Технология отбора клонов винограда

Размещено на http://www.allbest.ru/

Генетическая информация играет значительную роль в установлении эффективности работы во всех областях, наиболее востребованной сейчас является информация, полученная с помощью молекулярных маркеров. Они являются превосходным помощником в получении обширного количества генетической информации. генетический каберне мерло рислинг

Как известно, при исследовании генетических ресурсов растений с помощью микросателлитных маркеров преследуют разнообразные цели, среди наиболее значимых выделяют следующие.

1. Сохранение растительных генетических ресурсов через описание место нахождения и описания доступного разнообразия.

2. Определение, идентификация, паспортизация и регистрация источников и доноров ценных признаков.

3. Решение спорных вопросов авторства сортов и образцов растений.

4. Определение структуры коллекции и степени родства генотипов для наиболее эффективного подбора родительских пар при гибридизации;

5. Определение, идентификация и регистрация образцов коллекции.

Высокий уровень полиморфизма, выявляемый SSR-маркерами, определяет ценность этой маркерной системы и позволяет говорить о возможности ее использования для оценки генетической изменчивости между клонами и сортами винограда, и быстрой и достоверной идентификации сортов.

В данном случае идентификация и паспортизация сортов может выполняться на основании данных об аллельных состояниях использованных маркеров у каждого отдельно взятого генотипа, сорта или клона. Затем данная информация может использоваться для детального описания генотипа.

В настоящее время получение характеристик сортов связано с анализом их по комплексу количественных и качественных морфологических признаков, принятых Международной организацией винограда и вина (окраска цветка и ягоды, форма и тип опушения листовой пластинки, длина побега и др.). Однако полигенное наследование большей части этих признаков затрудняет интерпретацию полученных результатов.

По мнению большинства исследователей, проблема идентификации видов и сортов винограда останется неразрешенной до тех пор, пока не будут применены молекулярно-генетические критерии.

Традиционные методы идентификации сортов и клонов, изучение изменчивости и таксономии винограда, ампелографии и ампелометрии обычно базируются на описании морфологических различий сортов [2, 12, 13, 17]. Однако несколько ограничений накладываются на эти методы.

1. В течение вегетационного периода необходимо использование взрослых неповрежденных листьев.

2. Вызревшие черенки имеют лишь несколько (обычно 4) градаций морфологии.

3. Фенотипы растений очень сильно взаимодействуют с окружающей средой. Различные условия внешней среды могут вызывать морфологические изменения, касающиеся ампелографических признаков, внося свой вклад в ложную идентификацию [35, 48-49].

4. Общее количество сортов винограда в ампелографических коллекциях насчитывается до 42 650, большинство из них является результатом мутационного процесса или рекомбиногенеза, и количество сортов постоянно увеличивается. Если даже сосредоточить все растения в идеальных условиях, будет тяжело дифференцировать все морфологические характеристики [23-24, 46].

5. Использование ампелографических методов требует знания индивидуальных особенностей каждого сорта в отдельности, однако никто не имеет доступа и необходимых знаний о тысячах разных сортов, возделываемых по всему миру, просто из-за того, что не каждая коллекция может содержать полностью все генетические ресурсы своего региона.

Ампелографы обычно знают сорта винограда, которые используются в их регионе, и менее знакомы с сортовым составом в других регионах.

Частично недостатки традиционных методов оценки генотипов компенсируются использованием комплекса ампелографических признаков [13, 18, 52].

Вопросы идентификации генотипов винограда не менее важны и в процессе клоновой селекции. Чрезвычайно сложно дифференцировать генотипы, являющиеся модификантами в изогенной популяции сорта, фенотип которого изменчив в зависимости от влияния внешней среды и результатов взаимодействия генотип-среда. При этом ставится задача выявления генотипических вариаций среди массы фенотипически близких высокопродуктивных растений [16].

Именно развитие ДНК-маркеров позволило изменить такое состояние и дало возможность легко идентифицировать сорта до такой степени, что можно использовать людей без специальной ампелографической подготовки. Результаты не только объективны, но они также не зависят от условий окружающей среды и болезней, присутствующих в растениях. ДНК-маркеры стали одним из полезных средств, позволяющих решать во многих случаях проблемы, связанные с синонимами и неправильным названием.

По этой причине требуются альтернативные методы сортовой и клоновой идентификации, которые бы лучше иллюстрировали различия на генетическом уровне [1, 5, 17].

Существующая технология по отбору клонов ведется по методике, утвержденной на первом Международном симпозиуме по клоновой селекции (1971, ФРГ), рассчитанной на почти 20-летнее испытание.

Как показало время, генетическое улучшение сорта более результативно и экономически весьма выгодно при использовании этапа "ступенчатого" отбора, с использование молекулярных маркеров [статья Звягин А.С.].

Вследствие изложенных выше фактов, для исследования генетического разнообразия и составления их ДНК-фингерпринта, были исследованы клоновые популяции сортов Мерло, Каберне-Совиньон (монография), Пино и Рислинг (статья рислинг, автореферат, монография) с использованием 8 нейтральных, т.е. не сцепленных с каким либо геном, ядерных микросателлитных маркеров, отобранных в базе данных как наиболее полиморфные: Greek Vitis Database, http://www.ncbi.uch.gr/gvd.

Цель исследования - проанализировать возможность использования молекулярных маркеров для изучения полиморфизма клонов винограда.

Задачами являлось определить, возможно ли дифференцировать клоны среди исследуемых популяций винограда с помощью микросателлитных маркеров.

Объектами исследований являлись:

- две черноягодные популяции сортов Мерло и Каберне-Совиньон: Мерло-2 № 49 - 10 кустов, Мерло-343 - 43 куста, Мерло-181 - 46 кустов и Мерло (контроль) - 30 кустов; Каберне-Совиньон-5А - 20 кустов, Кабернек (Каберне-Совиньон-14) - 12 кустов, Каберне-Совиньон-15А - 22 куста, Каберне-Совиньон-15Б - 10 кустов и Каберне-Совиньон (контроль) - 43 куста (Приложение В и Г). Всего было исследовано в учхозе «Кубань» 236 учетных кустов;

- две белоягодные популяции сортов Пино и Рислинг: Пино белый - 35 кустов, Пино белый 31 - 19 кустов, Пино черный - 56 кустов и Пино Белый 32 - 12 кустов; Рислинг Алькадар - 15 кустов, Рислинг Алькадар 34 - 34 куста, Рислинг Алькадар -34А - 16 кустов, Рислинг Алькадар 34Б - 14 кустов, Рислинг 4-9-2 - 6 кустов, Рислинг 9-9-1 - 4. Всего было исследовано в учхозе «Кубань» 211 учетных кустов.

Клоны Мерло-343 и Мерло-181 были завезены из Франции, остальные отобраны профессором Трошиным Л.П. за 30 лет его работы в этом направлении.

Проводилось исследование агробиологических и технологические характеристики исследуемых сортов [5, 14].

Подготовку растительного материала и экстракцию ДНК проводили, используя СТАВ-метод, модифицированный по следующей схеме [42].

Для выделения ДНК использовали листья ранее названных генотипов, которые были собраны с кустов в разных экологических условиях (учхоз «Кубань» Кубанского госагроуниверситета, ООО «Фанагория-Агро» и ЗАО «Победа» Темрюкского района) и помещены в азот при -70° С.

Концентрацию выделенной ДНК определяли спектрофотометрически по стандартной методике, а также методом разведений полученных препаратов с последующим их электрофорезом в 2% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия и визуализацией в ультрафиолете. При этом исходили из того, что порог чувствительности бромистого этидия в агарозных гелях составляет 10 нг ДНК [40].

Морфологическое исследование клоновых популяций винограда показали, что по совокупности агробиологических показателей все клоны отличались от контрольных сортов по определенным признакам. Отличия были обнаружены у клонов черноягодных популяций в следующем убывающем порядке:

- в популяции Каберне-Совиньон: Каберне-Совиньон-5А, Каберне-Совиньон-15Б, Каберне-Совиньон-15А, Кабернек;

- в популяции Мерло: Мерло-343, Мерло-2 № 49, Мерло-181. При этом во второй популяции было зафиксировано превышение над контрольным сортом у всех клонов по урожайности в 1,5-2,6 раз.

По хозяйственной продуктивности у белоягодных популяций, т.е. урожаю с куста, исследованные генотипы расположились в следующем убывающем порядке:

- в первой популяции - Пино черный № 07 - 2,2 кг, Пино белый № 31 - 1,8 кг, Пино белый № 32 - 1,7 кг, при этом урожай с куста у контрольного сорта составил 1,3 кг; превышение у всех клонов по сравнению с контрольным сортом составило у клона Пино черный № 07 - 65,8%, Пино белый № 31 - 35,6% и Пино белый № 32 - 30,8% (дисер Палыча);

- во второй популяции урожай с куста составил: клон Рислинг Алькадар № 34 -3,1 кг, Рислинг Алькадар № 34А - 2,4 кг, Рислинг Алькадар № 34Б - 2,2 кг, Рислинг № 4-9-2 - 2,3 кг и Рислинг анапский - 2,7 кг при контроле 1,5 кг; превышение по сравнению с контрольным сортом составило у клонов в среднем от 40 до 98% [13].

Агробиологические показатели у сравниваемых генотипов обеих сортогрупп между собой резко различались, что доказано применением критерия Стьюдента и методом бутстрепа.

В ходе работы по ускоренному процессу отбора была определена возможность отбора клонов винограда в исследуемых популяциях с использованием 8 нейтральных, т.е. не сцепленных с каким либо геном, ядерных микросателлитных маркеров, отобранных в базе данных как наиболее полиморфные: Greek Vitis Database, http://www.ncbi.uch.gr/gvd.

В ходе исследования было выявлено количество в сумме 24 аллеля для групп Мерло и Каберне-Совиньон, 30 аллелей для Пино и Рислинг (ссылки на Пашину работу и мою).

Как видно маркеры проявили различный уровень полиморфизма: от двух (локус VVS3) до девяти (локус VrZag79) аллелей на один микросателлитный локус с максимальным полиморфизмом по маркерам VrZag79, VVMD27, VrZag62 и VVMD5, что свидетельствует о дальнейшем использовании этих маркеров в будущей селекции винограда и определение генетической идентификации клонов. При этом видно, что маркеры показывают относительно одинаковые результаты встречаемости у обоих популяций, за исключением маркера VrZag79 и VVMD27, которые показали различающие по количеству аллелей.

По результатам анализа о наличии аллелей исследовавшихся сортов составлялись их ДНК-паспорта, содержащие информацию о номере микросателлитного маркера и его аллельном состоянии у конкретного генотипа. Нулевым аллелям принимали наименьший среди исследуемой группы.

В ходе анализа данных ДНК отпечатков группы Каберне-Совиньон было выявлено, что исследуемые генотипы группы Каберне-Совиньон имеют отличающиеся наборы аллелей: генотип Каберне-Совиньон-5А отличается от контрольного сорта на 22 повтора, клон Каберне-Совиньон-15А - 18 аллелей, Каберне-Совиньон-169 - 16 аллелей, Кабернек - 14 аллелей, Каберне-Совиньон-217 - 14 аллелей.

Анализ данных ДНК-отпечатков группы Мерло показал, что исследуемые формы отличаются от контрольного сорта, при этом клон Мерло-347 - 28 аллелей, Мерло-343 - 24 аллеля, Мерло-2 № 49 - 24 аллеля, Мерло-181 - 24 аллеля, Мерло-348 - 18 аллелей, Мерло-35 - 12 аллелей и Мерло-14 отличается на 2 аллеля.

Анализ данных ДНК отпечатков группы Пино показал, что исследуемые нами генотипы группы Пино имеют отличающиеся наборы аллелей: генотип Пино блан отличается от контрольного сорта на 39 аллелей, клон Пино черный - 49 аллелей, Пино белый-31 - 28 аллелей, Пино белый-32 -19 аллелей.

Анализ данных ДНК-отпечатков группы Рислинг показал, что исследуемые формы отличаются от контрольного сорта, при этом клон Рислинг Алькадар 34- 50 аллелей, Рислинг Алькадар 34А -30 аллелей, Рислинг Алькадар 34Б - 24 аллеля, Рислинг 4-9-2 - 62 аллеля, Рислинг 9-1-1 - 26 аллелей.

В ходе использования ядерных микросателлитных маркеров было выявлено, что они позволяют различать близкородственные генотипы и являются эффективным инструментов при исследовании клонов винограда. Так при рассмотрении ДНК-отпечатков было видно, что исследуемые генотипы черноягодных популяций Каберне-Совиньон и белоягодные популяций Пино и Рислинг несмотря на высокую степень генетического родства, имеют отличающиеся наборы аллелей.

Возможность различать генетически близкие сорта на основе полиморфизма микросателлитных маркеров подтверждает перспективность их использования в идентификации клонов винограда. Помимо этого, высокий уровень полиморфизма микросателлитных маркеров позволяет их применять для поиска ложных сортов и клонов при затруднительности проведения этой процедуры по фенотипическим признакам.

Исходя из вышеизложенных фактов, предлагается необходимо применять следующий способ отбора клонов популяций винограда позволяющий сокрашать данный процесс до 3-5 лет.

Одним из основных видов отбора винограда является клоновая селекция, направленная на улучшение сортового состава виноградных насаждений. Она является действенным методом повышения урожайности и качества винограда.

По совокупности агробиологических показателей все клоны отличались от контрольных сортов по определенным признакам; наибольшие отличия были обнаружены у клонов в следующем убывающем порядке:

- в популяции Каберне-Совиньон: Каберне-Совиньон-5А, Каберне-Совиньон-15Б, Каберне-Совиньон-15А, Кабернек;

- в популяции Мерло: Мерло-343, Мерло-2 № 49, Мерло-181. При этом во второй популяции было зафиксировано превышение над контрольным сортом у всех клонов по урожайности в 1,5-2,6 раза.

Использование тестирования ДНК ПЦР-анализом сокращает процесс отбора до 3-5 лет и достигается повышение хозяйственной продуктивности (урожая).

Микросателлитные маркеры проявили различный уровень полиморфизма: от двух (локус VVS3) до девяти (локус VrZag79) аллелей на один микросателлитный локус с максимальным полиморфизмом по маркерам VrZag79, VVMD27, VrZag62 и VVMD5, что свидетельствует о дальнейшем использовании этих маркеров в будущей селекции винограда и определение генетической идентификации клонов. При этом видно, что маркеры показывают относительно одинаковые результаты встречаемости у обоих популяций, за исключением маркера VrZag79 и VVMD27.

Использованные в работе по изучению генетического разнообразия популяций Каберне-Совиньон и Мерло 6 микросателлитных маркеров показали различный уровень полиморфизма: от двух до шести аллелей на один микросателлитный локус; наиболее высокий уровень полиморфизма обнаружен у маркеров VVMD27, VVMD5 и VrZag62 - 6, 5 и 5 аллелей по каждому из маркируемых локусов соответственно.

Исследованные виноградных популяции сортов Пино и Рислинг по 7 микросателлитным маркерам различались следующим генетическим полиморфизмом:

- в первой сортогруппе клон Пино черный № 07 отличался от контрольного сорта 49 аллелями, Пино блан - 52, Пино белый № 31 - 28, Пино белый № 32 - 19 аллелями;

- во второй сортогруппе также все исследуемые клоны отличались от контрольного сорта, например, клон Рислинг Алькадар № 34 50 аллелями, Рислинг Алькадар № 34А - 30, Рислинг Алькадар № 34Б - 24, Рислинг № 4-9-2 - 62, Рислинг анапский 26 аллелями.

На основании данных об аллельных комбинациях выявлено, что каждый из исследуемых генотипов винограда популяций Каберне-Совиньон, Мерло, Пино и Рислинг обладает уникальным, свойственным лишь ему набором аллелей, что свидетельствует о наличии отличий между исследуемыми клонами и о том, что микросателлитные маркеры обладают достаточным уровнем полиморфизма для использования их в клоновой идентификации.

Сорта-клоны винограда Пинок белый (А.с. № 49773), Рислиналк и Рислинг анапский, последовательно созревающие в первой половине сентября, вместе с созданными с нашим участием сортами Мерлок (патент № 4116, А.С. № 9360096) и Кабернек, последовательно созревающие во второй половине сентября, создают нужный для производства конвейер сбора урожая и организуют высокоэффективный ампелоценоз.

Список литературы

1. Барышева И.А., Тулаева М.И., Чисников В.С. Исследование внутрисортовой изменчивости ДНК винограда ПДРФ и ПЦР методами // Цитология и генетика. - 2003. - Т. 37, № 6. - С. 31-38.

2. Биометрическая оценка морфологических признаков популяции Каберне-Совиньон / А.С. Звягин, Л.П. Трошин, П.П. Подваленко, В.И. Вернигоров // Критерии и принципы формирования высокопродуктивного виноградарства. - Анапа, 2007. - С. 201-172.

3. Звягин А.С., Подваленко П.П., Трошин Л.П. Исследование интродуцированных из Крыма клоновых популяций винограда // Труды КубГАУ. - Краснодар, 2009. - № 5 (20). - С. 189-192.

4. Звягин А.С., Трошин Л.П., Подваленко П.П. Использование молекулярно-генетических маркеров для виноградной культуры // Нанобиотехнологии в сельском хозяйстве. - М., 2008. - С. 32-33.

5. Звягин А.С. Изучение полиморфизма черноягодных популяций винограда: дис. ... канд. биол. наук. Краснодар, 2006. 165 с.

6. Звягин А.С., Трошин Л.П. Паспортизация сортов и клонов винограда молекулярно-генетическим методом // Научное обеспечение агропромышленного комплекса. - Краснодар, 2005. - С. 128-132.

7. Итоги изучения сортов и клонов винограда в разных зонах Краснодарского края / Л.П. Трошин, Д.Е. Хлевный, А.С. Звягин, П.П. Подваленко, Т.И. Гугучкина, А.И. Мисливский // Технологии производства элитного посадочного материала и виноградной продукции, отбора лучших протоклонов. - Краснодар: АлВи-Дизайн, 2005. - С. 96-107.

8. Конарев В.Г. Морфогенез и молекулярно-биологический анализ растений. - Санкт-Петербург: ВИР, 1998. - 370 с.

9. Медведева Н.И., Поливара Н.В., Трошин Л.П. Особенности микроклонального размножения интродуцентов и клонов винограда // Научный журнал КубГАУ. - 2008. - № 40 (6). - 18 с. http://ej.kubagro.ru/2008/06/.

10. Остерман Л.А. Методы исследования нуклеиновых кислот. - Москва: Наука, 1981. - 288 с.

11. Перспективы исследования сортотипа Каберне-Совиньон / А.С. Звягин, Л.П. Трошин, П.П. Подваленко, С.В. Копыльцов // Роль молодых ученых в реализации национального проекта “Развитие АПК”. Сборник материалов Международной научно-практической конференции. Часть 1. - М.: ФГОУ ВПО МГАУ, 2007. - С. 35.

12. Подваленко П.П. Исследования полиморфизма популяций винограда Пино и Рислинг для отбора высокопродуктивных сортов: дисс… биол. наук. К., 2009. 153 с.

13. Подваленко П.П., Звягин А.С., Трошин Л.П. Клоновая селекция - современная основа подъема продуктивности виноградников // Научный журнал КубГАУ. - 2009. - № 51 (07). - 25 с. http://ej.kubagro.ru/2009/07/.

14. Подваленко П.П., Трошин Л.П., Звягин А.С. Ампелографическое исследование сортогруппы Рислинг // Роль молодых ученых в реализации национального проекта “Развитие АПК”. Сборник материалов Международной научно- практической конференции. Часть 1. - М.: ФГОУ ВПО МГАУ, 2007. - С. 74.

15. Подваленко П.П. Исследования полиморфизма популяций винограда Пино и Рислинг для отбора высокопродуктивных сортов. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Краснодар. - 2009. - С. - 22.

16. Трошин Л.П. Ампелография и селекция винограда. - Краснодар: РИЦ «Вольные мастера», 1999. - 138 с.: цв. вкладка.

17. Трошин Л.П. Биометрическая оценка полиморфизма сортогрупп винограда Пино и Рислинг по морфологическим признакам листьев среднего яруса кроны / Л.П. Трошин, Е.В. Луценко, П.П. Подваленко, А.С. Звягин // Научный журнал КубГАУ. - 2009. - № 52 (08). - 14 с. http://ej.kubagro.ru/2009/08/.

18. Трошин Л.П., Звягин А.С., Подваленко П.П. Анализ генетического разнообразия клонов сортогрупп Пино и Рислинг с использованием микросателлитных маркеров // Материалы XVIII Международного научного симпозиума «Нетрадиционное растениеводство. Селекция и генетика. Эниология. Экология и здоровье». 17-26 сентября 2009 г. - Симферополь, 2009. - С. 308-313.

19. Трошин Л.П., Звягин А.С., Подваленко П.П. Проблемы идентификации винограда // Виноделие и виноградарство. - 2008. - № 1. - С. 34-35.

20. Трошин Л.П., Рисованная В.И., Полулях А.И. Ампелографические признаки в изучении таксономических отношений сортов Vitis vinifera sativa pontica Negr. // Труды Научного центра виноградарства и виноделия. - 1999. - С. 10-12.

21. Трошин Л.П., Цурканенко Н.Г. Новые технические сорта винограда // Садоводство и виноградарство. - 2007. - № 4. - С. 24-25. 19. Энциклопедия виноградарства. - Кишинев: МСЭ, 1986-1987. - Т. 1-3. 7

22. Alleveldt G., Dettweiler E. A model to differentiate grapevine cultivars with the aid of morfological characteristics // Rivista di Viticultura e di Enologia. - 1989. - V. 1. - Р. 59-63.

23. Alleweldt G., Dettweiler E. The genetic resources of Vitis. - Siebeldingen / FRG, 1994. - 74 s.

24. Alleweldt G., Spiegel-Roy P. and Reisch B. Grapes (Vitis). In: Moore J. N. and J. R. Ballington (Eds.): Genetic Resources of Temperate Fruit and Nut Crops // Acta Hortic. - 1990. - V. 290. - P. 291-337.

25. Bellin D., Velasco R. and Grando M. S. Intravarietal DNA polymorphisms in. grapevine (Vitis vinifera L.) // Acta horticulturae. - 2001. - V. 546. - P. 343-349.

26. Botta R., Scott N.S., Eynard I., Thomas M.R. Evaluation of microsatellite sequence-tagged site markers for characterizing Vitis vinifera cultivars // Vitis. - 1995. - V. 34. - P. 99-102.

27. Bowers J.E., Dangl G.S. and Meredith C.P. Development and characterization of additional microsatellite DNA markers for grape // Am. J. Enol. Vitic. - 1999. - V. 50, № 30. - P. 243-246.

28. Bowers J.E., Dangl G.S., Vignani R. and Meredith C.P. Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.) // Genome. - 1996. - V. 39. - P. 628-633.

29. Fatahi R., Ebadi A., Bassil N., Mehlenbacher S.A. and Zamani Z. Characterization of Iranian grapevine cultivars using microsatellite markers // Vitis. - 2003. - V. 42, № 4. - P. 185-192.

30. Filippetti I., Intrieri C., Cemtinari M., Bucchetti B. and Pastore C. Molecular characterization of officially registered Sangiovese clones and of other Sangiovese-like biotypes in Tuscany, Corsica and Emilia-Romagna // Vitis. - 2005. - V. 44, № 4. - P. 167- 172.

31. Francois L., Marianna M., Gorislavets S.S, Risovannaya V. and Troshin L. Genetic profiling of Moldavian, Crimean and Russian cultivars of Vitis Vinifera L. with nuclear microsatellite markers // Тезисы IV международной конференции. - 2003. - С. 25.

32. Gonzalez A., Jubany S., Ponce I. De Leon., Dellacassa E., Carrau F.M., Hinrichsen P. and Gaggero C.A. Molecular diversity within clones of cv. Tannat (Vitis vinifera) // Vitis. - 2004. - V. 43, № 4. - P. 179-185. 31. http://www.drmed.rus/s.php/377 html.

33. Karp A., Ingram. D.S. and Isaac P. Molecular Tools for Screening Biodiversity // Chapman and Hall. - 1998. - P. 195-201.

Размещено на Allbest.ru