Диагностика вирусных инфекций крупного рогатого скота

Размещено на http://www.allbest.ru/

Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота наносят огромный экономический ущерб промышленному скотоводству. Наиболее часто этиологическую роль в возникновении данной патологии играют вирусы, содержащие в своем составе РНК: респираторно-синцитиальная инфекция, Она способна вызывать поражение респираторного тракта и лимфоидной системы восприимчивых животных.

При планировании профилактических мероприятий большая роль принадлежит оперативной и точной лабораторной диагностике, направленной на расшифровку этиологической структуры конкретной вспышки респираторных болезней и выяснения этиологической роли каждого инфекционного агента.

Для диагностики вирусных инфекций наиболее пригодны простые методы, позволяющие быстро исследовать большое число проб биоматериала. Помимо установления этиологии заболевания, лабораторная диагностика имеет существенное значение в организации противоэпизоотических мероприятий. Ранняя диагностика первых случаев проявления вирусных болезней позволяет своевременно организовать и провести профилактические мероприятия. Реализация программ вакцинации вирусных инфекций, а также программ их эрадикации, которые реализуются в некоторых странах Европы, невозможны без тщательно спланированных программ диагностических исследований, роль которых при респираторных болезнях животных постоянно возрастает.

В связи с тем, что многие возбудители вирусной природы могут постоянно присутствовать в популяции восприимчивых животных, в лабораторной диагностике вирусных инфекций используются три основных принципа:

1. Выявление антигенов вируса или его нуклеиновых кислот непосредственно в исследуемом материале от животных;

2. Выделение и идентификация вирусов из проб биоматериала от больных животных;

3. Ретроспективная серологическая диагностика болезней, основанная на установлении диагностического (4-х и более кратного) прироста титров специфических антител к вирусам при исследовании парных проб сыворотки крови (сероконверсиия), свидетельствующая об активной вирусной инфекции.

При любом выбранном подходе к лабораторной диагностике вирусных инфекций основным требованием являются сроки отбора и качество биоматиериала, отобранного от животных. Для прямого анализа проб биоматериала или выделения вируса исследуемый материал должен быть получен в самом начале заболевания, когда возбудитель еще выделяется от инфицированного животного в относительно больших количествах и не связан с антителами. Объем проб должен быть достаточен для проведения прямого исследования. Важно также определить источник отбора проб биоматериала в соответствии с предполагаемым заболеванием, т. е. тех органов или тканей организма, в которых, исходя из патогенеза болезни, вероятность присутствия вируса наиболее высока. Большую роль в успешной диагностике играют условия транспортировки биоматериала, вид транспортной среды и его хранение. Пробы биоматериала должны отбираться не позднее 4-х часов после гибели или вынужденного убоя животных и транспортироваться в диагностическую лабораторию в замороженном состоянии в термосе со льдом.

Для установления сероконверсии первая проба сыворотки крови должна отбираться на ранних стадиях проявления болезней (не позднее 3-5 дней после появления первых клинических признаков), а вторая в период выздоровления или реконвалесценции через 3-4 недели после отбора первой пробы. Первая проба хранится в замороженном виде до взятия второй, транспортируются они в лабораторию вместе, где исследуются одномоментно. Пробы сыворотки крови должны отбираться в стерильные пробирки, не должны быть гемолизированы, контаминированы бактериальной флорой и не содержать консервантов. Транспортировка их должна осуществляться в замороженном виде в термосе со льдом.

Прямые методы диагностики вирусных болезней -- это методы, позволяющие обнаружить вирус, его антиген или нуклеиновую кислоту непосредственно в пробах биологического материала, являющиеся наиболее быстрыми (2--24 ч). К ним относятся: электронная микроскопия, метод флуоресцирующих антител (МФА), иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунный анализ (РИА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако эти методы имеют свои ограничения, поскольку существует возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Поэтому они требуют подтверждения непрямыми методами. Как правило, использование этих методов регламентируется массовыми (скрининговыми) исследованиями, а результаты их носят предварительный характер. вирусный инфекция иммуноферментный антиген

Непрямые методы диагностики вирусных болезней. К ним относятся: выделение и идентификация вирусов в чувствительных биологических системах (культуры клеток, куриные эмбрионы, лабораторные животные), а также реакция нейтрализации вируса, проводимая с использованием этих же систем.

Выделение вируса по-прежнему остается стандартным или референтным методом вирусологической диагностики и дает информацию для решения многих вопросов. С использованием этого метода удается расшифровать этиологию болезни, установить циркуляцию вирусов среди обследуемой популяции крупного рогатого скота, получить информацию об эпизоотической ситуации в стаде животных на конкретной территории. Однако он является дорогостоящим и трудоемким.

Для исследования от больных животных отбирают носовые выделения, смывы и соскобы с носовой полости, сыворотку крови, от погибших -- кусочки слизистой носа, трахеи, бронхов, легких, а также регионарные лимфоузлы. Патологический материал направляют в термосе со льдом. Из соскобов слизистой оболочки носа, трахеи, бронхов делают мазки, а из кусочков легкого -- мазкиотпечатки для иммунофлюоресцентного исследования. Из кусочков органов готовят суспензию для заражения культур клеток и приготовления комплемент связывающего и преципитирующего антигенов.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ, ИФА (Enzyme immunoassay) -- метод выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями.

Для определения антигенов и антител применяются твердофазный (гетерогенный) вариант иммуноферментного анализа. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции.

Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами детекции антигенов и антител обладает следующими преимуществами:

-- высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;

· возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;

-- стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);

-- простотой проведения реакции;

-- наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;

-- возможностью автоматизации всех этапов реакции

-- относительно низкой стоимостью диагностических наборов.

Вышеперечисленные преимущества определили широкое применение ИФА во всех областях медицины, в том числе и при диагностике, профилактике и изучении вирусных гепатитов . Диагностические препараты для ИФА, предназначенные для выявления большинства серологических маркеров инфицирования вирусами гепатитов А, В, С и D выпускаются различными предприятиями и фирмами как у нас в стране, так и за рубежом.

В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических препаратов используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или полистироловые шарики [фирмы “ДИА-плюс”, “Рош” (“ROCHE”), “ЭББОТТ” (“АВВОТТ”)]. Основные требования, предъявляемые к твердой фазе при проведении ИФА, включают: устойчивость к растворам, используемым в реакции;

наличие высокой специфической емкости, т. е. способности сорбировать на своей поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов.

Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция, когда часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы.

В настоящее время разработаны различные варианты твердофазного иммуноферментного анализа, и практически все они были апробированы или применены для выявления маркеров инфицирования вирусами гепатитов А, В, С, D и Е. Наиболее простой схемой проведения ИФА является “сэндвич”-метод. Общая схема проведения метода заключается в следующем . На твердой фазе адсорбированы антитела к исследуемому антигену После инкубации исследуемого материала и образования комплекса антитело -- антиген проводится удаление несвязавшихся компонентов, добавляется коньюгат, т. е. антитела к искомому антигену, меченые ферментом. По завершении инкубации с последующим удалением непрореагировавшего коньюгата промывкой образуется комплекс, в котором антиген как бы заключен между двумя слоями антител. Наличие меченных ферментом антител определяется при помощи соответствующего субстрата. “Сэндвич”-метод используется для выявления HBsAg, HBeAg, антигена вируса гепатита А. Для ускорения “сэндвич”-метода, применяется его модификация -- “одностадийный сэндвич-метод”, при которой добавление исследуемого материала и коньюгата проводится одновременно. При использовании диагностических наборов ИФА, основанных на этой схеме проведения реакции, необходимо помнить, что в исследуемом образце не должно быть веществ, ингибирующих активность фермента, т. н. ферментных ядов, (например, азида натрия, применяемого в качестве консерванта). Одной из особенностей этого метода является снижение оптической плотности ферментативной реакции с образцами, имеющими крайне высокую концентрацию исследуемого антигена за счет образования комплекса HBsAg и коньюгата в растворе. Однако тщательный подбор концентрации меченых антител в коньюгате представляемого диагностического набора устраняет возможность получения ложнонегативных результатов с образцами, имеющими высокую концентрацию HBsAg.

Для выявления антител к различным антигенам вирусов гепатитов А, В, С и D применяются разнообразные варианты постановки ИФА, основными из которых являются:

1. Метод с использованием меченых вторичных антител (антител против иммуноглобулинов человека) и иммобилизированных антигенов на твердой фазе. Метод применяется для определения антител к вирусу гепатита С. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 21): на твердой фазе иммобилизуют антиген, после инкубации исследуемого материала и удаления несвязавшихся компонентов добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам человека класса IgG, которые взаимодействуют с Fc-фрагментом анти-ВГС. После проведения субстрат-ферментативной реакции проводят учет полученных результатов. При наличии антител уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных образцов. Для уменьшения возможных неспецифических реакций вводится специальный коэффициент, указанный в наставлениях, прилагаемых к диагностическим наборам.

2. Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованного на твердой фазе антигена. Метод используется для выявления анти-HBs в диагностическом наборе “AUSAB” EIA фирмы “ЭББОТТ”. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 22): на полистироловом шарике адсорбирован HBsAg субтипа ad и ау, после инкубации с исследуемым материалом и удаления непрореагировавших компонентов добавляется HBsAg, меченный ферментом, который взамодействует со свободными центрами связывания антител к HBsAg, провзаимодействовавшими с антигеном, сорбированным на твердой фазе. При наличии антител в исследуемой пробе уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных контрольных образцов.

3. Метод с использованием меченых и иммобилизованных антител, а также стандартного антигена. Этот вариант метода применяют для выявления анти-HBs и анти-НВе с диагностикумами фирмы (“ДИАплюс”). Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 23 ): на первом этапе реакции исследуемый образец смешивают с раствором, содержащим фиксированное количество антигена. После завершения инкубации добавляют шарик с сорбированными на нем антителами и коньюгат. После удаления непрореагировавших компонентов реакции проводится ферментативная реакция, интенсивность которой обратно пропорциональна содержанию исследуемых антител в образце. Вариантом этой схемы может служить определение анти-НВе и анти-дельта с диагностикумами фирмы “ЭББОТТ”, когда компоненты реакции добавляются последовательно.

4. Метод с использованием меченых антител и иммобилизованного антигена (конкурентный метод). Данная схема широко применяется для выявления анти-HBs, анти-НВс и анти-ВГА. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 24): к антигену, иммобилизованному на твердой фазе одновременно добавляют исследуемый материал и коньюгат. При проведении реакции меченые и исследуемые антитела конкурируют за активные центры антигена, иммобилизованного на твердой фазе. После завершения инкубации и удаления не прореагировавших компонентов проводится ферментативная реакция, результаты которой обратно пропорциональны количеству антител в исследуемом образце. При использовании набора фирмы (“ДИАплюс”) при выявлении анти-HBs, в случае наличия HBsAg уровень ферментативной реакции будет превосходить результаты реакции в негативных образцах, что позволяет косвенно судить о наличии антигена.

5. Метод выявления антител класса IgM - многослойный “сэндвич” метод. Этот метод применяется для выявления анти-НВс IgM и анти-ВГА IgM. Общая схема проведения реакции заключается в следующем (рис. 25): на твердой фазе адсорбированы антитела к мю-цепям иммуноглобулинов класса М, которые взаимодействуют с антителами класса IgM, находящимися в исследуемой сыворотке. После удаления непрореагировавших компонентов добавляется стандартное количество антигена, антитела против которого определяются. Удалив непрореагировавшие компоненты реакции, добавляют меченые антитела, реагирующие с антигеном. Также, как и в обычном “сэндвич”-методе, чем больше количество антител, тем интенсивней ферментативная реакция. Для уменьшения ложнопозитивных результатов исследование сывороток крови проводится после их разведения в 1000 раз.

Размещено на Allbest.ru