Клональное размножение и оздоровление растений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

ФГБОУ ВО "Алтайский государственный аграрный университет"

Кафедра ботаники, физиологии растений и кормопроизводства

по дисциплине: "Основы сельскохозяйственной биотехнологии"

на тему: "Клональное размножение и оздоровление растений"

Выполнил: магистрант з/о 2 курса

специальности "Агрономия", группы 8156М

С.Л. Моисеев

Преподаватель: д.с.-х.н., доцент,

В.С. Курсакова

Барнаул - 2016

Содержание

Введение

1. Преимущества микроклонального размножения перед традиционными способами размножения растений. История метода

2. Факторы, влияющие на процесс клонального микроразмножения

3. Этапы микроклонального размножения растений

4. Методы клонального микроразмножения

5. Оздоровление посадочного материала от вирусов методами химиотерапии и термотерапии

Заключение

Список используемых источников

Введение

Ускорение и облегчение селекционного процесса, а также создание растений с новыми качествами - это направления, которые достаточно успешно развиваются с помощью технологий клеточной инженерии, культуры клеток и тканей. Некоторые из указанных технологий стали традиционными, др. находится на начальных этапах разработки. Наконец есть такие методы, которые явно вышли из ранга вспомогательных, ускоряющих селекцию технологий. К ним можно отнести криосохранение генофонда - технологию, в настоящий момент приобретшую экологическую направленность; или клональное микроразмножение растений, тесно связанное с проблемой их оздоровления от вирусных и др. инфекций. Одна из наиболее важных технологий этой группы - оплодотворение invitro, помогающее предотвратить прогамную несовместимость, которая может быть вызвана следующими причинами:

1) генетически детерминированное несоответствие секрета рыльца материнского растения и пыльцы отцовского, которое тормозит рост пыльцевых трубок на рыльце пестика;

2) несоответствие длины столбика пестика и пыльцевой трубки, в результате чего пыльцевая трубка не достигает семяпочки (гетеростилия);

3) тканевая несовместимость партнеров, приводящая к остановке роста пыльцевой трубки в любой момент ее прорастания от рыльца пестика до микропиле семяпочки (гаметофитный тип несовместимости).

Преодоление программной несовместимости возможно благодаря выращиванию в стерильных условиях изолированной завязи с нанесенной на нее пыльцой или изолированных кусочков плаценты с семяпочками, рядом с которыми или непосредственно на ткани которых культивируется пыльца.

Значительным препятствием для селекции служит также постгамная несовместимость, вызванная разновременным развитием зародыша и эндосперма при отдаленной гибридизации. В результате образуются невсхожие щуплые семена. Получить растение из таких семян можно только при использовании метода эмбриокультуры, т. е. выращивания изолированного зародыша на искуственной питательной среде invitro. Метод эмбриокультуры широко применяют при межвидовой гибридизации овощных растений, для микроразмножения ценных гибридов, для клеточной селекции.

Большое значение имеет создание гаплоидов, позволяющее ускорить процесс селекции в 2-3 раза. Использование гаплоидных клеток и гаплоидных растений способствует обнаружению экспрессии введенного в клетку генома, редких рекомбинаций, рецессивных мутаций, которые в диплоидных растениях, как правило, маскируются доминантными генами. Из гаплоидных клеток можно выделить протопласты; сливаясь, они образуют гибридные клетки и растения с диплоидным числом хромосом. Обрабатывая гаплоидные клетки колхицином, можно добиться удвоения числа хромосом и получить диплоидные гомозиготные растения. Все это значительно облегчает выявление и стабилизацию необходимых признаков. Кроме селекции гаплоиды применяются также в генноинжинерных исследованиях. Впервые возможность получения спонтанных гаплоидов при аномальном развитии пыльников, пыльцы и др. объектов была показана в 1964г. С. Гуха и С. Магешвари. В настоящее время в к-ре гаплоидные растения получают из изолированных пыльников (андрогенез), изолированных семяпочек (гиногенез); из гибридного зародыша, у которого в результате несовместимости потеряны отцовские хромосомы (партеногенез). Сорта ячменя - исток и одесский-15-были выведены благодаря комбинации партеногенетического метода с которой изолированных зародышей за 4 года вместо 10-12 лет, необходимых для обычной селекции.

1. Преимущества микроклонального размножения перед традиционными способами размножения растений. История метода

В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Оба эти способа имеют как свои преимущества, так и недостатки.

К недостаткам семенного размножения относятся генетическая пестрота семенного материала и длительность ювенильного периода.

При вегетативном размножении генотип материнского растения сохраняется, а также сокращается длительность ювенильного периода. Однако большинство видов плохо размножается вегетативным способом, к ним относятся многие древесные породы. Например, эффективность размножения, даже на ювенильной стадии, дуба, сосны, ели, орехоплодных не очень высока. Кроме того, с помощью черенкования невозможно размножать многие виды древесных растений в возрасте старше 10-15 лет. Трудно получить стандартный посадочный материал, так как существует возможность накопления и передачи инфекции. Операции по размножению с помощью прививок сложны и трудоемки.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения. Клональное микроразмножение - получение in vitro, неполовым путем, генетически идентичных исходному экземпляру растений. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность. Термин "клон" был предложен в 1903 году Уэбстером (от греческого klon - черенок или побег, пригодный для размножения растений). В соответствии с научной терминологией клонирование подразумевает получение идентичных организмов из единичных клеток. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

· получение генетически однородного посадочного материала;

· освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

· высокий коэффициент размножения (10^5-10⁶ - для травянистых, цветочных растений, 10^4-10⁵ - для кустарниковых древесных растений и 10⁴ - для хвойных);

· сокращение продолжительности селекционного процесса;

· ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

· размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

· возможность проведения работ в течение всего года;

· возможность автоматизации процесса выращивания.

Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Жан Морель, который в 50-х годах двадцатого века получил первые растения - регенеранты орхидей. В это время техника культивирования апикальных меристем in vitro была уже хорошо разработана. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы и т.д. В нашей стране работы по клональному микроразмножению были начаты в 30-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ИФРа. Под руководством Р.Г. Бутенко были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы и др. растений и предложены промышленные технологии. В дальнейшем исследования по клональному микроразмножении охватили и древесные растения.

Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов нашего столетия и связаны с именем Готре, который показал, что камбиальные ткани некоторых растений способны к каллусогенезу in vitro. Но первые растения - регенеранты осины, доведенные до почвенной культуры, были получены лишь в середине 60-х годов Матесом.

Культивирование тканей хвойных пород in vitro долгое время редко использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования тканей, изолированных из растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные растения характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и т.д.), которые в изолированных тканях активируются. Окисленные фенолы обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или уменьшению способности тканей древесных растений к регенерации адвентивных почек, которая с возрастом растения-донора исчезает практически полностью. В настоящее время, несмотря на перечисленные трудности, насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, сосна, ель, секвойя и др.).

2. Факторы, влияющие на процесс клонального микроразмножения

На эффективность микроклонального размножения влияет масса факторов различной природы. Это физиологические особенности вводимого в культуру растения, химические и физические условия культивирования. Наиболее важным моментом является выбор материнского растения и экспланта.

При выборе материнского растения необходимо учитывать его физиологические, сортовые и видовые особенности. Исходные растения должны быть здоровы, не поражены грибными, бактериальными и вирусными болезнями. Кроме того, они должны находится в состоянии интенсивного роста (выход из фазы покоя и переход к активному росту). Луковицы, корневища и клубни в состоянии покоя непригодны, перед введением в культуру их предварительно обрабатывают высокими или низкими температурами. Способность к размножению также детерминирована генетически. Например, земляника размножается всеми способами, облепиха - ни одним, хотя в природе черенкуется. Двудольные обладают большей регенерационной способностью, чем однодольные и древесные.

При выборе экспланта необходимо учитывать его возраст, строение и происхождение. Для обеспечения максимальной стабильности клонируемого материала, во избежание появления аномальных растений в качестве экспланта желательно использовать молодые, слабодифференцированные ткани. Кроме того, экспланты от ювенильных растений лучше укореняются, чем от зрелых, особенно это касается древесных пород. Лучше всего использовать кончики стеблей, пазушные почки, зародыши, молодые листья, черенки, соцветия, чешую луковиц, то есть экспланты, содержащие меристемы. Опыты с эмбрионами кукурузы, проведенные Грином и Филипсом в 1975 году, показали, что при извлечении эмбрионов из зрелых семян они образуют каллус и корни. Если же изолировать их через 2-3 недели после опыления, то образуются и каллус, и растения. Вероятно, это связано с разворачиванием генетической программы в онтогенезе растения. Следует отметить, что не всегда молодые ткани являются удачным объектом для размножения. У эхеверии на эксплантах из молодых листьев возникают только корни, из старых - только побеги, из средних по возрасту - и побеги, и корни. Чем меньше размер экспланта, тем меньше его регенерационная способность. С другой стороны, в крупном экспланте увеличивается возможность появления в его клетках вирусов и других патогенов, что препятствует оздоровлению тканей.

Длительность культивирования также влияет на эффективность микроразмножения. Физиологическое состояние экспланта меняется в течение пассажей, при длительном культивировании частота укореняемости побегов возрастает. Возможно, что при этом эксплант приобретает признаки ювенильности, что ведет к повышению его морфогенетического потенциала.

Успех введения в культуру часто определяется эффективностью стерилизации. Выбор стерилизующего агента определяется особенностями экспланта. Для нежных тканей концентрация стерилизующего агента должна бать снижена, чтобы сохранить жизнеспособность экспланта. Часто внутреннее заражение исходных эксплантов бывает намного сильнее, чем поверхностное, поэтому экспланты предварительно обрабатывают фунгицидами и антибиотиками против грибной и бактериальной инфекций. Хорошие результаты дает обработка растений бензоатом натрия.

В зависимости от вида растений необходимо испытывать как твердые, так и жидкие питательные среды. Иногда жидкие среды имеют преимущество, так как обеспечивают большую подвижность трофических элементов. Например, при размножении роз более успешным было культивирование побегов на двухслойной питательной среде: нижний слой - агаризованный, верхний - жидкий. На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и т.д.), а также соотношение объема эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов.

Состав питательной среды необходимо подбирать для каждого вида растений. На клональное микроразмножение влияют гормоны, минеральные соли, витамины и углеводы. При микроразмножении in vitro часто используют среды Мурасиге и Скуга, Линсмайера и Скуга, Шенка и Хильдебрандта, Нича, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасиге-Скуга, которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. В наших экспериментах (Кузьмина Н.А., Внукова В.В., 1997) выход морфогенных каллусов твердой пшеницы был выше на среде Мурасиге-Скуга по сравнению со средой Гамборга, которая одержала окисленные формы азота. Среда Мурасиге-Скуга также способствовала стабилизации хромосомного набора клеток твердой пшеницы при высоком содержании ауксина в среде. Вообще вопрос оптимального соотношения NH₄:NO₃ остается открытым, так как литературные данные весьма противоречивы и универсального рецепта для всех видов растений нет. В качестве источника углеродного питания используют различные углеводы типа сахарозы, глюкозы, фруктозы, галактозы. Разные культуры требуют различной концентрации углеводов на разных этапах клонального микроразмножения.

К физическим факторам выращивания относятся температура и условия освещения. На первых двух этапах освещенность колеблется от 1000 до 3000 Лк, фотопериод 14-16 часов, но эти параметры зависят от культуры. Высокая интенсивность света может вызывать хлорозы и задерживать развитие, но при переносе в почву эти растения чувствуют себя лучше и растут энергичнее. Спектральный состав также играет немаловажную роль. Некоторые исследователи (Катаева Н.В., Аветисов В. А, 1981) указывают на синий свет как основной компонент морфогенеза. Красный свет стимулирует образование почек у табака, у салата - образование побегов, у березы - укоренение. В работах Т.Н. Константиновой с соавторами (1987) показано, что синий свет усиливает закладку вегетативных почек у побегов табака в условиях in vitro, а красный стимулирует развитие цветочных почек. Однако при добавлении цитокининов и ауксинов в различной концентрации соотношение процессов дифференциации цветочных и вегетативных почек меняется, в некоторых случаях наблюдается даже противоположный эффект. В исследованиях Р.А. Карначук и Е.С. Гвоздевой (1998) наибольший выход морфогенных каллусов пшеницы, формирующих растения и побеги, отмечен на зеленом свету. Важное значение играет также сочетание спектрального состава света и гормональных факторов среды.

Температура культивирования обычно варьирует в интервале 22-26^оС днем и 18-22^оС ночью. В некоторых случаях понижение температуры ведет к повышению эффективности размножения. Для повышения коэффициента размножения необходимо каждому виду с учетом его естественного ареала произрастания подбирать индивидуальные условия культивирования. Относительная влажность воздуха - 65-70 %

3. Этапы микроклонального размножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2^оС, +10^оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100-200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.

На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4-24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4-5 мг/л), дитиотриэтол (1-3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2-5 мг/л), поливинилпирролидон (5000-10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5-1 %. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап - собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов-ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5-10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы - укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5-1 % и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют в-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

1) выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2-24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20-50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);

2) непосредственное культивирование микропобегов в течение 3-4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1-5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений - весна или начало лета.

Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85-90° С в течение 1-2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).

Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20-22 °С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65-90 %. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.

Через 20-30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.

Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость.

4. Методы клонального микроразмножения

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

1. Активация пазушных меристем.

2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.

3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.

4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.

5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.

6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Н.В. Катаева и Р.Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).

2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo:

а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;

б) индукция соматического эмбриогенеза;

в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений - активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования (рис. 18).

Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.

Рис. 18. Схема размножения растений методом активации уже существующих меристем (по А.Р. Родину, Е.А. Калашниковой, 1993): 1 - путем удаления верхушечной меристемы: 2 - добавлением цитокининов в среду (б/г - среда без гормонов, Ц - цитокинин, А - ауксин)

Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.

Часто в качестве экспланта используют верхушечные или пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами. Образующиеся пучки побегов делят, при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro (рис. 19), а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений (рис. 20).

Рис. 19. Образование корней побегами розы при добавлении в питательную среду 2 мг/л 2,4-Д

Рис. 20. Адаптация пробирочных роз к почвенным условиям

В настоящее время этот метод широко используется в производстве посадочного материала сельскохозяйственных культур, как технических, так и овощных, а также для размножения культур промышленного цветоводства (например, гвоздики, рис. 21), тропических и субтропических растений, плодовых и ягодных культур, древесных растений. Для некоторых культур, таких как картофель, технология клонального размножения поставлена на промышленную основу. Применение метода активации развития существующих меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 100000 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней - ценного безвирусного семенного материала.

Второй метод - индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения. Можно добиться образования адвентивных почек почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковиц, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих цитокинины в соотношении с ауксинами 10:1 или 100:1. В качестве ауксина используют ИУК или НУК. Таким способом были размножены многие представители семейства лилейных, томаты, древесные растения (из зрелых и незрелых зародышей).

Достаточно хорошо разработана технология клонального размножения земляники, основанная на культивировании апикальных меристем. Меристематические верхушки изолируют из молодых, свободных от вирусных болезней растений, и выращивают на питательной среде МС, содержащей БАП в концентрации 0,1-0,5 мг/л. Через 3-4 недели культивирования меристема развивается в проросток, в основании которого формируются адвентивные почки, быстро растущие и дающие начало новым почкам. В течение 6-8 недель образуется конгломерат почек, связанных между собой соединительной тканью и находящихся на разной стадии развития. Появляются листья на коротких черешках, в нижней части которых формируются новые адвентивные почки. Эти почки разделяют и пересаживают на свежую питательную среду. На среде без регуляторов роста за 4-5 недель формируются нормальные растения с корнями и листьями. От одного материнского растения таким образом можно получить несколько миллионов растений-регенерантов в год.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему виду напоминают зиготические зародыши (рис. 22). Этот метод получил название соматического эмбриогенеза. В отличие от развития in vivo, соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию развития в проросток. На рисунке 3 показан конечный результат развития - растение пшеницы.

Рис. 22. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани

Наиболее впечатляющим применением метода соматического эмбриогенеза стало размножение гвинейской масличной пальмы (Elaeis guineensis), масло которой широко используется при производстве маргарина и пищевого масла. Масличная пальма в природе не образует побегов и боковых ростков, что затрудняет ее вегетативное размножение. Культивирование черенков in vitro также невозможно. Было решено получить скопления клеток недифференцированной ткани (каллусы) путем дедифференцировки специфических тканей, а затем культивировать их до регенерации целых проростков. В первой культуральной среде каллусы из фрагментов листьев развивались в течение 90 дней, при переносе во вторую и третью культуральные среды превращались в "эмбриоиды". Эмбриоиды размножались самопроизвольно, в течение месяца число эмбриоидов возрастало втрое, а за год из 10 эмбрионов можно было получить потомство численностью 500000 растений.

Формирование эмбриоидов в культуре тканей осуществляется в несколько этапов. Сначала происходит дифференциация клеток под влиянием ауксинов, добавленных в питательную среду (2,4-Д) и превращение их в эмбриональные. Получить эмбриоиды из этих клеток можно уменьшая концентрацию ауксинов или исключая их из питательной среды. Соматические зародыши представляют собой полностью сформированные зародыши, из которых путем соответствующего капсулирования можно получить искусственные семена.

Четвертый метод клонального микроразмножения - дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани (рис. 23).

Рис. 23. Дифференциация придаточных почек в каллусной ткани

Практически он мало используется с целью получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при частом пассировании каллусной ткани может изменяться плоидность регенерируемых растений, наблюдаются структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций. Наряду с генетическими изменениями отмечаются и морфологические: низкорослость, неправильное жилкование листьев, образование укороченных междоузлий, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. В то же время, некоторые недостатки этого метода в селекционной работе оборачиваются преимуществами.

Кроме того, в некоторых случаях он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. Через каллусную культуру успешно размножаются сахарная свекла, злаковые (рис. 24), представители рода Brassica, подсолнечник и другие культуры.

Рис. 24. Формирование побегов каллусной тканью пшеницы

5. Оздоровление посадочного материала от вирусов методами химиотерапии и термотерапии

Основное преимущество клонального микроразмножения - получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях больных растений впервые было высказано в 1936 г. Чунгом, а позднее, в 1943 г., и Уайтом. В 1949 г. этот факт был подтвержден экспериментально. В 1952 г. Морелю и Мартену из Национального агрономического института (Франция) удалось получить безвирусные георгины из зараженных растений.

Структурной основой используемого на практике явления служит специфика строения точки роста растений: дистальная ее часть, представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет средний диаметр 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм. В нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы.

Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от меристематического экспланта. При этом отмечается закономерность: чем больше листовых зачатков и тканей, тем легче идут процессы морфогенеза, заканчивающиеся образованием целого растения. Вместе с тем, при таком развитии конуса нарастания увеличивается риск быстрой транспортировки вируса по проводящей системе. Кроме того, даже небольшой меристематический эксплант может содержать вирусы, проникшие в клетки в результате медленного распространения через плазмодесмы.

В целом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами растений может оказаться довольно низкой. Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термо- или химиотерапии исходных растений.

Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование горячего сухого воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной их них при высоких температурах разрушаются белковая оболочка и нуклеиновая кислота вируса. Вторая гипотеза предполагает действие высоких температур на вирусы через метаболизм растений. При такой температуре начинает преобладать деградация вирусных частиц, а синтез их, наоборот, уменьшается. Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в термокамеры, где температура в течение первой недели повышается с 25 до 37^оС путем ежедневного увеличения температуры на 2 градуса. Все остальные режимы обязательно поддерживаются в оптимальном состоянии: освещенность, высокая относительная влажность воздуха, определенный фотопериод. Продолжительность термостатирования зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если для гвоздики достаточно 10-12 недельного воздействия теплом, то для хризантемы этот период превышает 12 недель.

Помимо положительного действия высоких температур на освобождение от вирусов, выявлено аналогичное влияние их на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, фрезии) в условияхin vitro. Высокие температуры увеличивают коэффициент размножения на 50-60 %, повышаю адаптацию пробирочных растений к почвенным условиям и позволяют получить больше безвирусных маточных растений. микроклональное размножение оздоровление химиотерапия

Другой способ оздоровления - химиотерапия. В питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, добавляют препарат вирозола в концентрации 20-50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Применение его позволяет увеличить число безвирусных растений с 40 % до 80-100 %.

Заключение

В целом методы клонального микроразмножения, несомненно, имеют ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

- получение генетически однородного посадочного материала; - освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры; - высокий коэффициент размножения (10 5-10 6 - для травянистых, цветочных растений, 10 4-10 5 - для кустарниковых и древесных, 104 - для хвойных);

- сокращение продолжительности селекционного процесса; - ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами; - возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;

- возможность автоматизации процесса выращивания.

Список используемых источников

1. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. - М., 1983.

2. Культура клеток растений. / под ред. Р.Г. Бутенко. М., 1986.

3. Бутенко Р.Г. Биология культивируемых клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе, Монография. - Москва, ФБК-Пресс, 1999. - 159 с.

4. http://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/klonalnoe-mikrorazmnozhenie-rasteniy/.

Размещено на Allbest.ru