Анализ проблемы укоренения сортов земляники садовой ex vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Плоды и ягоды - питательные продукты, являющиеся источником витаминов, минеральных веществ, органических кислот и микроэлементов. Они являются неотъемлемой частью рациона человека (по медицинским нормам человеку в год требуется минимум 100 кг плодов и ягод). Стоимость их мирового валового продукта превышает стоимость картофеля и уступает только зерновым культурам.

Ягодным культурам отводится существенная роль в решении проблемы улучшения снабжения населения и перерабатывающей промышленности продуктами садоводства. К числу важнейших ягодных культур относится земляника, которая является одной из самых распространенных ягодных культур в мире.

Эта ягодная культура произрастает во всех зонах плодоводства России. Спрос населения на свежие ягоды и продукты переработки обусловлен их высокими вкусовыми качествами, нежной консистенцией мякоти и приятным ароматом. Ягоды земляники содержат сахара (4…10%), органические кислоты (0,8…1,3%), витамины С, Р, В9, соединения фосфора, железа, кальция, микроэлементы.

Урожайность земляники, как правило, составляет 6…13т/га (и даже до 30т/га). Однако потребность населения и перерабатывающей промышленности в ягодах удовлетворяется далеко не полностью.

Естественная способность земляники легко и быстро обновлять себя с помощью усов, давая вегетативное потомство, выгодно отличает ее от других культур. Но наряду с положительными сторонами, вегетативное размножение создает серьезную проблему, так как потомство может быть заражено различными вредителями и болезнями, а в последствии - массово тиражироваться. В свою очередь массовое заражение насаждений приводит к снижению урожайности, а иногда к гибели растений.

Важное значение в решении задачи увеличения валового сбора земляники имеет сокращение ущерба, наносимого различными вредителями и болезнями, главным образом вирусами, микоплазмами, нематодами, клещами. Это в свою очередь определяется тем, как решается проблема выращивания оздоровленного посадочного материала.

Основным эффективным методом получения оздоровленного посадочного материала земляники в настоящее время является сочетание термотерапии и культуры верхушечных меристем или микроклональное размножение.

Микроклональное размножение состоит из следующих этапов: инициация, пролиферация и ризогенез.

Система размножения in vitro имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционным способом размножения: более высокий коэффициент размножения, высокая генетическая однородность получаемого посадочного материала, возможность быстрого и эффективного размножения ценных сортов из минимального количества материала, высокая жизнеспособность регенерантов и, как следствие, возможность получения большего количества усов и увеличения урожайности, выполнение работ независимо от сезона и погодных условий, что позволяет получить нужное количество посадочного материала к определенному сроку, возможность длительного хранения растений в пробирках при относительно низких затратах и создание генофонда ценных сортов и видов in vitro, а также возможность обмена растительным материалом без риска переноса карантинных инфекций и вредителей.

Однако имеется и ряд недостатков. Хорошо известно, что корни, сформированные in vitro, утолщенные и без корневых волосков. Они растут горизонтально, часто закручиваются, они ломкие и легко повреждаются. Также известно, что микропобеги, выращенные в тканевой культуре, имеют низкую фотосинтетическую активность, плохой водный баланс, и их анатомия и физиология далеки от оптимальной (Donnelly and Vidaver, 1984 и др).

Поскольку эти проблемы уменьшают приживаемость растений при адаптации, были предприняты попытки усовершенствовать метод микроклонального размножения. Некоторые коммерческие лаборатории внедрили в практику садоводства укоренение микропобегов земляники в ex vitro. При этом способе устраняются некоторые недостатки традиционного укоренения in vitro. У растений, укорененных таким способом, облегчается процесс адаптации к условиям ex vitro. Особенно важно при этом резкое уменьшение уровня инфицирования грибковыми заболеваниями.

Кроме того, укоренение - наиболее дорогой этап в технологии микроклонального размножения. Поэтому стоимость растений уменьшается на 40…50%, если укоренение микропобегов, полученных in vitro проводить in vivo.

В связи с выше изложенным, данная работа будет посвящена проблеме укоренения сортов земляники садовой ex vitro.

1. Литературный обзор

1.1 Биология земляники

1.1.1 История культуры и главные виды

Все виды и сорта земляники относятся к семейству Розанные - Rosaceae Juss., роду Земляника - Fragaria L.. Сорта земляники имеют разное происхождение. Мелкоплодные, ремонтантные сорта земляники представляют собой отборные формы дикорастущей лесной земляники F. Vesca L.. Сорта крупноплодной земляники объединяются в один вид - земляника садовая крупноплодная - F. Grandiflora Ehrh.. Этот вид произошел в результате гибридзации и последующего отбора от двух американских видов - чилийской -F. chiloensis Ehrh. и виргинской -F. Virginiana Mill. земляники. Виргинская земляника была завезена во Францию из Америки в 1624 году, а в 1714 году в Парижский ботанический парк была завезена чилийская земляника. Естественные гибриды между этими двумя видами дали начало многочисленным сортам крупноплодной садовой земляники, которые впервые появились в Голландии в 1720-ом году. С их появлением и началось массовое выращивание садовой земляники.

В России крупноплодная земляника стала выращиваться с конца XVIII века (Бурмистров, 1985).

1.1.2 Распространение и ареал возделывания

Вследствие широкой способности к адаптации к различным окружающим условиям, земляника может выращиваться практически на любой территории мира. На урожай и качество ягод сильное влияние оказывают фотопериод, температура, длина периода покоя, болезни и вредители, почвенные условия, и влажность почвы и воздуха. В результате имеется много разновидностей культивируемых растений, каждая из которых адаптирована к ряду регионов или внешних условий. Некоторые культивируемые растения могут выживать в условиях ужасно холодных зим Аляски, а другие хорошо себя чувствовать при длинных, жарких сезонах Претории, Южной Африки.

Промышленное выращивание земляники сосредоточено, главным образом, в Северной Америке и Европе. Эти две территории производят около 80% общемирового урожая культуры. Другие 15% принадлежат России и Японии, и остальные 5% продукции приходятся на другие континенты.

Общая прибыль фермерских хозяйств от земляники в США была оценена приблизительно в 545 миллионов долларов в 1987 году. В Европе прибыль может быть оценена в 1.540 миллионов долларов (High tech and micropropagation. Vol 18, 1992).

1.1.3 Рост и развитие земляники

Земляника является многолетним травянистым растением с явно выраженным корневищем, в верхней части которого находятся рожки с розетками прикорневых листьев. Земляника имеет сильно разветвленную надземную часть, расположенную у поверхности почвы, которая состоит из трех типов побегов и листьев.

К первому типу относятся укороченные одногодичные приросты длиной 1 - 1,5см, которые обычно называются рожками. Каждый вполне сформировавшийся рожок имеет верхушечную почку, розетку из 3-7 листьев, боковые пазушные почки и у основания прироста - придаточные корни. В год роста укороченного однолетнего побега - рожка, помимо верхушечной, в пазухах всех листьев закладываются боковые (пазушные) почки. Из верхушечной и пазушных почек верхних листьев на следующий год образуются цветонос.

Второй тип побегов - усы. Это длинные шнуровидные побеги. Они формируются из вегетативных почек нижней части рожка. В массе усы появляются после плодоношения. На усах формируются дочерние растения - розетки и усы. Как правило, на четном междоузлии уса любого порядка ветвления развиваются розетки, а на нечетном - боковые ответвления. Каждое маточное растение может дать 10-30 усов.

Третьим типом побегов являются цветоносы, которые развиваются из верхушечной и около верхушечной пазушных почек. Цветоносы имеют неодинаковую высоту, степень ветвления и разное количество цветков. Не одновременность распускания цветков и формирование их на разных порядках ветвления цветоноса приводит к разновременности созревания ягод и уменьшению их величины в последних сборах.

Все эти три типа побегов несут определенное число листьев. На одном рожке формируется 5-6 длинночерешковых тройчатых листьев. На рожках и розетках они расположены сближено, на цветоносах - одиночно и они менее развиты.

Первый период роста листьев происходит до начала цветения, второй - после сбора урожая. Рост осенних листьев прекращается при снижении температуры воздуха ниже 5С.

Величина листьев и длина их черешков в основном определяют такой важный хозяйственно-биологический признак, как высота растений того или иного сорта (Бурмистров, 1985).

1.1.4 Цветение и плодоношение

При благоприятных условиях верхушечная почка любого рожка формируется как цветковая. Цветоносы земляники закладываются в летнее - осенний период, т.е. в августе - сентябре. На их закладку оказывают влияние температура, влажность, свет. Она происходит при сокращении длины дня до 12-10 чесов и снижении ночной температуры до 5-8С.

После таяния снега и установления более теплой погоды возобновляется рост земляники, и уже через две недели начинают появляться цветоносы.

Приблизительно через пол месяца после появления цветоноса начинается цветение. Один цветок цветет от одного до четырех дней. Последовательность распускания цветков зависит от порядка ветвления цветоноса, этим обуславливается неравномерность созревания ягод. Наиболее оптимальная температура для цветения земляники находится в пределах 15…20 градусов, а период цветения продолжается около 20…30 дней. Приблизительно столько же времени ( около 30 дней) необходимо для созревания ягод с момента опыления. Период плодоношения зависит от биологических особенностей сорта и погодных условий и составляет в среднем 20…30 дней (Бурмистров, 1985).

1.1.5 Размножение земляники

В середине лета из пазушных почек первых трех нижних листьев материнского куста развиваются длинные надземные побеги - усы, которые являются специализированными органами размножения. На них имеются узлы (3…5 и более) и междоузлия. В узлах появляются зачатки листьев (розетки) и корней.

Наиболее сильные усы дают 1…2-х летние растения. Усы в начале развития занимают приподнятое положение, затем по мере удлинения стелются по земле. Эти побеги, непосредственно идущие от материнского куста, принято называть побегами первого порядка.

Первая розетка или дочернее растение, развивается из второго узла уса, а первый узел дает начало ответвлению уса второго порядка.

Из пазух первых нижних листьев дочерних растений, нередко еще до их полного укоренения, также образуются усы, которые именуются побегами второго порядка. Из второго узла этих дочерних усов, подобно материнским кустам, образуются новые розетки земляники.

Таким образом, четные узлы побегов-плетей образуют дочерние растения, а нечетные - новые усы, соответствующего порядка ветвления (1-ый, 2-ой, 3-ий).

Развитие дочерних розеток идет постепенно. Нередко вначале возникают корни, а затем розетки листьев. До момента плотного прикрепления усов к земле розетки земляники образуют воздушные корни.

Хорошо укоренившиеся розетки состоят из короткого, не превышающего 10 мм стебля, оканчивающегося верхушечной почкой (сердечко), и 5…7 листьев, в пазухах которых находятся пазушные почки. После отделения этих дочерних растений от материнского куста они служат посадочным материалом для закладки новой плантации земляники.

Одно материнское растение сорта Фестивальная в среднем образует 70, а сорта Ранняя Махерауха - 50 дочерних розеток (Воронина, 1987).

На второй и последующие годы материнское растение сохраняет способность давать новые усы и развивать из пазушных почек рожки.

Однолетнее растение земляники за период вегетации развивает в среднем 2…3 рожка, двухлетнее - 5…9, трехлетнее - 8…16 (Воронина, 1987).

В дальнейшее происходит старение материнского куста, и образование новых рожков и усов сильно сокращается.

1.2 Болезни

Ряд серьезных паразитов может вызвать заболевание земляники. Патогены, которые поражают землянику, включают грибы, нематоды, вирусы и микоплазмы. Земляника свободна от бактериальных заболеваний, кроме угловатой пятнистости, вызываемой Xantomonas fragariae, которая возникает только из-за длительно влажной погоды.

Грибные болезни листа, верхушки, сосудистой системы, корней и ягод присутствуют везде, где выращивается земляника. Их возникновение может быть усилено или ограничено предшествующей историей культуры или территории и окружающих условий, а также возделывание и уборка могут влиять на их развитие и степень. Более чем 100 видов грибов могут поражать землянику, но только около одной трети вызывают серьезные повреждения.

Наиболее важные и широко распространенные из этих болезней - это почвенные болезни, такие как красная сердцевинная гниль, вызываемая Phytophthora fragariae, вертициллезное увядание (Verticillium alboatrum). А также болезни листьев, такие как мучнистые росы (Sphaerotheca macularis) и болезни ягод, такие как серая гниль (Botrytis cinerea) могут вызвать серьезные проблемы на полях земляники.

Контроль за почвенными грибами зависит в большой степени от фумигации почвы, и от использования устойчивых сортов.

Некоторые нематоды поражают землянику, вызывая повреждение листьев, стеблей и корней и действуя как входные ворота для вирусов. Нематоды обитают в почве и распространяются пассивно с одной зараженной территории на близлежащие посадки при помощи ветра, затоплений, механических средств и животных. Однажды попав на растения, нематоды очень трудно и затратно истребляются химическими методами борьбы.

Много различных вирусов поражает промышленные посадки земляники, где они быстро распространяются при помощи тли и нематод. В различных комбинациях они вызывают пожелтение, морщинистость и пятнистость листьев, сильное изменение растения и уменьшение урожая и ухудшение качества ягод. Однако присутствие одного вируса на землянике обычно протекает бессимптомно.

Микоплазменные болезни разносят насекомые и они вызывают пожелтение, часто охватывая деформацию цветков и ягод, позеленение лепестков. Насекомые и клещи также создают проблемы на земляничных полях.

Контроль за болезнями земляники базируется на четырех факторах: генетическая устойчивость, свободный от патогенов растительный материал, химические методы борьбы с вредителями и оздоровление.

Термотерапия, устраняющая вирусы, применялась долгое время, но некоторые вирусы являются термоустойчивыми и могут быть устранены только с помощью культуры меристем с использованием термотерапии или без нее.

На многих территориях, где выращивается земляника была установлена программа по контролю и сертификации посадочного материала.

1.3 Возбудители, требующие проверки на землянике для категорий "безвирусный" и "протестированный на вирусы" посадочный материал

Безвирусный посадочный материал:

1.Рабдовирус морщинистости земляники (Strawberry crincle rhabdovirus);

2.Вирус слабого пожелтения краев жилок (Strawberry mild yellow-edge virus);

3.Вирус крапчатости земляники (Strawberry mottle virus);

4.Каулимовирус окаймления жилок земляники (Strawberry vein-banding caulimovirus);

5.Неповирус мозаики резухи (Arabis mosaic nepovirus);

6.Неповирус кольцевой пятнистости малины (Raspberry ringspot nepovirus);

7.Неповирус латентной кольцевой пятнистости земляники (Strawberry latent ringspot nepovirus);

8.Неповирус черной кольчатости томата (Tomato black ring- nepovirus);

9.Фитоплазма позеленения лепестков земляники (Strawberry green petal phytoplasma).

Протестированный на вирусы посадочный материал:

1.Рабдовирус морщинистости земляники;

2. Неповирус мозаики резухи

3. Неповирус кольцевой пятнистости малины

4. Неповирус латентной кольцевой пятнистости земляники

5. Неповирус черной кольчатости томата

6.Вирус крапчатости земляники.

Протестированный на вирусы посадочный материал должен быть также свободен от симптомов других вирусных и вирусоподобных заболеваний на протяжении не менее 2 лет наблюдений.

Растения обеих категорий должны также быть свободны от заражений стеблевой нематодой, земляничной нематодой, хризантемной нематодой, рисовым афеленхоидом, земляничным прозрачным клещом, возбудителями фитофтороза, антракноза и вертициллеза.

Растения, импортируемые из-за пределов Европы, должны также быть протестированы на наличие дополнительной группы патогенов.

1.4 Оздоровление растений земляники от вирусов и других патогенов

Методы оздоровления:

Применение и использование свободных от вирусов растений, полученных методом индекации.

Термотерапия - выдерживание растений земляники в течение трех недель при температуре + 37 - 38 градусов, относительной влажности 70 - 80% и освещенности 6 - 8 тыс. люкс при 16-ти часовом фотопериоде.

Хемотерапия - применение различных химических веществ, в том числе антивирусных препаратов (АВП).

Культивирование изолированных меристем, а также весь комплекс перечисленных мероприятий.

Для оздоровления растений земляники от вирусов наиболее целесообразно использовать сочетание методов суховоздушной термотерапии (37-38 градусов на протяжении 30-40 дней) и культуры in vitro (меристемы величиной 0,1-0,3 мм из почек или кончиков усов).

Культура in vitro при величине инициального экспланта не более 0,5 мм позволяет также получать регенеранты, свободные от нематод, земляничного прозрачного клеща, грибных и бактериальных возбудителей болезней.

Растения, получаемые в результате термотерапии или культуры in vitro, следует рассматривать в качестве кандидатов в базисные клоны и в обязательном порядке подвергать последующему тестированию.

1.5 Производство посадочного материала земляники

Посадочный материал земляники получают на специальных маточных плантациях, которые закладывают в защищенном грунте по определенной схеме на почвенном субстрате. Более же перспективным и отвечающим фитосанитарным требованиям является метод размножения земляники в вертикальной культуре, при котором исходные растения высаживают в контейнеры, установленные на стеллажах. В этом случае культуру вести более удобно и намного больший коэффициент размножения с единицы площади.

Закладка маточников в открытом грунте в настоящее время производится очень редко, так как не отвечает общим требованиям к качеству посадочного материала. Исключением является необходимость закладки подобного рода маточников для получения внесезонного урожая на промышленных плантациях.

На плодовой станции ТСХА землянику высших категорий качества получают в вертикальной культуре, при которой материнские растения высаживают в почвенный субстрат в пластиковые контейнеры, установленные на стеллажах на высоте 120 см от поверхности пола.

1.6 Микроклональное размножение земляники

Клональным микроразмножением называется массовое бесполое размножение растений в культуре тканей и клеток, при котором возникшие формы растений должны быть генетически идентичны исходному экземпляру. Икроклональное размножение - это своего рода черенкование, проводимое в специфических, стерильных условиях.

Существующие способы размножения растений in vitro можно подразделить на следующие:

получение растений из дифференцированных тканей (листьев, побегов) без стадии образования каллуса

получение каллуса и регенерация из него побегов

получение каллуса, превращение его в суспензию клеток, регенерация из клеток растений по типу зиготического зародыша (искусственного семени)

получение растений через активацию к росту существующих на экспланте боковых почек и последующего их укоренения.

Наибольшее распространение в практике получил четвертый способ. Этот метод уже стал промышленным при производстве посадочного материала некоторых культур, и является в настоящее время наиболее надежным в отношении размножения плодовых, ягодных и декоративных культур.

Теоретическая возможность такого способа составляет приблизительно 100 тыс.- 1 млн. побегов в год, при условии, что за два месяца можно получить один побег, дающий 10 микрочеренков (Деменко, 1997).

1.7 Культура меристем для оздоровления (из истории)

В 1962 году Белкенгем и Миллер предложили устранение латентного А вируса земляники при помощи культуры меристем, и заметили, что успех размножения апикальных меристем был прямо пропорционален размеру экспланта, в то время как шансы получения безвирусного материала были очевидно обратно пропорциональны размеру посаженной (извлеченной) ткани.

Adams в 1972 году доложил о возможности получения большого количества ростков земляники из культуры меристем или кончиков побегов, культивируемых in vitro, а Nishi и Oosawa (1973) - из меристем каллюса.

В 1974 году Boxus установил, что быстрое размножение растений, свободных от вирусов, in vitro, может применяться в промышленности и описал технологию, которая дает возможность избегать мутаций. С тех пор интерес к микроклональному размножению земляники увеличился, и этот метод используют по всему миру.

Белкенгем и Миллер (1962) установили, что термотерапия позволяет получать безвирусный материал из меристем большего размера.

Как отмечается в нескольких работах, размер экспланта в сочетании с термотерапией является ключевым фактором в получении безвирусного материала. Продолжительность термотерапии влияет на устранение латентного С вируса из верхушек усов различной длины, но не оказывает влияния на вирус морщинистости.

Также термотерапия оказалась полезной для борьбы с вирусами при использовании мелких меристем. Свободные от вирусов растения были получены также и без использования термотерапии (но в этом случае размер экспланта должен быть менее 0,5 мм).

Из меристем размером 0,5 мм были получены растения земляники свободные от Phytophthora cactorum, также Меркле доложил об устранении Phytophthora fragariae из меристем.

В Италии для производства безвирусных меристем размером 0,5-0,7 мм их вырезают из побегов растений прошедших термотерапию.

Безвирусные растения могут сохраняться в защищенных условиях в течение нескольких лет.

Работы по микроклональному размножению земляники ведутся также и в России, Молдавии, Польше и других странах. Этот метод широко используется в странах Европы, постепенно замещая традиционный.

1.8 Факторы, влияющие на рост меристем

1.8.1 Выбор растений-доноров

Выбор растений-доноров и времени извлечения меристем являются важными факторами. Меристемы извлеченные после термотерапии растут быстрее и с большим процентом приживаемости, чем меристемы с растений не прошедших термотерапию. Не имеет значения, извлечена ли меристема из апикальной или латеральной почки, но предпочтительнее почка, взятая с уса, как более легко извлекаемые.

Экспланты берутся предпочтительно весной или летом, так как в течение осени и зимы результаты сильно искажаются бактериями и грибками (Мартинелли, 1992).

1.8.2 Питательные среды

В основе размножения растений in vitro лежат законы биологии: тотипатентность клеток, апикальное доминирование, регенерация. Все эти понятия предусматривают создание специальных условий с целью получения целостного растения, либо восстановления недостающей части. Наиболее важным условием является питательная среда, на которой могут проявиться вышеуказанные явления в желательном направлении.

Состав любой питательной среды можно подразделить на неорганический, органический и природный комплексы. Неорганический комплекс делится на макро- и микро- элементы.

К макроэлементам в культуре ткани относят: азот, фосфор, калий, кальций, магний, натрий, железо; к микроэлементам - марганец, бор, цинк, йод, молибден, медь, кобальт.

Органический комплекс представлен: витаминами - тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота, аскорбиновая кислота, мезоинозит, рибофлавин, патентенат кальция, фолиевая кислота, биотин; аминокислотами - гликокол, сульфат аденин, гидролезат казеина; регуляторами роста - ауксины (ИУК, ИМК, НУК,2,4-Д), вещества, обладающие ауксиновой активностью (мивал, крезацин), цитокинины (кинетин, 6-БАП, зеатин, 2-изопентил, карталин, дропп, тидизурон); гиббереллины (ГА-3, ГА-4…7); углеводами (сахароза, глюкоза, фруктоза, сорбит); ретардантами (ССС, АБК, РР 333), агаром (бакто-, дивко-агар, гельрайт); фенолами (флороглюцин, хлорогеновая кислота, кумарин).

Состав некоторых сред представлен 30 и более компонентами. Однако, точный состав питательной среды должен быть подобран в зависимости от потребностей разных сортов, а некоторые группы сортов требуют дополнительных добавок для обеспечения достаточно хорошего роста. Обычно питательную среду делают твердой, добавляя агар (0,7-1,0 % массы к объему).

Наибольшее распространение получила среда на основе минеральных солей по Мурасиге-Скугу, обогащенная витаминами, сахарозой и регуляторами роста. Хорошие результаты были получены при использовании сред Ли и де Фоссарда, а также Гамборга. pH используемой среды колеблется от 5,2 до 6; как правило, рН среды 5,6-5,8.

Свободные от вирусов растеньица могут быть получены из меристем выращенных без регуляторов роста, добавление растительных гормонов, и главным образом бензиладенина в количестве 0,1-1мг/л и ауксина, увеличивает количество меристем, которые дают новые растеньица (Martinelli, 1992).

На этапе укоренения практикуется использование менее богатых сред. Укоренение побегов увеличивается, если использовать половинную по макросолям среду МС, однако среда 3/4 МС дает растения лучшего качества (Деменко, 1997). В качестве индукторов ризогенеза хорошо зарекомендовали себя бетта-индолилмасляная, бетта-индолилуксусная, и альфа-нафтилуксусная кислоты. Введение этих препаратов в питательную среду для укоренения является технологическим приемом. Однако их присутствие положительно сказывается на первых этапах ризогенеза, а для развития корневой системы бесполезно или даже вредно. Поэтому при укоренение используют кратковременное замачивание базальных участков побегов в водных растворахпрепаратов с ауксиновой активностью (ИМК) с последующим помещением их на среды без регуляторов роста или обработку пудрой с ауксинами.

На этапе акклиматизации пробирочных растений наиболее эффективным оказалось использование пластиковых индивидуальных контейнеров, заполненных стерильным субстратом, обогащенным минеральными компонентами питания. Это позволяет довести приживаемость до 90-95 % (Высоцкий, 1989).

1.8.3 Условия освещения и температура

Для микропобегов, культивируемых на среде, содержащей сахарозу, не нужен вовсе или нужен слабый фотосинтез, однако определенное освещение - необходимый фактор для морфогенеза и образования хлорофилла. В качестве источников света обычно используют люминесцентные лампы освещения 1000-5000 люкс. Существуют разные мнения касательно оптимальных условий освещения и температуры, однако по имеющимся данным, эти факторы имеют немаловажное значение.

Мурасиге (Мурасиге, 1977) обнаружил, что оптимум освещенности у большинства травянистых растений, в том числе и у земляники лежит в области 1000 люкс. Низкая освещенность, примерно 300 люкс, а также слишком высокая (около 3000-10000 люкс), сильно подавляют рост.

Некоторые исследователи полагают (Высоцкий,1989), что условия при 22-27 градусах, освещенности 3-5 тыс. люкс и световом дне продолжительностью 16 часов обеспечивают нормальное развитие эксплантов.

Температура камеры также влияет на результаты культивирования. Адамс (1972) использовал температуру 25 градусов, Боксус (1977) получил наилучшие результаты при 24 градусах, в то время как Муллин и др. (1974) культивировал при 27 градусах. С другой стороны, Ван Хоф (1974) получил лучшие результаты при 20 градусах.

Джонс (1987) доложил, что регенеранты сорта земляники Остара дали заметно больше усов при размножении с 16-ти часовым фотопериодом при 22 градусах, чем при 12-часовом фотопериоде при 18 градусах. Влияние светового и температурного режима на сорта нейтрального дня замечено не было.

Ничши и Оосава (1973) предлагали культивировать меристемы при 25 градусах, относительной влажности 75%, освещенности 3000 люкс при 12-ти часовом дне. Абраменко и др. (1984) предлагали 16-ти часовой фотопериод, освещенность 3000 люкс при 22-25 градусах.

Были попытки использовать свет разной интенсивности и различные температурные режимы и обнаружилось, что максимальный рост эксплантов происходит при 28 градусах и 4000 люкс, более лучший рост побегов при 6000 люкс и лучшее укоренение - при 7000 люкс. (Hunter et al. 1983).

Таким образом, имеющиеся данные очень разнообразны и варьируют в достаточно больших пределах. Но по-видимому, следует выделить как наиболее подходящие условия для роста и развития меристем температуру в пределах 20-25 градусов, освещенность 1000-2000 люкс и 16-ти часовой фотопериод.

1.9 Тестирование материала

Особо хотелось бы остановиться на необходимости тестирования материала после процессов оздоровления. Иногда приходится сталкиваться с мнением, что культура тканей - надежный метод оздоровления и тестировать растения, полученные in vitro, не обязательно. Это в корне ошибочно. Хотя эффективность оздоровления в сочетании методов термотерапии и культуры изолированных меристем может достигать для определенных вирусов практически 100 %, материал можно считать безвирусным только после проведенного тестирования по общепринятым методикам. Не следует забывать, что оздоровление (любым методом) носит вероятностный характер и всегда есть риск получить зараженный материал. Вообще при возрастании коэффициентов размножения, интенсификации производства посадочного материала вопросам тестирования должно отводиться одно из главных мест. Достаточно сказать, что потомство одного пробирочного растения земляники будет занимать на плодоносящих плантациях площадь от 12 до 40 га (Высоцкий, 1988).

1.10 Этапы микроклонального размножения

Микроклональное размножение состоит из следующих этапов:

Инициация культуры in vitro и ее стабилизация. Этот этап включает в себя:

*выбор маточных растений;

*поверхностную стерилизацию отобранного материала;

*вычленение экспланта и его посадка на питательную среду в пробирку;

*культивирование экспланта в климатической комнате;

2. Размножение in vitro, состоящее из одного или нескольких пассажей, сопровождаемых разделением получаемых конгломератов растеньиц.

3. Укоренение in vitro или in vivo.

4. Адаптация растений к естественным условиям - сначала в теплице, а затем в поле.

1.10.1 Инициация культуры in vitro

Для подготовки введения в культуру собранные розетки промывают проточной водой, затем с помощью скальпеля отрезают листья и корни. Выделенный растительный материал складывают в стерильные чашки Петри или колбы с крышкой для дальнейшей стерилизации.

Выделение эксплантов проводится в ламинаре на стерильных листах бумаги под бинокулярным микроскопом.

В качестве эксплантов могут использоваться меристемные апексы, выделенные из дочерних розеток или верхушек плетей, при этом не наблюдается различий в поведении экспланта при дальнейшем культивировании в зависимости от происхождения экспланта. Отбор может проводиться в течение всего вегетационного периода, а при необходимости даже осенью и зимой. Однако лучшие результаты достигаются при инициации культуры весной (апрель, май). При введении в культуру эксплантов из растений, собранных осенью или зимой, наблюдается повышение уровня инфицирования эксплантов.

Наблюдается обратная зависимость между размерами экспланта и процентом оздоровленных от вирусов растений. Для получения оздоровленных растений необходимо, чтобы размер экспланта не превышал 0,4 мм, однако с уменьшением его размера понижается эффективность первого этапа культивирования, так как выживает меньшее количество меристем. При размножении здоровыз растений размеры экспланта могут быть больше, это сокращает время стабилизации культуры in vitro.

На различных этапах размножения земляники садовой in vitro используют различные модификации питательных сред. Состав среды зависит от культивируемого сорта.

После помещения на питательную среду меристемные клетки начинают делиться и после 2-3 недель культивирования наблюдаются зачатки побегов. Через 3-4 недели культивирования экспланты переносят на среду для размножения.

1.10.2 Этап размножения in vitro

Обычно состоит из нескольких пассажей. После того, как образуется конгломерат растеньиц, он разделяется на одиночные микророзетки и они помещаются на свежую питательную среду. При увеличении числа пересадок можно получить большее количество растений из одного экспланта, однако при этом возрастает риск появления сомаклональных мутаций, поэтому количество пассажей ограничивают 12.

На втором этапе микроразмножения в среду добавляют фитогормоны: 6-бензиладенин (ВА), ИМК и гибберелловая кислота (ГК).

1.10.3 Этап укоренения in vitro

Земляника садовая обычно хорошо укореняется, корни могут начать формироваться на среде для размножения. Обычно после культивирования на среде для размножения в одной пробирке находятся и хорошо развитые, и отстающие в росте растеньица. Маленькие розетки (до 1 см в высоту) используют для дальнейшего микроразмножения, а регенеранты высотой более 1 см предназначаются для пересадки на среду для укоренения.

Обычно на этапе укоренения используется среда без фитогормонов. Лучшие результаты получены на среде Мурасиге-Скуга с половинной концентрацией макро- и микросолей. Использование половинной концентрации солей позволяет получить растения с большим количеством корней и более развитой корневой системой, чем на среде с обычной концентрацией солей.

1.10.4 Этап адаптации ex vitro

После перенесения укорененной микророзетки из пробирки в субстрат необходимо создать условия для адаптации растений. Адаптация регенерантов земляники обычно проводится в два этапа: первый этап - в климатической комнате, второй - в теплице, где происходит и вегетативное размножение полученных маточных растений.

Укорененные растения достают из пробирок, промывают и высаживают в ящики или пластиковые горшки. В качестве субстрата можно использовать смесь торфа с песком или перлитом.

Высаженные растения накрывают полиэтиленовой пленкой для создания влажной камеры. Через 1-2 недели пленку сначала приподнимают, затем снимают. После доращивания при температуре +20 +30 градусов и 16-часовом фотопериоде розетки высотой 5-7 см и более высаживают в теплицу. При наличии хорошо оборудованной теплицы с регулируемым микроклиматом, пересаженные в субстрат регенеранты можно сразу переносить в теплицу, минуя культивирование в климатической комнате.

1.10.5 Депонирование in vitro

Для создания коллекции растений in vitro, а также для удобства работы возможно длительное хранение пробирочных растений без ежемесячной пересадки. Растения сохраняются в бытовом холодильнике при +4 градусах. Пробирки упаковываются в полиэтиленовые пакеты или обматываются пленкой для уменьшения испарения.

такая схема культивирования растений-регенерантов позволяет поддерживать в культуре in vitro большее количество сортов. Хранящиеся при низких температурах растения в любой момент могут быть использованы для обычного культивирования и размножения in vitro.

1.11 Качество растений, размножаемых in vitro

Существует много причин, по которым растения, размножаемые методом культуры тканей, не всегда аналогичны исходным. Их можно отнести к двум категориям:

1.Кратковременные изменения в развитии, так называемые эпигенетические эффекты;

2.Генетические изменения, возникающие в результате генных или хромосомных мутаций.

Эпигенетические изменения. Регенеранты, образованные in vitro, после высадки в грунт могут преодолеть влияние условий культивирования на их последующий рост. Небольшое число первых листьев может иметь неправильную форму или слишком рано увядать, что имеет важное значение.

При повреждении апикальной части нарушения могут быть более долговременными и представлять собой, например, повышенное ветвление или изменение расположения листьев. При микроклональном размножении земляники в течение двух лет после высадки в грунт наблюдали увеличение числа розеток и нарушения во взаимном расположении листьев, в результате чего растения выглядели низкорослыми и ветвистыми (Anderson, 1982).

После удаления стеблевого апекса обнаруживали множество точек роста, расположенных линейно или случайно по окружности. Явление усиливалось при повышении концентрации БАП, но подавлялось гиббереллином (ГК3). Авторы пришли к заключению, что этих нарушений можно избежать, используя соответствующие концентрации гормонов и сохраняя при этом достаточно высокие скорости размножения.

Генетические изменения. Спонтанные мутации неизбежно происходят во всех культурных растениях. Большинство таких изменений не желательно.

При обычном размножении легко выявить растение, в котором произошла мутация. В культурной пробирке, однако, мутантные побеги могут остаться неузнанными.

Изменение таких признаков как форма листьев, окраска цветка или качество плодов, могут быть выявлены лишь после того как побег посажен в грунт и выращен. Поэтому возникающие при размножении in vitro спонтанные мутации могут остаться незамеченными. Чем раньше в процессе нарастания культурной массы произойдет мутация, тем выше будет содержание мутантных побегов.

Частота появления изменений может существенно колебаться в зависимости от их типа (цит. по Swartzu Lindst, Rom 1986):

Частота появления изменений на землянике в зависимости от их типов

Тип отклонения	Частота отклонений, %
Хлоротический сектор	0,03-7,0
Белая штриховатость листьев	1,00-8,40
Многовершковость	2,00-5,00
Карликовость	1,20

Для снижения частоты появления в процессе клонального микроразмножения измененных форм и их своевременного выявления следует: использовать модель размножения на основе пролиферации пазушных меристем; избегать применения сред, стимулирующих образование каллусной ткани; в прцессе культивирования удалять все почки каллусного или адвентивного происхождения; вести размножение по отдельным мериклонам для облегчения контроля за происхождением растений; регулярно обновлять исходные культуры; после микроразмножения земляники использовать традиционные способы получения потомства (одно - двух поколений) для закладки промышленных плантации; регулярно проверять на плодоношение выборочные экземпляры отдельных мериклонов (Высоцкий, 1995).

2. Экспериментальная часть

2.1 Цели и задачи исследования

Целью данной работы является разработка метода укоренения микрорастений сортов земляники садовой ex vitro, то есть в нестерильных условиях. В связи с этим ставятся следующие задачи:

1. Оценить сорта земляники по способности к микроразмножению.

2. Подобрать оптимальные концентрации ИМК для индукции ризогененза микрочеренков у изучаемых сортов.

3. Сравнить растения земляники, укорененные двумя способами: ex vitro и in vitro по морфологическим характеристикам (количество и длина корней, высота побега, количество листьев) и их укореняемости.

4. Определить экономическую эффективность укоренения микропобегов земляники садовой ex vitro.

2.2 Материалы и методы

Объектами исследования служили сорта земляники садовой Королева Елизавета, Трибьют и Маковка.

Место проведения исследований: лаборатория плодоводства МСХА. Адаптацию проводили в зимних остекленных теплицах. Время проведения исследований: весна 2005 года.

Культуры помещали в световую комнату с интенсивностью света 2000 люкс, температурой 24 градуса и 16-ти часовым фотопериодом.

Для исследования использовали полученные ранее меристемные культуры земляники садовой вышеуказанных сортов. Растения были размножены на среде по прописи Мурасиге-Скуга (табл. ). Для снятия апикального доминирования использовали БАП в концентрации 0,4 мг/л.

Табл. 1. Состав питательной среды по прописи Мурасиге-Скуга.

Состав	Концентрация, мг/л
NH4NO3	1650
KNO3	1900
CaCl2*2H2O	440
MgSO4*7H2O	370
KH2PO4	170
H3BO3	6,2
MnSO4*4H2O	22,3
CoCl2*6H2O	0,025
CuSO4*5H2O	0,025
ZnSO4*7H2O	8,6
Na2MoO4*2H2O	0,25
FeSO4*7H2O	27,8
Na2 ЕДТА	37,3
КУ	0,83
Ca(NO3)2*4H2O, г/л	-
NaH2PO4	-
Na2SO4	-
Сахароза, г/л	30
Тиамин	0,5
Никотиновая кислота	0,5
Пиридоксин	0,5
Глицин	-
Инозит	100
Агар, г/л	5…8 (7)

Часть размноженных растений была высажена на питательную среду для укоренения in vitro, а часть была высажена для укоренения ex vitro. Растения для обоих вариантов высаживались одновременно. Свет и температура были такие же, как и во время пролиферации.

Для эксперимента были отобраны растеньица похожие по размерам и морфологии, имеющие не менее 4-5 листьев, с длиной черешка не менее 1,5 см. Укоренение in vitro проводили на 1/2 МС. На стадии укоренения в качестве индуктора ризогенеза in vitro использовали ИМК в концентрации 0,7 мг/л.

Растения, укореняемые ex vitro, предварительно замачивали в растворе ауксина. Использовали растворы различной концентрации: 2 мг/л и 5 мг/л ИМК. Продолжительность обработки составила 7 часов. Затем растения были высажены в теплицу в кассеты размером 60х60 мм. Субстрат состоял из смеси верхового торфа и перлита в соотношении 1:1. Кассеты помещались в условия влажной камеры. Световой и температурный режим были аналогичны таковым в световой комнате (интенсивность света 3000 люкс, температура 24 градуса и 16-ти часовой фотопериод).

Данные снимались по истечении 4 недель в условиях in vitro и в теплице. Учитывали высоту побега, количество листьев и длину черешков побега, количество и длину корней. Объем каждого варианта составлял 20 растеньиц. Статистическую обработку данных проводили методом дисперсионного анализа с использование программного комплекса STRAZ.

2.3 Приготовление питательных сред

С целью облегчения приготовления питательных сред необходимо иметь маточные растворы, составляющие среду. Суть приготовления маточного раствора заключается в том, чтобы, взяв из него определенный объем, приготовить определенный объем питательной среды.

Соли в маточном растворе могут вступать в реакцию, поэтому маточный раствор хранят в нескольких сосудах:

1-NH4NO3, KNO3, KH2PO4, MgSO4*7H2O

2- CaCl2*2H2O

3- Ca(NO3)2*4H2O

4- FeSO4* Na2 ЕДТА

5- MnSO4*4H2O, ZnSO4*7H2O, H3BO3, КУ, Na2MoO4*2H2O, CuSO4*5H2O, CoCl2*6H2O.

Витамины и регуляторы роста хранят в отдельных сосудах.

Концентрации маточных растворов составляют из такого расчета, что для приготовления 1 л среды необходимо взять: макроэлементов - 100 мл, кальция - 100 мл, микроэлементов, хелата железа - 10 мл, витаминов и регуляторов роста - 1 мл маточного раствора. Маточные растворы и питательные среды готовят на бидистиллированной воде. Все вещества,входящие в состав среды, растворяют в воде, за исключением регуляторов роста. Цитокинины растворяют в 0,1 н растворе соляной кислоты, ауксины - в капле спирта. Маточные растворы хранят в холодильнике, их объем должен быть таков, чтобы израсходовать за месяц.

Для приготовления 1 л жидкой среды в колбу объемом 1л пипеткой переносили необходимое количество каждого из исходных растворов.

На электроплитке кипятили дистиллированную воду и добавляли в нее агар при постоянном помешивании. Раствор кипятили до полного растворения агара, затем разбавляли холодной дистиллированной водой и переносили в основную колбу. Объем доводили до 1л и измеряли рН среды.

Готовую среду разливали по баночкам из расчета 1 л среды на 30 баночек. Баночки закупоривали и автоклавировали при 1 атм 18 минут.

2.4 Объекты исследования

Трибьют.

Сорт ремонтантный крупноплодный.

Выведен в США в 1981 году. Урожайность 1,0-1,4 кг/м. кв.

Ягоды массой от 10 до 20 г, красные, со слабым блеском, конические, с небольшой шейкой. Семянки желтые, под кожицей.

Мякоть розовая, средней плотности, кисло-сладкая, с ароматом.

Куст среднерослый, полураскидистый, рыхлый, средне облиственный.

Листья средние, темно-зеленые, матовые, доли удлиненно-овальные, гладкие, слегка вогнутые; зубчики куполовидные, плоские; прилистники небольшие, зеленые, средней ширины.

Цветоносы длинные, средней толщины, опушены прижатыми волосками; соцветия многоцветковые, раскидистые, цветоножки длинные, тонкие; на уровне листьев и ниже.

Цветки средние, обоеполые; лепестки белые, слабоизогнутые; чашелистики узкие, расположены в два ряда.

Сорт средней зимостойкости, устойчив к увяданию и мучнистой росе, в средней степени поражается серой гнилью.

Коэффициент размножения средний.

Маковка.

Сорт получен от скрещивания сортов Фестивальная *Робинзон.

Позднего срока созревания. Куст мощный, компактный. Побегообразовательная способность средняя.

Ягоды крупные, темно-красные, кисло-сладкого вкуса. Мякоть ягоды средней плотности.

Урожайность 200-250 ц/га.

Устойчив к гнилям плодов и гнилям корней.

Королева Елизавета.

Новый ремонтантный сорт.

По своим качествам легко составит конкуренцию лучшим западным ремонтантным сортам.

Ягоды очень крупные, отдельные до 100 г, ярко-красного цвета, с плотной мякотью. Плотная мякоть дает возможность перевозить землянику на большие расстояния, хранить, и, перерабатывая, получать качественные продукты, так как ягоды не развариваются.

Цветение с мая по октябрь. Плодоношение происходит в три волны.

Урожайность 10 кг/м.кв. Плодоношение в год посадки.

2.5 Результаты исследования

Микропобеги помещали на питательную среду для пролиферации по 5-6 шт в стеклянный сосуд объемом 200 мл. В течение 5-6 недель культивирования образовались конгломераты микропобегов. Коэффициент размножения варьировал от 2,7 до 6,2 в зависимости от сорта. Высота побегов колебалась от 3,5 до 3,9 в зависимости от сорта. По окончании пассажа конгломераты извлекли из сосудов и разделили на отдельные микропобеги в условиях ламинар-бокса. На стадии пролиферации учитывались следующие показатели: количество дополнительных побегов на эксплант, высота побега, количество листьев на побег (табл. ).

Табл.2. Основные показатели развития микрорастений земляники садовой изучаемых сортов на этапе пролиферации.

Сорт	Питательная среда	БАП, мг/л	Средняя длина побега, см	Среднее количество побегов на эксплант, шт	Среднее число листьев на побег, шт
Королева Елизавета	Мурасиге-Скуга	0,4	3,5	2,7	3,7
Трибьют	Мурасиге-Скуга	0,4	3,9	6,2	,8
Маковка	Мурасиге-Скуга	0,4	3,6	5,8	4,4

В результате проведенных исследований было выяснено, что из трех изучаемых сортов земляники садовой Трибьют отличается самым высоким коэффициентом размножения (6,2), а также является лучшим по другим двум показателям (длине побега и количеству листьев на эксплант).

Что касается укореняемости данных сортов, то существенных различий по сортам не замечено. Способ укоренения оказал существенное влияние на укореняемость данных сортов. Укореняемость в условиях ex vitro оказалась в среднем на 25% ниже, чем в условиях in vitro. Однако стоит отметить, что растения, полученные при ex vitro укоренении, являются уже адаптированными к нестерильным условиям и в данном случае процент укореняемости является также процентом приживаемости.

Предварительная обработка ИМК ex vitro укореняемых растений, стимулировала образование и развитие корневой системы, обеспечивая процент укоренения 77-82% в зависимости от сорта, тогда как укореняемость контрольных растений составила 60-65%.

Концентрация ауксина на результаты значительно не повлияла (табл. 3).

Табл.3.Укореняемость микрорастений при двух способах укоренения.

Способ укоренения	Сорт	Концентрация ИМК, мг/л	Укореняемость, %
ex vitro	Королева Елизавета, Трибьют, Маковка	2 5 контр 2 5 контр 2 5 контр	77 78 60 80 82 65 79 80 64
in vitro	Королева Елизавета, Трибьют, Маковка	1 1 1	100 100 100

В ходе эксперимента было установлено, что обработка микропобегов сорта Королева Елизавета перед посадкой на укоренение ex vitro раствором ИМК, существенно повлияла на количество листьев, количество корней и длину корней.

Микропобеги, обработанные раствором ИМК дали лучшие результаты по перечисленным показателям по сравнению с контролем, на котором обработка не проводилась: количество корней оказалось в 1,5 раза больше, чем в контроле, а средняя длина корней в 1,6 раз больше. По показателям количество листьев, длина и количество корней отличие от контроля было достоверно.

Длина черешка не зависела от концентрации ИМК, но была чуть ниже контроля.

Разная концентрация ИМК (2 и 5 мг/л) на приведенные показатели значительно не повлияла. (табл. ).

Табл.4. Влияние предварительной обработки ИМК на параметры развития растений земляники сорта Королева Елизавета во время адаптации.

Метод укоренения	Вариант обработки	Средние значения показателей
		Количество листьев, шт	Длина черешка, см	Количество корней, шт	Длина корней, см
ex vitro	ИМК 2 мг/л ИМК 5 мг/л Контроль (без обработки)	5,6* 5,4* 4,6*	3,6 3,7 3,9	4,6* 4,8* 3,2	23,4* 23,9* 14,7
НСР 0,05	-	0,661	0,506	0,858	8,429

Что касается сорта Маковка, то обработка раствором ИМК также оказала положительное влияние на количество листьев, количество корней и длину корней по сравнению с контролем. Различия по данным показателям существенны.

Обработка ИМК в концентрации 2 мг/л дала немного лучшие результаты по количеству листьев и длине корней по сравнению с ИМК 5 мг/л, но количество корней при обработке ИМК 2 мг/л было несколько меньше, чем при обработке ИМК 5 мг/л. По показателю средней длины корней, корни обработанные ИМК в концентрации 2 мг/л в 2 раза превосходят контрольный вариант. Средняя длина черешка при обработке ИМК 2 мг/л оказалась такой же, как в контроле, а при обработке ИМК 5 мг/л несколько меньше контроля.(табл.).

Табл.5. Влияние предварительной обработки ИМК на параметры развития растений земляники сорта Маковка во время адаптации.

Метод укоренения	Вариант обработки	Средние значения показателей
		Количество листьев, шт	Длина черешка, см	Количество корней, шт	Длина корней, см
ex vitro	ИМК 2 мг/л ИМК 5 мг/л Контроль (без обработки)	4,75* 4,3* 3,5	4,1 3,6 4,1	4,5* 4,9* 3,6	15,6* 13,54* 7,9
НСР 0,05	-	0,770	0,730	0,910	5,123

Влияние предварительной обработки раствором ИМК на развитие сорта Трибьют на стадии ризогенеза ex vitro тоже оказалось положительным в отношении количества и длины корней по сравнению с контролем. Превышения по этим показателям существенны по отношению к контролю на обоих концентрациях ИМК. На концентрации ИМК 2 мг/л превышение по длине корней было в 2,5 раза, а на концентрации ИМК 5 мг/л - в 2раза. По количеству корней превышение контроля было в 1,5 раза и в 1,6 раза соответственно. На количество листьев и длину черешка существенного влияния обработка не оказала.

Табл.6. Влияние предварительной обработки ИМК на параметры развития растений земляники сорта Трибьют во время адаптации.

Метод укоренения	Вариант обработки	Средние значения показателей
		Количество листьев, шт	Длина черешка, см	Количество корней, шт	Длина корней, см
ex vitro	ИМК 2 мг/л ИМК 5 мг/л Контроль (без обработки)	4,6 4,95 4,7	3,6 3,9 4,1	4,1* 4,6* 2,8	12,94* 10,3* 5,1
НСР 0,05	-	0,812	0,989	0,815	2,83

В результате проведенных исследований и сравнения двух способов укоренения было выявлено, что результаты укоренения ex vitro сорта Королева Елизавета по основным показателям ( количеству и длине корней) не уступают таковым в укоренение in vitro, а длина корней ex vitro растений даже превышает длину корней in vitro растений в 1,5 раза. По данному сорту наблюдалось также увеличение количества листьев. Оно в 1,4 раза превосходило количество листьев у in vitro укоренных растений.