Разработка методики идентификации клонов плюсовых деревьев ели обыкновенной (Picea abies L.) с использованием ISSR маркеров

Причины актуальности паспортизации лесосеменных плантаций. Проблема выбора надежных признаков для идентификации плюсовых деревьев. Разработка технологии идентификации клонов плюсовых деревьев Picea abies L. на основе использования ISSR маркеров.

Рубрика Сельское, лесное хозяйство и землепользование
Вид статья
Язык русский
Дата добавления 29.04.2017
Размер файла 251,1 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru

УДК 630*1; 577.29

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ИДЕНТИФИКАЦИИ КЛОНОВ ПЛЮСОВЫХ ДЕРЕВЬЕВ ЕЛИ ОБЫКНОВЕННОЙ (PICEA ABIES L.) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ISSR МАРКЕРОВ

Шейкина Ольга Викторовна

к.с-х.н., доцент

Прохорова Александра Александровна

аспирант

Новиков Петр Сергеевич

аспирант

Криворотова Татьяна Николаевна

аспирант

Поволжский государственный

технологический университет,

Йошкар-Ола, Россия

Разработана технология идентификации клонов плюсовых деревьев Picea abies L. на основе использования ISSR маркеров. Для генотипирования рекомендовано использовать 9 ISSR праймеров: (GA)9T; (AC)8C; (CA)6RY; (CA)6RG; (CA)6(GT); (CA)6(AC); (AG)8T; (GA)8С и (AG)8YT. Отобранные праймеры показали высокий уровень полиморфности. Всего при использовании 9 ISSR праймеров было обнаружено 172 амплифицированных фрагмента, из которых 149 (86,6%) оказались полиморфными

The technology for the identification of Picea abies L. clones by using ISSR markers was developed. 9 ISSR primers ((GA)9T; (AC)8C; (CA)6RY; (CA)6RG; (CA)6(GT); (CA)6(AC); (AG)8T; (GA)8С и (AG)8YT) were recommended to use for genotypes detection. The selected primers have shown the high level of polymorphism. A total of 172 amplified fragments were found by the selected primers and 149 (86.6%) of them were polymorphic

паспортизация лесосеменной дерево маркер

Ключевые слова: PICEA ABIES L., ПЛЮСОВЫЕ ДЕРЕВЬЯ, ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ, ISSR МАРКЕРЫ

Keywords: PICEA ABIES L., PLUS TREES, GENETIC IDENTIFICATION, ISSR MARKERS

Введение

До последнего времени в России исследования в области генетической идентификации проводились преимущественно для сельскохозяйственных, плодовых и декоративных растений [1, 2, 3, 4 и 5]. Однако, сейчас все чаще говорят о необходимости генетической идентификации плюсовых деревьев и паспортизации лесосеменных объектов [6, 7]. Актуальность паспортизации лесосеменных плантаций обусловлена двумя причинами: 1) необходимостью поверки схем смешения клонов с целью обеспечения пространственной изоляции одноименных клонов, так как известно, что самоопыление приводит к образованию пустых семян [8]; 2) возможностью выполнения генетической сертификации семян с лесосеменных плантаций в будущем. Кроме практической значимости, клоновая идентификация является необходимым условием для проведения различных исследований, в частности изучения особенностей семеношения и роста разных клонов, пыльцевого режима, оценки степени самоопыления и др.

Важной задачей является выбор надежных признаков для идентификации плюсовых деревьев. Хвойные виды, как и лиственные виды, имеют внутривидовые различия по морфологическим признакам [9, 10, 11]. Но при этом практически невозможно выделить какой-либо морфологический признак, по которому можно абсолютно точно отличить все плюсовые деревья друг от друга. Одним из возможных подходов генотипирования растений является использование аллозимного полиморфизма [12, 13, 14, 15, 16]. Но, необходимо отметить, что данный тип маркера имеет ограниченный полиморфизм и не всегда удается идентифицировать все исследуемые клоны, так как часть клонов могут иметь одинаковый спектр по включенным в анализ энзимам [17, 18]. Например, в работе W.T. Adams и R.J. Joly показано, что с использованием 15 аллозимных локусов удалось идентифицировать только 47 клонов Pinus taeda из 50 [19].

В настоящее время наиболее перспективными являются методы идентификации, основанные на использовании ДНК маркеров. Признанное лидерство принадлежит SSR маркерам (Simple Sequence Repeats) [18, 20]. Несомненными достоинствами микросателлитного анализа являются: высокий индивидуальный полиморфизм, кодоминантный тип наследования, высокая воспроизводимость метода. Сдерживающим фактором применения данного вида молекулярного маркера является более высокая стоимость.

Наиболее доступными в техническом плане являются ДНК маркеры направленные на изучение анонимного полиморфизма длин амплифциованных фрагментов ДНК (Random Amplified Polimorphic DNA (RADP) и Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)) [21]. Доступность RADP обусловлена тем, что существует огромное количество RADP прамеров и, как правило, трудностей по подбору высокополиморфных маркеров не возникает. Данный вид маркера успешно был использован для идентификации древесных видов [16, 22]. Существенным недостатком RADP метода анализа ДНК является низкая воспроизводимость разработанных методик в условиях разных лабораторий, так как данный вид анализ требует максимальной стандартизации всех условий анализа [18]. Межмикросателлитный анализ (ISSR) обеспечивает высокую разрешающую способность, характерную для RADP метода, но при этом вследствие использования праймеров большей длины и его комплементарности микросателлитному району, данный метод обладает хорошей воспроизводимостью.

ISSR анализ вошел в практику генетических исследований с 1994 году [24, 25] и сейчас достаточно широко используется в различных лабораториях [22, 26]. Основой метода является использование олигонуклеотидных праймеров, которые состоят из микросателлитных последовательностей и произвольной пары оснований на 3'- или 5'-конце. Данный метод не требует предварительного знания последовательности анализируемой ДНК, обеспечивает высокую воспроизмодимость результатов и, на наш взгляд, при условии подбора высокополиморфных праймеров, может быть успешно применен для генетической идентификации древесных растений.

Цель исследований заключалась в разработке технологии генетической идентификации клонов ели обыкновенной на основе использования ISSR маркеров.

Решаемые задачи.

Достижение поставленной цели предусматривает решение следующих задач:

1. обоснование выбора растительного материала - источника ДНК;

2. подбор высокополиморфных ISSR праймеров, являющихся перспективными для генетической идентификации ели обыкновенной и оптимизация режима полимеразной цепной реакции;

3. разработка протокола для подсчета молекулярных данных и составления генетического паспорта клона;

4. оценка уровня полиморфности отобранных ISSR праймеров.

Методы исследования

Современные исследования показали, что ДНК можно выделить практически из всех растительных тканей [26, 27, 28, 29]. Поэтому источником ДНК для генетической идентификации растения могут служить практически все части растения. Однако к используемому материалу можно выдвинуть следующие требования: доступность материала в любое время года, не трудоемкость сбора образцов, простота хранения и пробоподготовки. Всем этим требованиям отвечает хвоя, которую достаточно легко заготовить, высушить и хранить в условиях лаборатории.

В качестве растительного материала, служащим источником ДНК, в эксперименте была изучена замороженная и сухая хвоя, собранная в вегетационный период. Заморозка хвои производилась в морозильной камере в полиэтиленовых пакетиках. Сушка хвои производилась при комнатной температуре. Экстракция ДНК выполнялась с использованием методики Doyle J.J., и Doyle J.L. [30]. Клеточные стенки замороженной хвои разрушались путем перетирания в фарфоровых ступках с жидким азотом. Гомогенизация сухой хвои производилась с использованием гомогенизатора SpeedMill Plus (Analyticjena). Измерения концентраций выделенной ДНК проводилась на спектрофотометре SmartSpecTMPlus (BIO-RAD).

Подбор высокополиморфных маркеров проводился путем тестирования группы ISSR праймеров, рекомендованных в работах Hui-yu и др. [28], Wolfe и др. [31], Wolfe& Liston [32], Blair и др. [33] и Abbot и др. [34]. Всего в анализ включено 15 праймеров (табл. 1).

Таблица 1 - Характеристика отобранных для тестирования ISSR - праймеров

Праймер

Секвиенс (5'-3')

Ссылка

(GA)9T

GAGAGAGAGAGAGAGAGAT

Blair и др., 1999

(AC)8C

ACACACACACACACACC

Abbot, 2001

(AC)8G

ACACACACACACACACG

Abbot, 2001

(CA)6RY

CACACACACACAAGCT

Wolfe и др., 1998

(CA)6RG

CACACACACACAAGG

Wolfe и др., 1998

(CA)6(GT)

CACACACACACAGT

Wolfe и др., 1998

(CA)6(AC)

CACACACACACAAC

Wolfe и др., 1998

(AG)8T

AGAGAGAGAGAGAGAGT

Hui-yu и др., 2005

(GA)8T

GAGAGAGAGAGAGAGAT

Hui-yu и др., 2005

(AG)8YT

AGAGAGAGAGAGAGAGGCT

Hui-yu и др., 2005

(AG)8YA

AGAGAGAGAGAGAGAGGCA

Hui-yu и др., 2005

(AG)8C

AGAGAGAGAGAGAGAGC

Hui-yu и др., 2005

(CA)8G

CACACACACACACACAG

Hui-yu и др., 2005

(TG)8A

TGTGTGTGTGTGTGTGA

Hui-yu и др., 2005

(CT)8RC

CTCTCTCTCTCTCTCTATC

Hui-yu и др., 2005

Реакционная смесь полимеразной цепной реакции (ПЦР) общим объемом 10 мкл содержала 1 мкл ПЦР-буфера; 0,2 мкл 10Мм dNTPs; 0,1 мкл 100 мкМ праймера; 1 мкл образца ДНК; 0,1 мкл Taq-полимеразы (2 ед/мкл); 7,6 мкл воды. Для проведения реакции использовали набор реактивов «Encyclo PCR kit» (ЗАО Евроген). Режим амплификации: 5 мин денатурация при 94С, 45 циклов: 30 сек. денатурация при 94С, 45 сек отжиг при 60-65°С, 2 мин элонгация при 72С; 7 мин окончательная элонгация при 72С. Реакции проводили в тонкостенных пробирках, объемом 200 мкл на амплификаторе MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler (BIO-RAD). Для улучшения качества получаемых электрофореграмм был проведен эксперимент по подбору оптимальной температуры отжига. При этом для каждого праймера температура отжига устанавливалась в пределах в пределах от 50 до 65°С.

Выявление продукта ПЦР проводилось при помощи электрофореза в 1,5% агарозном геле. Разделение амплифицированных фрагментов выполняли в электрофорезной камере PowerPacTM Universal (BIO-RAD) в ТВЕ буфере с добавлением бромистого этидия в течение 2,5 часов при напряжении электрического поля 70 V. Анализ результатов электрофореза проводился с использование гель-документирующей системы GelDoc 2000 (BIO-RAD) c программным обеспечением Quantity One. Определение длин амплифицированных фрагментов проводилось по сравнению с ДНК - маркером 100bp+1.5kb+3kb (ООО «СибЭнзим»).

Оценка уровня полиморфности отобранных праймеров проводилась на основе изучения 26 клонов плюсовых деревьев ели обыкновенной, представленных на архиве клонов в Учебно-Опытном лесхозе МарГТУ.

Интерпретация результатов исследования

Выделение ДНК является важным этапом выполнения генетического анализа, так как от качества и количества выделенной ДНК зависит успешность дальнейших этапов анализа. Качественный анализ выделенной ДНК проводился путем электрофореза в агарозном геле, который позволяет выявить степень деградации. Исследования показали, что при выделении ДНК как из сырой так из сухой хвои методом Doyle J.J. и Doyle J.L. [29] с использованием CTAB буфера, наблюдается незначительная деградация нитей ДНК (рис. 1). Однако, из данного рисунка так же видно, что в каждом образце присутствует достаточно большое количество нативной ДНК.

Рисунок 1. - Результаты проверки качества ДНК выделенной из сухой хвой: 1 дорожка ДНК-маркер, 2-12 дорожки - выделенная из разных образцов ДНК

Спектрофометрическое определение концентрации выделенной ДНК показало, что методом Doyle J.J. и Doyle J.L. при использовании механического разрушения тканей в жидком азоте в средне выделялось 107,7 нгр/мкл, при этом концентрация варьировала в разных образцах от 14,2 до 194,4 нгр/мкл (табл. 2). Использование гомогенизатора для разрушения клеточных оболочек сухих тканей позволяет получать препараты более высокой концентрации (от 98,5 до 354,2 нгр/мкл).

Таблица 2. - Концентрация выделенной ДНК при разных способах выделения ДНК

Способ выделения ДНК

М ± m

(нгр/мкл)

д

Min-Max

V, %

Из сырой хвои Doyle J.J. и Doyle J.L. с использованием жидкого азота

107,7±13,3

67,8

14,2-194,4

62,9

Из сухой хвои методом Doyle J.J. и Doyle J.L. с использованием гомогенизатора

210,5±18,9

75,77

98,5-354,2

36,0

Цель подбора праймеров состоит в том, чтобы получить согласованный набор маркеров, которые могут быть надежно и повторно проанализированы, вычислены и зарегистрированы в различных лабораториях. С данной целью выполнили пробное тестирование 15 ISSR праймеров. Первые эксперименты показали, что рекомендуемая температура отжига праймеров не всегда дает хорошие результаты. Работа по подбору оптимальной температуры отжига заключалась в проведении ряда амплификаций при разных температурах, при этом для каждого праймера температура отжига устанавливалась в пределах от 50 до 65°С. Например, из рисунка 2 видно, что для (AG)8YT праймера наиболее четкий ДНК профиль наблюдается при температуре в районе 60°С.

65,0 63,3 61,4 59,5 57,6 55,7 51,9 50,0

Рисунок. 2.- Подбор оптимальной температуры отжига для праймера (AG)8YT: 1-3 - номера образцов ДНК, 50-65 - температура отжига °С, М - маркер молекулярных размеров (СибЭнзим, 100bp+1,5 kb+3,0kb)

В результате проведенных экспериментов из 15 протестированных ISSR праймеров для идентификации генотипов ели было отобрано 9. Примеры электрофореграмм разных клонов ели с праймрами (CA)6(GT) и (CT)8RC приведены на рисунке 3.

А В

Рисунок. 3. - Результаты электрофореза продуктов ПЦР с праймером (CA)6(GT) (А) и праймером (CT)8RC (В): М - ДНК - маркер 100bp+1.5kb+3kb (СибЭнзим), 1-13 номера образцов соответствующие разным клонам

Характеристика рекомендуемых для клоновой идентификации ели ISSR праймеров приведена в таблице 3. Всего при использовании комбинации девяти ISSR праймеров было обнаружено 172 амплифицированных фрагментов ДНК. Разные праймеры давали от 5 до 26 маркеров, длина которых варьировала от 140 до 2210 пар нуклеотидов.

После выполнение генетического анализа все данные по каждому клону необходимо занести в таблицу, входными данными которой служат: код маркера (метод генетического анализа), название праймера и коды локусов, отражающие наличие или присутствие соответствующего амплифицированного фрагмента в исследуемом образце. В таблице 4 приведен пример ISSR анализа с использованием использованием праймеров (GA)9T и (CA)6RY для клона плюсового дерева ели М97. Предлагаемая форма таблицы позволяет систематизировать полученные данные, что весьма важно для дальнейшего анализа и составления генетической формулы объекта идентификации.

Таблица 3. - Характеристика ISSR праймеров, рекомендуемых для идентификации

Праймер

Температура отжига, °С

Количество амплифицированных фрагментов ДНК

Длина амплифицированных фрагментов ДНК, bp

(GA)9T

60

20

200-2540

(AC)8C

60

5

470-950

(CA)6RY

60

18

210-1930

(CA)6RG

60

19

210-1480

(CA)6(GT)

60

20

300-2210

(CA)6(AC)

60

18

110-1710

(AG)8T

65

23

300-2120

(GA)8T

60

26

260-2480

(AG)8YT

60

23

140-1980

Итого

172

140-2480

В дальнейшем на основе составленной таблицы составляется генетическая формула изученного растения. В формулу генотипа вносятся сведения об использованном методе, праймерах и обнаруженных у данной особи амплифицированных фрагментах ДНК. Так, например, для плюсового дерева М97 генетическая формула выглядит следующим образом:

ISSR / (GA)9T - 2310, 2020,1540, 1280, 1160, 940, 810, 770, 710, 520, 490, 450, 310, 200 / (AC)8C - 940, 710, 470 / (CA)6RY - 1800, 1620, 980, 830, 730, 620, 510, 470, 340, 210 / (CA)6RG - 1070, 920, 890, 800, 750, 610, 540, 460, 390, 210 / (CA)6(GT) - 2210, 1850, 1670, 1530, 1380, 1050, 980, 880, 790, 650, 600, 450, 420, 370, 300 / (CA)6(AC) - 1250, 1130, 1030, 940, 760, 470, 390, 370, 340, 270, 210, 160, 110 / (AG)8T - 1450, 1340, 1060, 860, 690, 650, 610, 570, 510, 320 / (GA)8С - 2210, 2020, 1770, 1640, 1260, 1180, 1090, 1040, 990, 910, 820, 780, 650, 600, 550, 500, 440, 390, 340, 300, 260 / (AG)8YT - 1090, 810, 750, 610, 470, 400, 310, 250, 200, 170

Таблица 4. - Пример записи результатов генетического анализа при идентификации генотипов

ISSR

Коды локусов (длина фрагмента ДНК / наличие (0) или присутствие (1) фрагмента)

М97

(GA)9T

2540

2310

2020

1810

1540

1280

1160

1070

940

870

0

1

1

0

1

1

1

0

1

0

810

770

710

570

520

490

450

310

260

200

1

1

1

0

1

1

1

1

0

1

(CA)6RY

1930

1800

1620

1500

1210

1080

980

880

830

730

0

1

1

0

0

0

1

0

1

1

620

510

470

400

340

300

270

210

1

1

1

0

1

0

0

1

На наш взгляд, одним из показателей, характеризующих пригодность использования ДНК маркера для идентификации, является уровень полиморфности. Полиморфными считают локусы, при исследовании которых обнаруживается два аллеля. В случае с ISSR маркерами у полиморфных локусов выявляется либо отсутствие (0) либо наличие (1) соответствующего аллеля в электрофореграмме исследуемого генотипа. В противоположном случае, у мономорфных локусов наблюдается только один аллель (1). Высокий уровень полиморфности используемых праймеров обеспечивает хорошую разрешающую способность разработанной технологии, так как будут наблюдаться большие различия в генотипах идентифицируемых клонов.

Для оценки уровня полиморфности отобранных праймеров были проведены исследования клонов плюсовых деревьев ели обыкновенной, представленных на клоновом архиве в Учебно-Опытном лесхозе МарГТУ. Всего в анализ включено 26 клонов. В результате исследований было установлено, что из обнаруженных 172 амплифицированных фрагментов 149 (86,6%) являются полиморфными. Такая достаточно большая доля полиморфных локусов позволяет проводить генетическую идентификацию практически не ограниченного количества образцов.

Выводы

1. Эксперимент показал, что использование методики Doyle J.J. и Doyle J.L. [29] позволяет получить ДНК в достаточном для ISSR анализа количестве. Применяя различные способы разрушения тканей хвои ели было получено от 14,2 до 354 нгр/мкл ДНК.

2. По результатам литературного анализа достоинств и недостатков некоторых методов генетического анализа было принято решение разработку технологии идентификации генотипов ели проводить на основе использования ISSR праймеров. Данный тип маркеров позволяет анализировать большую част генома и выявлять высокий уровень полиморфизма ДНК. В результате эксперимента были отобраны 9 ISSR праймеров, полимеразно-цепная реакция с которыми дает высоковариабельные и стабильные электрофоретические профили.

3. При изучении клонов плюсовых деревьев ели обыкновенной с использованием рекомендуемых 9 ISSR маркеров было выявлено 172 локуса, из которых 149 (86,6%) оказались полиморфными. Высокий полиморфизм отобранных праймеров позволяет провести идентификацию большого количества генотипов ели.

4. В целом, исследовательская работа показала возможность применения ISSR анализа для идентификации плюсовых генотипов ели обыкновенной и разработанная технология может быть рекомендована для практического применения.

Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы» при финансовой поддержке Минобрнауки России (соглашение № 14.132.21.1331) с использованием оборудования ЦКП «ЭБЭЭ» ФГБОУ ВПО «ПГТУ».

Список литературы:

1. Оганисян, А. С. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR / А. С. Оганисян, Е. З. Кочнева, А. П. Рысков // Генетика. - 1996. - Т. 32. - С. 448-451.

2. Сиволап, Ю. М. Идентификация и паспортизация сортов мягкой пшеницы методами RAPD- и SSRP- анализа / Ю. М. Сиволап, Е. А. Топчиева, С. В. Чеботарь // Генетика. - 2000. - том. 36. - №1. - С. 44-51.

3. Баранов, О. Ю. Использование RAPD-анализа для паспортизации хозяйственно-ценных сортов голубики / О. Ю. Баранов, Е. В. Спиридович, В. Н. Решетникова [и др.] // Проблемы лесоведения и лесоводства на радиоактивно загрязненных землях: Сб. науч. Тр. Вып. 60. - Гомель: ИЛ НАНБ, 2004. - С. 117-123.

4. Малышев, С. В. Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пшеницы, картофеля, томата, льна и свеклы) на основе ДНК-маркеров: Методические рекомендации / С. В. Малышев, О. Ю. Урбанович, Н. А. Картель. - Мн., 2006 .- 28с.

5. Яковлева, А. А. Методика генетической паспортизации сортов растений на примере рода Phododendron / А. А. Яковлева, П. С. Новиков, О. В. Шейкина [и др.] //Россия в глобальном мире: вызовы и перспективы развития. Четырнадцатые Вавиловские чтения: материалы постоянно действующей Всероссийской междисциплинарной научной конференции с международным участие. - Йошкар-Ола: Марийский государственный технический университет, 2011.-Ч.2.-с.369-370.

6. Шишкина О.К. Первая отраслевая генетическая лаборатория для анализа ДНК лесных растений / О. К. Шишкина //Лесная Россия. - 2008. - № 9. - С.36-39.

7. Мирошников А.И. Опыт использования достижений лесной генетики, селекции и семеноводства в России и за рубежом / А. И. Мирошников //Лесохозяйственная информация. - 2008. - №3-4. - С. 4-9.

8. Franklin, E. C. Artificial self-pollonation and natural inbreeding in Pinus taeda L.: PhD dissertation / E. C. Franklin. -N. C. State University, Raleigh, 1968.

9. Правдин, Л. Ф. Сосна обыкновенная. Изменчивость, внутривидовая систематика и селекция / Л. Ф. Правдин. - М.: Наука, 1964. - 191с.

10. Прохорова, Е. В. Анализ фенотипической структуры клоновых потомств ели в архиве / Е. В. Прохорова, А.А. Прохорова // Лесной журнал. - 2011. - №1. - С.15-19.

11. Шейкина, О.В. Семеношение клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной на лесосеменной плантации в Чувашской Республике / О. В. Шейкина, Э. П. Лебелева // Лесной журнал. - 2010. - №1. - С. 48-52.

12. Ladislav, P. Clone identity and contamination in a Scots pine seed orchard //Proceeding of the Meeting of the Nordic Group for Tree Breeding (Ed. D. Lindgren). - Swedish Univ. of Agricultural Sciences, Dept of Forest Genetics and Plant Physiology Umea rep.10, 1991. - 22-32p.

13. Wheeler N. C. The use of electrophoretic markers in seed orchard research / N. C. Wheeler, K. S. Jech // New Forest . - 1992. - № 6. - P. 311-328.

14. Рисованная, В. И. Идентификация фенотипов винограда по спектрам изоферментов / В. И. Рисованная, Л. П. Трошин, Т. А. Ракитская [и др.] // Виноград и вино России. - 1996. - № 4. - С. 14-17.

15. Kaya, N. Genetic identification of clones and the genetic structure of seed crops in a Pinus brutia seed orchard / N. Kaha, K. Isik // Turk J Agric For. - 2010. - № 34. - P. 127-134.

16. Ивановская С. И. Молекулярно-генетический анализ Pinus sylvestris на лесосеменных плантациях / С. И. Ивановская, Е. Н. Химченко, О. М. Новикова // Проблемы лесоведения и лесоводства: Сб. науч. Трудов ИЛ НАН Беларуссии. Вып. 67. - Гомель: ИЛ НАН Белоруссии, 2007. - С. 155-162.

17. Cottrell, J. E. The use of isozyme genetic markers to estimate the rate of outcrossing in a sitka spruce (Picea sitchensis (Bong.) Carr.) seed orchard in Scоtland / J. E. Cottrell, I. M. S. White // New Forest. - 1995. - № 10. - P. 111-122.

18. Vendramin, G.G. Molecular markers for characterizing diversity in forest trees /G.G. Vendramin, O.K. Hansen // Conservation and management of forest genetic resources in Europe. Zvolen, 2005.-P.337-368.

19. Adams, W.T. Allozyme studies in Lobloly Pine seed orchards: clonal variation and frequency of progeny due to self-fertilization / W.T. Adams, R.J. Joly // Silvae Genetica. - 1980. - 29. P.1-4.

20. Белоконь, Ю. С. Применение ДНК-маркеров для паспортизации ЛСП и сертификации семян хвойных пород / Ю. С. Белоконь, Н. В. Гордеева, Н. Ю. Гордон [и др.] // //Лесохозяйственная информация. - 2008. - №3-4. - С. 35-38.

21. Nielsen, L.R. Identity verification of trees in the 61 years old common ash (Fraxxinus excelsior) clonal seed orchard FP202 (Birkemarken, Humlebaek) by DNA genotyping with microsatellite markers / L.R. Nielsen, L.V. McKinney, D.C. Jensen et al. //Forest & Landscape Working Papars. - 2009. - № 34. - P. 37.

22. Куцев, М.Г. Фрагментный анализ ДНК растений: RAPD, DAF ISSR / М. Г. Куцев. - Барнаул: ARTIKA, 2009. - 164с.

23. Scheepers, D. Use of RAPD patterns for clone verification and in studying provenance relationships in Norway spruce (Picea abies). / D. Scheepers, M.C. Eloy, M.Briquet // Theor Appl Genet. - 1997. - P. 940-485.

24. Gupte, M. Amplification of DNA markers from evolutionary diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats / M. Gupta, J. Chyi, J. Romero-Severson et al. // Theoretical AND Applied Genetics. - 1994. - № 89. - P. 998-1006.

25. Zietkiewicz, E. Repeat (SSR)-Anchored PolymERASE Chain Reaction Amplification / E. Zietkiewicz, A. Rafalski, D. Labuda // Genomics. - 1994. - V. 20. - № 2. - P. 176-183.

26. Grivet, D. A novel approach to an old problem: tracking dispersed seeds / D. Grivet, P.E. Smouse, V.L. Sork // Mol. Ecol. - 2002. - № 14. - P. 3585-3595.

27. Ziegenhagen, B. Molecular identification of individual oak and fir trees from maternal tissue of their fruits or seeds / B. Ziegenhagen, S. Liepelt, V. Kuhlenkamp et al. // Trees.- 2003. - № 17. - P. 345-350.

28. Hui-yu, L. Genetic variation and division of Pinus sylvestris provenances by ISSR markers / L. Hui-yu, J. Jing, L. Gui-feng at al. // Journal of Forest Reseach. - 2005. - V. 16. - № 3. - P. 216-218.

29. Asif, M.J. DNA extraction from processed wood: a case study for the identification of an endangered timber species (Gonystylus bancanus) / M.J. Asif, C.H. Cannon // Plant Mol Biol Report. - 2005. - № 23. - P. 185-192.

30. Doyle, J.J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue /Doyle J.J., Doyle J.L. // Phytochemical Bulletin.-1991.-№ 19.-Р. 11-15.

31. Wolfe, A.D. Assessing hybridization (in natural population of Pestermon (Scrophulariaceae) using hypervariable inter-simple sequence repeat markers / A.D.Wolfe, Q.Y. Xiang, S.R. Kephart // Mol Ecol. - 1998. - №7. - P. 1107-1125.

32. Wolfe, A.D. & Liston A. Contributions of PCR-based methods to plant systematic and evolutionary biology. In book: Molecular systematic of plants II-DNA sequencing. - Kluwer Academic Pull., Boston, Dordrecht, London. - P. 43-86.

33. Blair, M.W. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequence and fingerprinting in rice (Oryza sativa L.) / M.W. Blair, O. Panaud, S.R. McCouch // Theor Appl Genet. - 1999. - №98. - P. 780-792.

34. Abbot, P. Individual and population variation in invertebrates revealed by inter-simple sequence repeats (ISSRs) / P. Abbot // Journal of Incect Science. - 2001. -- V. 1. - № 8. - P. 1-4.

Размещено на Allbest.ru


Подобные документы

  • Характеристика лесорастительных условий и лесного фонда лесничества. Возможность искусственного получения гибридов. Отбор плюсовых деревьев и насаждений. Отвод ВЛСУ и обследование лесосек главного пользования, предназначенных для заготовки шишек.

    курсовая работа [69,2 K], добавлен 10.01.2015

  • Характеристика лесорастительных условий Оленгуйского лесхоза. Обзор методов селекции лиственницы сибирской. Виды отбора и типы скрещиваний. Создание постоянной лесосеменной базы, отбор плюсовых деревьев и насаждений. Расчет площадей лесосеменных участков.

    курсовая работа [65,4 K], добавлен 11.09.2012

  • Генетическая оценка плюсовых деревьев по семенному потомству в испытательных культурах. Значение индуцированных мутаций и отдаленной гибридизации. Проведение селекционных мероприятий по повышению урожайности. Расчёт площади постоянной лесосеменной базы.

    контрольная работа [25,2 K], добавлен 21.10.2014

  • Изучение природных условий пгт. Нарышкино. Разработка ассортимента растений. Определение сроков выращивания деревьев и кустарников. Расчет закладки и выпуска деревьев, кустарников в отделах размножения и формирования. Основная обработка почвы в питомнике.

    курсовая работа [50,3 K], добавлен 18.05.2016

  • Дифференциация деревьев в лесу. Основные классификации древесных пород и характеристика классов деревьев. Средний и текущий приросты древостоя. Факторы, влияющие на интенсивность самоизреживания в лесу. Зависимость количества деревьев от возраста леса.

    реферат [19,7 K], добавлен 29.03.2011

  • Разделение деревьев по диаметру, по естественным ступеням толщины. Построение товарной таблицы на основе полученных данных. Методика расчета показателей строения и выражения распределения деревьев (по их толщине) теоретической кривой распределения.

    отчет по практике [32,3 K], добавлен 02.11.2011

  • Происхождение груши и современное состояние ее возделывания. Особенности биологии груши. Рост деревьев груши в насаждениях разного типа. Хозяйственная и удельная продуктивность деревьев груши. Объем кроны и коэффициент использования земли деревьями груши.

    дипломная работа [1,1 M], добавлен 09.07.2011

  • Болезни стволов хвойных пород. Патогенные микроорганизмы, развивающиеся на коре, хвоинках растений и вызывающие ослабление и гибель деревьев. Внешние признаки и диагностика по фазам развития; общее состояние дерева, распространение, меры защиты и надзор.

    курсовая работа [37,5 K], добавлен 28.11.2013

  • Правила, способы и сроки хранения семян лесных пород. Требования к древесным насаждениям при заготовке лесесемянного материала. Условия семенной продуктивности лесных деревьев и древостоев. Созревание семени и возмужалость. Семеношение деревьев в лесу.

    реферат [20,6 K], добавлен 29.03.2011

  • Итоги проведения экспедиции Шитта по обследованию насаждений за 1930-1932 гг. в СССР. Предпосылки отказа от разреженной посадки деревьев. Обоснование одно- и двухрядных посадок плодовых деревьев. Основные принципы современного промышленного плодоводства.

    реферат [4,5 M], добавлен 18.01.2012

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.