Вирулентность и ДНК-полиморфизм изолятов Puccinia triticina из Северного Кавказа и Ленинградской области

Размещено на http://www.allbest.ru/

Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений

ВИРУЛЕНТНОСТЬ И ДНК-ПОЛИМОРФИЗМ ИЗОЛЯТОВ PUCCINIA TRITICINA ИЗ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА И ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ

Кудинова Ольга Александровна, аспирант

Кремнева Оксана Юрьевна, к.б.н.

Волкова Галина Владимировна, д. б. н.

г. Краснодар

Аннотация

Проведено сравнение изолятов Puccinia triticina из Северного Кавказа и Ленинградской области по генетической структуре, фенотипическому составу, а также частоте встречаемости RAPD-фенотипов и полиморфных мажорных фрагментов с использованием индекса Роджерса. Не найдено значимых отличий по генетической структуре и по встречаемости мажорных фрагментов ДНК-полиморфизма. Различие изолятов данных регионов с высокой степенью достоверности определено по фенотипам вирулентности и RAPD-фенотипам

Ключевые слова: puccinia triticina, монопустульные изоляты, фенотип вирулентности, rapd-полиморфизм

Puccinia triticina isolates from North Caucasus and Leningrad region were compared in regard to the genetic structure, phenotypic composition as well as frequency of occurrence of RAPD-phenotypes and polymorphous major fragments with the help of Rogers index. Did not demonstrate any significant differences according to their genetic structure and occurrence of major fragments of DNA-polymorphism. The difference of isolates from given regions was determined with high degree of confidence according to the phenotypes of virulence and RAPD-phenotypes

Keywords: puccinia triticina,, single-pustule isolates, phenotype of virultnce, rapd-polymorphism

Возбудитель бурой ржавчины Puccinia triticina встречается повсеместно во всех регионах культивирования пшеницы в мире. В годы эпифитотий потери урожая могут составить до 45% [1], а при умеренном поражении урожай снижается на 5-10%. Ареалы популяций ржавчинных грибов могут быть огромными и занимать целые континенты. Определение границ популяций патогена на территории страны имеет важное значение для стратегии защиты и территориального распределения генов устойчивости. Но определение точного числа популяций гриба затруднительно. Это связано с тем, что классическое понятие этого термина не применимо к возбудителю бурой ржавчины пшеницы, поскольку гриб зимует в уредостадии и популяция является клональной. Поэтому ареалы популяций P. triticina авторы определяют, исходя из частоты встречаемости изолятов, вирулентных или авирулентных к близкоизогенным линиям растения-хозяина [2]. В настоящее время существуют две точки зрения в отношении количества популяций на территории России и СНГ. Л.А. Михайлова за многолетний период исследований (1980-2000) выделила три популяции: кавказскую, европейскую и западно-азиатскую [3]. Другая группа исследователей во главе со Смирновой Л.А. [4], проведя десятилетнее исследование, считает, что северокавказскую популяцию нельзя считать самостоятельной, ее следует рассматривать как субпопуляцию в пределах европейской популяции. Таким образом, согласно Смирновой с соавт., на территории СНГ можно выделить пять популяций возбудителя бурой ржавчины пшеницы:

1. Европейская (Северный Кавказ, Украина, ЦЧЗ).

2. Закавказская.

3. Западносибирская (Урал, Западная Сибирь, Казахстан).

4. Среднеазиатская (горные районы средней Азии).

5. Дальневосточная (Хабаровский край, Приморский край, Амурская область).

В нашей работе проведено сравнение изолятов возбудителя бурой ржавчины, собранных на территории Северного Кавказа и Ленинградской области, с помощью двух методов: фитопатологического тестирования и RAPD-ПЦР с целью установления степени различия изолятов P. triticina из двух отдаленных регионов, а также сопоставления данных, полученных с помощью двух различных методов изучения структуры популяции гриба.

Материалы и методы

В работе были использованы 36 монопустульных изолятов гриба из Ленинградской области и 40 изолятов из Северного Кавказа популяции 2007 года. Сбор, хранение, выделение монопустульных изолятов вели по методикам ВНИИФ [5]. Для накопления достаточного количества урединиоспор монопустульных изолятов проводили их размножение на восприимчивом сорте Michigan Аmber. Для идентификации каждого выделенного изолята гриба высевали линии Северо-Американского набора, состоящего из 16 близкоизогенных линий сорта Thatcher [6]. На 10 - 12 сутки после инокуляции оценивали в баллах типы реакции сортов-дифференциаторов и изогенных линий по шкале Мейнса и Джексона [7]. Фенотипическое разнообразие в популяциях определяли по формуле Шеннона [8]. Уровень различия между популяциями по генетической структуре и фенотипическому составу рассчитывали с помощью индекса Роджерса [8]. изолят генетический фенотип полиморфный

Экстракцию ДНК из урединиоспор осуществляли по методике Сhen [9]. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе Mastercycler 1 фирмы Eppendorf по протоколу разработчика праймера Kolmer et al. [10], с некоторыми модификациями: 3 мин при 94? С, далее 35 циклов: 94? С - 20 сек., 36? С - 20 сек., 72? С - 1 мин., после чего финальная экспозиция - 72? С на 15 мин. Амплифицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1,2% агарозном геле, в 0,5% ТВЕ буфере, гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрафиолетовом свете. Для оценки размера полученных фрагментов использовали 50 bp маркер от Gene Ruler. Полученные электрофореграммы фотографировали и обрабатывали на компьютере. Критериями, на основании которых происходило разбиение выборки на RAPD-фенотипы, являлись количество и величина мажорных фрагментов. В работе использовали 10 праймеров, из которых в результате предварительного скрининга на информативность и воспроизводимость были отобраны три: UBS 450, UBS 517 и ОРА 20.

Результаты и обсуждение

Результаты идентификации изолятов популяции возбудителя бурой ржавчины из Северного Кавказа и Ленинградской области на Северо-Американском наборе из 16 близкоизогенных линий сорта Thatcher представлены в таблице 1.

Среди 40 монопустульных изолятов из Северного Кавказа выявлено 38 фенотипов с разным количеством генов вирулентности. Среди 36 монопустульных изолятов из Ленинградской области выявлено 36 изолятов с различным количеством генов вирулентности. Это указывает на высокий уровень разнообразия обеих популяций по фенотипическому составу.

Таблица 1 - Фенотипы вирулентности изолятов Puccinia triticina из Ленинградской области и Северного Кавказа в 2007 году

Генетическая структура изолятов из двух регионов приведена в таблице 2. Как видно из таблицы, среди изолятов из Северного Кавказа не обнаружены клоны, вирулентные к носителям генов Lr9 и Lr24.

Для изолятов обоих регионов отмечено высокое содержание клонов (40% и выше), вирулентных к Lr: 1, 2с, 3, 16, 26, 3ка, 11, 17, 10. Среди изолятов из Северного Кавказа также много клонов, вирулентных к Lr: 30, В, 14а и 18. Выборка изолятов из Ленинградской области содержит большое количество клонов, вирулентных к Lr2а и обнаружен 1 изолят, вирулентный к Lr24. Индекс Роджерса между изолятами двух регионов составил 0,24, что свидетельствует о незначительных различиях по генетическому составу.

Таблица 2- Генетическая структура изолятов Puccinia triticina из Северного Кавказа и Ленинградской области (2007 г.)

В таблице 3 показано распределение изолятов по количеству генов вирулентности. Установлено, что для всех изолятов не обнаружены авирулентные фенотипы. У изолятов гриба из Северного Кавказа доля фенотипов с 1-9 генами вирулентности (из 16 отмеченных) составляет 42,0%, у изолятов из Ленинградской области - 63,9%.

Таблица 3 - Фенотипы изолятов Puccinia triticina из Северного Кавказа и Ленинградской области с разным количеством генов вирулентности (2007)

Доля изолятов с 10 - 14 генами для изолятов Северного Кавказа и Ленинградской области составляет 42,5% и 35,0% соответственно. Приведенные данные указывают на то, что изоляты из Северного Кавказа более вирулентны, в то время как из Ленинградской области - более гетерогенны. Уровень фенотипического разнообразия (индекс Шеннона) оказался равным единице для обоих регионов. Это указывает на высокий уровень разнообразия изолятов данных регионов по фенотипическому составу, несмотря на небольшую разницу в генетической структуре. Это еще раз подтверждает мнение ряда исследователей о том, что северокавказская популяция входит в состав обширной европейской, являясь субпопуляцией.

Также было проведено исследование изолятов гриба двух регионов по ДНК-полиморфизму. На предварительном этапе 10 RAPD-праймеров проверяли на информативность и воспроизводимость ДНК-фрагментов. В результате были отобраны три наиболее информативных: UBS 450, UBS 517 и ОРА 20. Из трех используемых праймеров, два разделяли выборки популяций на RAPD-фенотипы (рис. 1). Основными признаком, по которому происходило разбиение выборок на RAPD-фенотипы, являлся полиморфизм мажорных фрагментов. Критерием достоверности была воспроизводимость результатов при повторностях.

а) б)

Рисунок 1 - RAPD профили в 1.2% агарозном геле изолятов возбудителя бурой ржавчины: а) собранных в Северокавказском регионе (1-МHTT, 2-MHRT, 3-MHSS, 4-KHRQ, 5-DHJS, 6-FGQQ, 7-FCRQ, 8-BCRS, 9-PGFT), б) собранных в Ленинградской области (1-TGCL, 2-TBHG, 3-PBLG, 4-QGNB, 5-KHGT, 6-TBKH, 7-TCSF, 8-CHSQ, 9-SBSC, 10-THTT, 11-FHTT, 12-BCSH); m - маркер, К - контроль. Использовали праймер UBC 517.

Чтобы просуммировать данные по трем праймерам, каждому изоляту был присвоен трехзначный молекулярный фенотип (таблица 4). Первая цифра в трехзначном RAPD-фенотипе отражает праймер ОРА 20, вторая - UBS 450, и последняя -. UBS 517. Цифры от 1 до 4 означают различные варианты сочетания фрагментов описываемых изолятов.

Таблица 4 - RAPD-фенотипы изолятов Puccinia triticina из Северного Кавказа и Ленинградской области (2007 г.)

Для сравнения изолятов по молекулярному полиморфизму, а также для сопоставления результатов анализа по вирулентности и RAPD-профилям, был определен индекс Роджерса между регионами по RAPD-фенотипам и по ДНК-фрагментам. Индекс Роджерса по фрагментам составил 0,1, что указывает на незначительные отличия изолятов двух регионов по наличию мажорных фрагментов. При сравнении по молекулярным фенотипам, индекс Роджерса составил 0,73, что означает высокую степень различия изолятов двух регионов по RAPD-фенотипам.

Найденные значения индекса Роджерса по RAPD-фенотипам и по ДНК-фрагментам аналогичны таковым по фенотипам вирулентности и генетическому составу. Из этого следует, что два метода исследования изолятов Puccinia triticina по вирулентности и ДНК-полиморфизму не противоречат, а дополняют друг друга и еще раз подтверждают тот факт, что различия изолятов из двух регионов основаны лишь на фенотипическом составе, т. е. незначительны. Значительных отличий в генетической структуре и составе мажорных фрагментов не найдено. Это позволяет сделать вывод о том, что изоляты из Северного Кавказа и Ленинградской области принадлежат к обширной европейской популяции, а значительная разница в фенотипическом составе позволяет обособить изоляты гриба Северного Кавказа в субпопуляцию. Для уточнения и дополнения полученных данных необходимо проследить динамику генетической структуры изолятов P. triticina из двух регионов, а также увеличить выборку.

Благодарность: Ведущему научному сотруднику Анпилоговой Л.К., научному сотруднику Вагановой О.Ф., лаборанту-исследователю Авдеевой Ю. В - за помощь в проведении исследований структуры северокавказской популяции гриба по вирулентности; Полушину П.А. - за помощь в проведении статистического анализа.

Список литературы

1. В.Б. Лебедев, А.Н. Васильев, Е.В. Якубова. Расчет возможных потерь яровой пшеницы от бурой ржавчины //Доклады ВАСХНИЛ. - №1. - 1994. - С. 14-16.

2. Л.А. Михайлова, С.В. Васильев. Ареалы популяций возбудителя листовой ржавчины пшеницы// Микология и фитопатология.- 19. - вып 2.- 1985. - С. 158-163.

3. Е.И. Гультяева, О.А. Баранова, А.П. Дмитриев. Вирулентность и структура популяций Puccinia triticina в РФ в 2007 году // Вестник защиты растений. - вып. 4. - 2009. - С. 33-38.

4. Г.К. Сорокина, Л.А. Смирнова и др. Использование эффективных Lr-генов в селекции пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине (методические рекомендации)/ ВНИИФ, ВАСХНИЛ.-М., 1990. - 31 с.

5. Методические рекомендации по изучению расового состава возбудителей ржавчины хлебных злаков / ВНИИФ, ВАСХНИЛ.-М., 1977.-144 с.

6. Long, D. L., Kolmer, J. A. А North America System of nomenclature for Puccinia triticina //Phytopathology 79, 1989. - P. 525-529.

7. Mains E. B., Jackson H. J., Physiological specialization the leaf rust wheat (P. triticina Erikss.) // Phytopathology 16, 1926. - P.89-120.

8. Афанасенко О.С. Методы анализа популяций возбудителей пятнистостей листьев ячменя / О.С. Афанасенко //Сборник методических рекомендаций по защите растений. - СПб., 1998. - C. 127-133.

9. Сhen X.M., Line R.F., Leung H. Relationship between virulence variation and DNA polymorphism in Puccinia striiformis //Phytopathology 83, 1993. - P. 1489

10. Kolmer J. A., Liu J. Q., and Sies M. Virulence and molecularpolymorphism in Puccinia recondita f. sp. tritici in Canada //Phytopathology 85, 1995. - P. 276-285.

Размещено на Allbest.ru