Генотипирование продуктивных протоклонов трех технических сортов винограда с использованием микросателлитных маркеров

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кубанский государственный аграрный университет

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ПРОДУКТИВНЫХ ПРОТОКЛОНОВ ТРЕХ ТЕХНИЧЕСКИХ СОРТОВ ВИНОГРАДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЁРОВ

Милованов Александр Валериевич

учебный мастер, аспирант

Звягин Андрей Сергеевич к.б.н.

Трошин Леонид Петрович д.б.н., профессор

Краснодар, Россия

В представленной статье освещено исследование по генотипированию продуктивных протоклонов трех технических сортов винограда: Рислинг рейнский, Вердо черный и Йоханнитер

Ключевые слова: ВИНОГРАД, ПРОТОКЛОН, СОРТ, SSR-МАРКЁР, ПЦР, МИКРОСАТЕЛЛИТЫ, ДНК, НУКЛЕОТИД

Достаточно консервативное население нашей страны, привыкшее к стандартным маркам вин, с каждым годом потребляет все больше и больше винных продуктов. Один из путей решения данной проблемы - улучшение существующих «традиционных» сортов винограда, таких, как например Рислинг рейнский. В данном исследовании усовершенствование названного сорта и других шло методом клоновой селекции [1-3].

ДНК-маркеры описывают генотип независимо от фенотипа: этим обеспечивают богатство полиморфизмов, позволяющих идентифицировать сорта и строить точные генетические карты по многим высшим растениям. Высокий уровень генетического разнообразия винограда вызывает интерес к оценке генетического родства внутри подвида Vitis vinifera sativa D.C., а также необходимость улучшения распознающих систем, пригодных для идентификации виноградных сортов. Это подталкивает к попыткам интегрировать и эксплуатировать данные генотипов, которые выявлены среди микросателлитных локусов в винограде [4-5, 11].

Молекулярные маркеры имеют огромный потенциал для поиска генетических различий между генотипами и выявления разнообразия среди генотипов. Для данных исследований SSR-маркёры являются наиболее подходящими из-за их кодоминантности, большого числа повторов, высокой частоты и обилия в селективно нейтральной области. Для винограда создаются высоко насыщенные микросателлитные карты. Данные маркеры оказались полезными для установления «личности» генотипов, фингерпринтинга и анализа разнообразия подвоев, сортов и межвидовых гибридов [6, 10].

Первые результаты по дифференциации клонов генетическими маркерами показывают, что эта тема ограничивается количеством использованных локусов. Если использовать большое количество маркёров, вероятность найти разнообразие аллелей увеличивается. Самые разнообразные методы могут применяться для поиска полиморфизма среди культурных сортов. Для идентификации клонов только характеризующие маркеры будут проявлять ценность в анализе [9].

В текущем году на кафедре виноградарства продолжилась работа по генотипированию новых технических продуктивных протоклонов винограда, которые показали фенотипические отличия от стандарта в результате ампелографического скрининга. По морфологической схожести образцы поделены на группы для молекулярно-генетического анализа. Результаты работы приведены ниже в виде фото фореграмм (рис. 1-8).

Материалы и методы

Для анализа были отобраны листья сортов и протоклонов винограда (табл. 1). Сбор образцов для молекулярно-генетического анализа производился на участках учхоза «Кубань» Кубанского госагроуниверситета и в насаждениях агрофирмы «Фанагория» Темрюкского района Краснодарского края. Для сохранения листья нижеперечисленных генотипов были помещены в морозильную камеру при - 20 ⁰С.

Таблица 1

Исследуемые протоклоны и сорта винограда

Выделение ДНК из свежих листьев осуществляли модифицированным СТАБ-методом [1-3]. ПЦР проводилась по параметрам, описанным в монографии А.С.Звягина «Молекулярно-генетические исследования полиморфизма винограда» [11-13]. Для анализа генетического разнообразия были использованы 6 нейтральных микросателлитных маркеров (праймеров): VrZag62, VrZag79, VVMD5, VVMD7, VVMD27 и VVS2 [7-8, 12-14].

Разделение продуктов амплификации проводили методом электрофореза в 6% акриламидном геле. Далее пластины вымачивались в течение 10-15 минут в бромистом этидии и фотографировались в ультрафиолетовом свете. Анализ полученных фотоснимков проводили в программе Gel-Pro Analyser [1-5].

Задача исследований - поиск фенотипических сходств и генетических различий среди представленных в табл. 1 образцов по 6 аллелям.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты исследований представлены в виде фотографий фореграмм и таблицы 2 с данными, полученными после их анализа.

Ниже приводятся восемь фото фореграмм локусов (рис. 1-8). Всего описывалось 24 образца из общего количества в 56, которые составили макрогруппу технических протоклонов и сортов, произрастающих в Темрюкском районе Краснодарского края.

mw К* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 mw 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 mw**

*- где К - отрицательный контроль;

**- mw - маркер молекулярного веса.

Рис. 1 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VrZag62

mw 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 mw 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 mw

Рис. 2 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VrZag62

mw К 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 mw 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 mw

Рис. 3 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VrZag79

mw 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 mw 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 mw

Рис. 4. Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VVMD5

mw 30 29 28 27 26 25 mw 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 K mw

Рис. 5 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VVMD7

mw 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 mw 50 51 52 53 54 55 56 mw

Рис. 6 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VVMD7

mw 30 29 28 27 26 25 mw 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 k mw

Рис. 7 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VVMD27

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 mw 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Рис. 8 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VVS2

В качестве ссылок-«камертонов» в наших исследованиях, согласно дескриптору OIV, были использованы сорта Каберне-Совиньон и Пино гри (Пино серый).

Следует сказать, что отсутствие аллелей остается спорным фактом ввиду отсутствия более продвинутого оборудования и химических реактивов. Также следует заметить, что ввиду погрешности акриламидного геля существенным не считалось различие в 3 и менее нуклеотидов, хотя различие и в 4-5 тоже, зачастую, вызывает вопросы.

Таблица 2

Размер микросателлитных аллелей исследуемых протоклонов и сортов винограда

*- размер аллелей указан в парах нуклеотидов; **- Н/Д (нет данных) аллель не амплифицировалась после четырех-пяти кратного повтора.

Обсуждение

Для удобства, протоклоны по фенотипической схожести были поделены на четыре блока.

1. В блоке «Рислинг» контрольным образцом был Рислинг 492. От него протоклон Рислинг 130 отличается по аллелям VrZag79 и VVMD5, на 18 и 15, 38 и 27 нуклеотидов. Рислинг 143143111 отличается от контроля по аллелям VrZag62, VrZag79, VVMD5 и VVMD7 на 8 и 10, 29 и 9, 41 и 30, а также 25 и 15 нуклеотидов. Рислинг 245-5 отличается по локусам VrZag62, VrZag79 и VVMD5 на 8 и 12, 29 и 5, 40 и 25 нуклеотидов. Рислинг 245-7 отличается по аллелям VrZag62, VrZag79, VVS2, VVMD5, на 6, 29, 6, 32 и 26 нуклеотидов. Локус VVMD27 не обнаружен. Рислинг 31411111 отличается по аллелям VrZag62, VVMD5 и VVMD7 на 6, 41 и 35, 27 нуклеотидов. Рислинг 3142092 отличается по локусам VrZag79 и VVMD5 на 18 и 17, а также 38 и 27 нуклеотидов. Рислинг 3144111 отличается по микросателлитам VrZag62, VrZag79, VVMD5 и VVMD7 на 10 и 12, 24 и 8, 40 и 34 нуклеотидов. Рислинг 3144111 отличается по аллелям VrZag62, VrZag79, VVMD5 и VVMD7 на 8 и 10, 29 и 27, 42 и 36, 21 нуклеотид. Рислинг 314991 отличается по локусам VrZag62, VVMD5 и VVMD7 на 8 и 8, 40 и 34, 27 нуклеотидов. Рислинг 7111891 отличается по микросателлитам VVMD5 и VVMD7 на 40 и 27, 23 нуклеотида. Рислинг 7121431 отличается по аллелям VrZag62, VrZag 79 и VVMD5 на 8 и 10, 18 и 9, 38 и 28 нуклеотидов, аллели VVS2, VVMD7 и VVMD27 не были обнаружены. Рислинг 7-12-201 15-11-24-15 отличается по микросателлитам VrZag62, VrZag79 и VVMD7 на 9 и 6, 20 и 19, 27 нуклеотидов, аллели VVMD5 и VVMD27 не были обнаружены. Рислинг 7151077п отличается по локусам VrZag62, VVMD5 и VVMD7 на 8 и 10, 40 и 30, 25 нуклеотидов. Рислинг 830 отличается от контроля по микросателлитам VrZag79, VVMD5 и VVMD7 на 8 и 9, 44 и 21, 23 и 9 нуклеотидов. Рислинг 964 отличается по локусам VrZag79 и VVMD5 на 18 и 21, 42 и 16 нуклеотидов. Рислинг 991 отличается от контроля по локусам VrZag62, VVMD5 и VVMD7 на 8 и 12, 21 и 27, 27 нуклеотидов. Рислинг клон отличается по аллелям VrZag79 и VVMD5 на 22 и 21, 38 и 25 нуклеотидов, локус VVMD27 не обнаружен.

2. Рислинг Алькадар 34б отличается от Рислинга Алькадар 34г по локусам VrZag79, VVMD5 и VVMD7 на 12 и 23, 6 и 11, 25 и 27 нуклеотидов.

3. Вердо черный 7-2 отличается от Вердо черный 7-6 по локусам VrZag62, VrZag79, VVS2, VVMD5 и VVMD7 на 8, 36 и 28, 9 и 10, 44 и 18 нуклеотидов, аллель VVMD27 в Вердо черный 7-6 не обнаружена.

4. Протоклон Йоханнитер 79-4 отличается от протоклона Йоханнитер 80-6 по локусу VVS2 на 8 нуклеотидов. Аллели VrZag62, VrZag79, VVMD7 и VVMD27 не амплифицировались у Йоханнитер 79-4. У протокдлона Йоханнитер 80-6 локус VVMD5 не выявлен.

Следует напомнить, что если аллель не обнаружена, то это не значит, что ее нет. Ответить на вопрос: «что же произошло?», может только секвенатор или же анализ на наличие SNP.

Выводы

протоклон сорт виноград генотипирование

По результатам многолетнего ампелографического скрининга технических популяций вышеназванных трех сортов винограда и подкрепленного молекулярно-генетическим анализом их выделенных продуктивных протоклонов на государственные испытания в разные годы были переданы следующие сорта-клоны: Рислинг Алькадар, Рислинг анапский, Рислинг Джемете, Рислинг прикубанский и Рислинг фанагорийский.

Литература

1. Звягин А.С. Выделение ДНК из гербарных листьев Vitis vinifera / Звягин А.С. // Научный журнал КубГАУ. 2010. № 58 (04).

2. Милованов А.В. Выделение ДНК при помощи peqgold plant dna mini kit / А.В. Милованов, Л.П. Трошин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. Краснодар: КубГАУ, 2013. № 06 (090). С. 167 - 176. IDA [article ID]: 0901306011. Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2013/06/pdf/11.pdf, 0,625 у.п.л., импакт-фактор РИНЦ=0,581.

3. Милованов А.В. Генотипирование сортов винограда по молекулярным маркёрам / А.В. Милованов, Л.П. Трошин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. Краснодар: КубГАУ, 2014. № 02 (096). С. 53 - 65. IDA [article ID]: 0961402005. Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2014/02/pdf/05.pdf, 0,812 у.п.л., импакт-фактор РИНЦ=0,346.

4. Трошин Л.П. Ампелографическая и селекционная научно-исследовательская работа Кубанского госагроуниверситета / Л.П. Трошин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) Краснодар: КубГАУ, 2012. № 07 (081). С. 524 - 544. IDA [article ID]: 0811207039. Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2012/07/pdf/39.pdf, 1,312 у.п.л., импакт-фактор РИНЦ=0,581.

5. Трошин Л.П., Радчевский П.П. Виноград: иллюстрированный каталог. Районированные, перспективные, тиражные сорта. Ростов н/Д: Феникс, 2010. 271 с.: ил. (Мир садовода).

6. Ajitpal Singh, Krishan Kumar, ManavIndra Singh Gill1, Parveen Chhuneja, Naresh Kumar Arora and Kuldeep Singh. Genotype identification and inference of genetic relatedness among different purpose grape varieties and rootstocks using microsatellite markers // African Journal of Biotechnology, 9 January 2013. Vol. 12 (2). P. 134-141.

7. Bowers J.E., Dangl G.S. and Meredith C.P. Development and characterization of additional microsatellite DNA markers for grape // Am. J. Enol. Vitic. 1999. V. 50, № 30. P. 243-246.

8. Bowers J.E., Dangl G.S., Vignani R. and Meredith C.P. Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.) // Genome. 1996. V. 39. P. 628-633.

9. Regner F., Hack R. and Santiago J. L. Highly variable Vitis microsatellite loci for the identification of Pinot Noir clones // HBLA u. BA fьr Wein und Obstbau, Klosterneuburg, Austria. Vitis, 45 (2), 85-91 (2006).

10. Zulini L., Russo M. and Peterlunger E. Genotyping wine and table grape cultivars from Apulia (Southern Italy) using microsatellite markers // Dipartimento di Produzione Vegetale e Tecnologie Agrarie (Universitа di Udine, Udine, Italia). Vitis, 41 (4), 183-187 (2002).

11. Maria Stella Grando, Claudia Frisinghelli. Grape microsatellite markers: Sizing of DNA alleles and genotype analysis of some grapevine cultivars // Istituto Agrario di San Michele all'Adige (San Micheleall'Adige, Italia). Vitis, 37 (2), 79-82 (1998).

12. Sefc K.M., Regner F., Tureschek E., Glossl J. and Steinkellner H. Identification of microsatellite sequences in Vitis riparia and their application for genotyping of different Vitis species // Genome. 1999. V. 42. P. 367-373.

13. Thomas M.R. and Scott N.S. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analysed as sequence-tagged sites (STSs) // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 86. P. 985-990.

14. Thomas M.R., Matsumoto S., Cain P. and Scott N.S. Repetitive DNA of grapevine: classes present and sequences suitable for cultivar identification // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 86. P. 173-180.

Размещено на Allbest.ru