методика исследований. Формирование рабочей коллекции патогенных изолятов E.coli. Для определения эффективности проектируемых экспериментальных фаговых препаратов, требовалось предварительное проведение проверки их бактериолитических свойств в отношении некоторого ассортимента патогенных бактерий-мишеней. Для этого реализовали формирование рабочей коллекции выделенных в регионе возбудителей кишечного эшерихиоза для постановки опытов in vitro.

Отбор патогенных изолятов E.coli в коллекцию производился по результатам микроскопического, культурального (бактериологического) и серологического методов микробиологической диагностики инфекций из биоматериала поросят (фекалии, секционный материал) с установленным диагнозом кишечного колибактериоза (эшерихиоза).

Для выделения колифагов из природных источников и для оценки их бактериолитической активности использовались непатогенные лабораторные штаммы E.coli: B, BE, B834, C600, K-802.

Формирование рабочей коллекции фагов E. coli. Для получения набора бактериофагов - потенциальных кандидатов для конструирования экспериментальных фаговых препаратов проводилось формирование рабочей коллекции фаговых изолятов. Поскольку в естественных условиях бактериофаги чаще всего обнаруживаются в экотопах бактерий-хозяев, оптимальным объектом для выделения коли-фагов являются сточные воды и фекалии животных. Отбор проб водных экосистем и сточных вод производился как в самом крае, так и в регионах России, относительно схожих по эколого-климатическим условиям с Краснодарским краем, но удалённых от него географически. Также проводилось выделение фагов из фекалий поросят и свиноматок в Краснодарском крае.

Выделение коли-фагов проводили путём высева проб на культуру лабораторных штаммов E.coli, инкубирования при 37єC (24 ч) и отбора образовавшихся бляшек, содержащих фаги для дальнейшего исследования.

Бактериофаги сформированной коллекции тестировались на литическую активность в отношении выделенных патогенных E.coli. Исследование литической активности выделенных бактериофагов в отношении патогенных E.coli сформированной рабочей коллекции также проводилось по обнаружению феномена бляшкообразования на культурах бактерий, выращенных на среде LB [18].

Параллельно с определением активности фагов в отношении выделенных патогенных E.coli, проводилась оценка их способности к культивированию на непатогенных лабораторных штаммах E.coli для препаративного получения больших количеств фагов, поскольку при использовании в качестве основной бактериальной культуры патогенных эшерихий существует вероятность сохранения (после лизиса клеток) бактериальных токсинов в конечном препарате.

Проверка способности выделенных коли-фагов к трансдукции производилась с помощью штамма E.coli С600 и плазмиды pBR322 [10].

Молекулярно-генетическая характеризация бактериофагов. Молекулярно-генетическую характеризацию бактериофагов проводили для детекции генетических маркеров, характерных для фагов Т4-типа семейства Myoviridae, поскольку бактериофаг Т4 дикого типа не способен осуществлять трансдукцию по причине замещения в ДНК цитозина гидроксиметилцитозином, вследствие чего его геном кодирует ферменты, разрушающие цитозин-содержащую ДНК бактерий [15]. Для определения этих маркеров, а также для оценки вариабельности коли-фагов по наличию гена hoc (кодирующего иммуноглобулиноподобный белок капсида) использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специальными праймерами (таблица 1).

Таблица 1 _ Праймеры, использовавшиеся для молекулярно-генетической характеризации бактериофагов

Для проведения ПЦР готовили смесь следующего состава: буфер B305 (СибЭнзайм) (60 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 1.5 mM MgCl₂; 25 mM KCl; 10 mM 2-меркаптоэтанол; 0.1% Тритон X-100), 2 мМ MgCl_2, dNTP - 0,2 мМ каждого, праймеры по 5 пмоль на пробу, ДНК-полимераза Taq (СибЭнзайм) по 1 еденице активности на пробу. В каждую пробирку вносили по 0,2 мкл пробы фагового лизата бактерий. ПЦР проводили на амплификаторе MJ Mini (Bio-Rad,США) по следующей программе: 94°С - 90 с; 2 цикла: денатурация - 94^оС, 45 с; отжиг -- 61^оС* (56 ^оС)**, 60 с; элонгация - 72^оС, 120 с. Далее 28 циклов: денатурация - 94^оС, 15 с; отжиг -- 61^оС для праймеров MZia1 и Cap8 (56^оС для праймеров FR60 и FR61), 30 с; элонгация - 72^оС, 45 с. После окончания амплификации полученную ДНК разделяли электрофоретически в 1,2% агарозном геле, приготовленном на TBE-буфере [17]. Фрагменты ДНК после ПЦР разделяли в горизонтальном электорофорезе в геле 1% агарозы.

Результаты исследований и их обсуждение. Формирование рабочей коллекции патогенных изолятов E. coli. По результатам определения биохимической активности и проведения серологической идентификации, была сформирована рабочая коллекция (15 штаммов из шести районов Краснодарского края) выделенных в регионе патогенных E. coli, изолированных из биоматериала поросят с установленным диагнозом кишечного колибактериоза.

Штаммы E. coli с условными лабораторными номерами Ec-26 и Ec-27 были выделены от павших от эшерихиоза поросят свинофермы Тихорецкого района. Штаммы Ec-23, Ec-24, Ec-25 и Ec-29 были выделены от павших поросят двух свиноферм Кавказского района. Штаммы Ec-21 и Ec-22 были изолированы от мумифицированных плодов свиноматок, заболевших кишечным эшерихиозом. Штаммы Ec-28 (Кавказский район), Ec-31 и Ec-32 (оба - Северский район) были выделены от павших поросят. Штаммы Ec-01 и Ec-02 (г. Краснодар), а также Ec-04 и Ec-12 (Новокубанский район) были выделены из фекалий поросят с диареей.

В качестве тестовых были отобраны штаммы E. coli с условными лабораторными номерами Ec-24, Ec-29, Ec-31, Ec-32.

Формирование рабочей коллекции фагов E. coli. Всего было отобрано и исследовано на содержание 92 пробы, послуживших источниками коли-фагов (таблица 2).

Таблица 2 _ Список проб, использованных для выделения бактериофагов E. coli

Из указанных проб было выделено 286 фагов, продемонстрировавших литическую активность в отношении лабораторных штаммов E. coli. Лишь 19 из 286 фагов способны лизировать хотя бы 3 из 15 патогенных штаммов E.coli. Активность в отношении наиболее патогенных штаммов E.coli, отобранных в качестве тест-штаммов (Ec-24, Ec-29, Ec31, Ec-32) демонстрировали лишь 14 фагов. Из них лишь 12 фагов были способны к росту на трёх непатогенных лабораторных штаммах E. coli (B, K-802 и C-600), которые предполагалось использовать в качестве основных производственных штаммов (таблица 3).

Таблица 3 _ Литическая активность бактериофагов рабочей коллекции в отношении патогенных и лабораторных E.coli

Примечание: * - Краснодарский край; ** - Приморский край.

По результатам проведения оценки способности фагов к трансдукции выяснилось, что только 5 фагов (№ 3, № 6, № 8, № 9, № 15 в таблице 3) не трансдуцировали плазмиды антибиотикорезистентности. Три из них (№ 6, № 8, № 9) были выделены из речных проб Приморского края (р-н г. Владивосток), два (№ 3, № 15) - из сельскохозяйственных экотопов свинофермы ОПХ «Рассвет», пос. Знаменский, г. Краснодар. Эти фаги были отобраны в качестве основы для экспериментальных препаратов.

Молекулярно-генетическая характеризация бактериофагов.

По результатам ПЦР-анализа отобранных фагов на наличие генетических маркеров, характерных для фагов Т4-типа, - гена 23 (праймеры MZia1 и Cap8) и гена 32 (праймеры FR60 и FR61) было установлено, что все фаги принадлежат к Т4-типу семейства Myoviridae. Причём, если по наличию гена 23 (кодирующего основной белок капсида) были положительны все 5 фагов, то по гену 32 - только фаг № 6 (рис. 1).

Рис. 1. _ Электрофореграмма продуктов амплификации фагов с праймерами FR60 и FR61 K - фаги Т4 (положительный контроль); 3-15 - фаги с соответствующими лабораторными номерами.

Результаты исследования вариабельности T4-фагов по наличию гена hoc показали, что из пяти отобранных фагов № 3 и № 6 были отрицательны, остальные - положительны (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации фагов с праймерами hoc1fR и hocCrH K - фаги Т4 (положительный контроль); 3-15 - фаги с соответствующими лабораторными номерами.

генетический колибактериоз кишечный бактериофаг

Заключение

В результате проведённых исследований был отработан алгоритм выделения и отбора коли-фагов из природных экотопов различных регионов РФ, характеризующихся экологической схожестью, но географической удалённостью. При этом из рабочей коллекции из 286 природных бактериофагов, выделенных из природных и сточных вод, всего 5 фагов были нетрансдуцирующими плазмиды антибиотико-резистентности, эффективные в отношении патогенных E. coli. Все пять фагов характеризовались высокой продуктивностью при культивировании на непатогенных лабораторных штаммах E. coli. По данным молекулярно-генетического анализа все отобранные фаги являлись бактериофагами Т4-типа семейства Myoviridae; при этом отмечалась их вариабельность по наличию генов 32 и hoc. Полученные результаты послужат основой для конструирования новых эффективных и генетически безопасных фаговых препаратов для сельского хозяйства.

Список литературы

1. d'Herelle F. Bacteriophage: its Role in Immunity. Baltimore: Williams & Wilkins, 1922. 287 p.

2. Inal J.M. Phage therapy: a reappraisal of bacteriophages as antibiotics // Arch. Immunol. Ther. Exp. 2003. V. 51. № 4. P. 237-244.

3. Summers W.C. Felix d'Herelle and the Origins of Molecular Biology. New Haven, CT: Yale University Press, 1999. 230 p.

4. Кощаев А.Г. Пробиотик Трилактобакт в кормлении перепелов / А.Г. Кощаев, О.В. Кощаева, С.А. Калюжный // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2014. № 95. С. 633-647.

5. Barrow P.A. and Soothill J.S. Bacteriophage therapy and prophylaxis: rediscovery and renewed assessment of potential // Trends in Microbiology 1997. №. 5. P. 268-271.

6. Follet G. Antibiotic Resistance In The EU Science, Politics, And Policy // AgBioForum. 2000. V. 3. № 2-3. P. 148-155.

7. Скобликов Н.Э. Комбинированное применение нетрансдуцирующих бактериофагов E.coli с пробиотиком в пост-отъёмном периоде у поросят / Н.Э. Скобликов, С.И. Кононенко, А.А. Зимин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета, 2012. - №78. - С. 599-609.

8. Скобликов Н.Э. Эффективность различных способов применения нетрансдуцирующих бактериофагов e.coli для профилактики пост-отъёмной диареи поросят / Н.Э. Скобликов, С.И. Кононенко, А.А. Зимин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета, 2012. - №78. С. 653 - 664.

9. Morse M.L., Lederberg E.M., Lederberg J. Transduction in Escherichia coli K-12 // Genetics. 1956. V. 41. № 1. P.142-156.

10. Saunders J.R., Allison H., James C.E. Phage-mediated transfer of virulence genes // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2001. V.76. P.662-666.

11. Таняшин, В.И. Трансдукция детерминант антибиотикорезистентности плазмид псевдо-Т-четными бактериофагами / В.И. Таняшин, А.А. Зимин, М.Г. Шляпников, А.М. Боронин // Генетика. 2003. Т. 39. №7. С. 1-13.

12. Таняшин В.И. Котрансдукция плазмид системы pET мутантами бактериофагов T4 и RB43 / В.И. Таняшин, А.А. Зимин, А.М. Боронин // Микробиология. 2003. Т. 72. № 6. С. 785 - 791.

13. Wilson G.G., Young K.K.Y., Edlin G.J., Konigsberg W.J. High frequency generalized transduction by bacteriophage T4 // Nature. 1979. V. 280. № 17. P. 80-82.

14. Young K.K.Y., Edlin G.J. Physical and genetical analysis of bacteriophage T4 generalized transduction // Molec.Gen.Genet. 1983. V. 192. P. 241-249.

15. Sulakvelidze, A., and E. Kutter. Bacteriophage therapy in humans, p. 381-436. In E. Kutter and A. Sulakvelidze (ed.), Bacteriophages: Biology and Applications. Boca Raton: CRC Press, 2005. 513 p.

16. Masatoshi Yoichi, Masatomo Morita, Katsunori Mizoguchi et al. The criterion for selecting effective phage for Escherichia coli O157:H7 control // Biochem. Engineering J. 2004. V 19. P. 221-227.

17. Fairbrother J.M., Nadeau E., Gyles C.L. Escherichia coli in postweaning diarrhea in pigs: an update on bacterial types, pathogenesis, and prevention strategies // Anim Health Res Rev. 2005. V.6. № 1. P. 17-39.

18. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т.И. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Изд-во: М.: Мир, 1984. 480 c.

Размещено на Allbest.ru