Ветеринарно-санитарная экспертиза спермы сельскохозяйственных животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

Тема: "Ветеринарно-санитарная экспертиза спермы сельскохозяйственных животных"

Выполнила: Ватолина М.Н.

Студентка 2 курса ФВМиЭ

Очной формы обучения

Направление подготовки 36.03.01

"Ветеринарно-санитарная экспертиза"

Проверил: Таранова Л.А.



Введение

В настоящее время в сельском хозяйстве для разведения сельскохозяйственных животных активно применяется на практике метод искусственного осеменения спермой животных-производителей. Для эффективного осеменения немаловажным является качество спермы. От качества спермы зависят не только высокие результаты оплодотворяемости маток, но и ветеринарно-санитарное и санитарно-эпидемиологическое благополучие хозяйства, а также прилегающей территории.

Животное-донор, от которого отбирают сперму, должно быть клинически здоровым и иметь отрицательные результаты лабораторных исследований, проведённых согласно действующим ветеринарно-санитарным правилам, на следующие инфекционные болезни: бруцеллёз, туберкулёз, кампилобактериоз, паратуберкулёзный энтерит, лептоспироз, инфекционный ринотрахеит, хламидиозный аборт, лейкоз, трихомоноз, вирусная диарея.

Ветеринарно-санитарный контроль качества спермы проводят по следующим пунктам:

Оценка качества эякулята

Микробиологическое исследование эякулята



1. Отбор проб и доставка их для исследования

Исследование спермы является основным критерием для суждения о репродуктивной способности самца. Для проведения такого исследования необходимо получить эякулят.

В помещении (манеже), где получают сперму, в 1м3 воздуха должно содержаться не более 20 тыс. микробных клеток. Перед началом работы помещения, где получают сперму, обеззараживают бактерицидными лампами из расчета 45-60 минут, которые выключают не менее, чем за 30 минут до начала работы. Манеж увлажняют распылением слабодезинфипирующих растворов, приготовленных на кипяченой воде.

Если помещения контаминированы устойчивыми к ультрафиолетовым лучам микробами или плесенью, то обработку проводят парами формальдегида в свободный от взятия спермы день.

Пробы спермы получают после соответствующей подготовки самого производителя, манекена и инструментов, необходимых при взятии проб.

Пробы спермы получают только при помощи асептически приготовленной искусственной вагины. Из спермоприёмника пробу берут в стерильной камере (УНБК-1) или стерильном боксе при помощи стеклянной пипетки из средней части эякулята при слегка приподнятой крышке спермоприёмника, переносят её в сухую стерильную пробирку и закрывают её притёртой пробкой над пламенем спиртовой горелки.

Для получения смыва в полость препуция вводят при помощи стерильного шприца и резиновой трубки 10 мл стерильного физиологического раствора поваренной соли, правой рукой зажимают кожу у входа в препуций вместе с резиновой трубкой, а левой проводят лёгкий массаж в течение 1-2 минут, перемещая раствор в полости. После этого пробу смыва насасывают поршнем шприца через резиновую трубку и переносят её в стерильную пробирку.

Пробы для исследования направляют в лабораторию в следующих количествах:

- неразбавленная сперма - не менее 1 мл;

- смыв с поверхности препуция - 5-10 мл.

На пробирке, флаконе наклеивают этикетки с указанием номера пробы и доставляют в лабораторию в термосе или ящике. Если время транспортировки проб до лаборатории будет превышать 2 часа, то в термос необходимо положить лёд, на который кладут флаконы, обёрнутые ватой (температура 2-4 оС). С момента взятия проб до начала исследования допускается их хранение не более 6 часов при температуре 2-4 оС и не более двух часов при более высокой температуре. Замороженную сперму транспортируют в термосе с жидким азотом.

2. Оценка качества эякулята

Оценка качества эякулята по внешним показателям.

Взятый эякулят подвергают макроскопической оценке. Сперму оценивают визуально по объёму, цвету, консистенции, запаху.

Объём. Объём эякулята быка и барана определяют с помощью градуированного спермоприёмника, пробирки, а эякулят жеребца и хряка мензуркой или мерным цилиндром. Объём эякулята в одноразовом спермоприёмнике определяют путём взвешивания. Масса 1 г спермы соответствует 1 мл (таблица 1).

Таблица 1 - Объем эякулята у самцов с/х животных

Производитель	Средний объём эякулята, мл	Колебяние эякулята, мл
Баран	1,0 - 2,0	0,5 - 3,5
Бык	4,0 - 5,0	1 - 15
Хряк	200 - 400	100 - 1000
Жеребец	50 - 100	20 - 200



Если производитель выделяет слишком мало спермы, это свидетельствует не только о нарушении рефлекса эякуляции, но и о серьёзных погрешностях в кормлении, содержании, эксплуатации.

Цвет. Сперму осматривают при хорошем освещении. У быка и барана нормальная сперма белого цвета с желтоватым оттенком. У хряка и жеребца - молочно-белая с сероватым оттенком.

Розовый и красный цвет спермы означает, что в неё попала кровь. Зеленоватый цвет указывает на наличие гноя. Интенсивно жёлтое окрашивание отмечается при попадании мочи.

Консистенция. Нормальная сперма барана имеет сметанообразную консистенцию, быка - сливкообразную, у хряка и жеребца - водянистую. Консистенция должна быть однородной. Наличие хлопьев, примесей свидетельствует о низком качестве спермы.

Запах. Нормальная сперма не имеет особого запаха. Иногда сперма быка может иметь слабый запах парного молока, а барана - жиропота.Наличие гнилостного запаха указывает на патологические процессы в половых органах производителя.

Если внешние признаки эякулята имеют отклонение от нормальных показателей, то такую сперму бракуют и для работы не используют. Производитель должен быть всесторонне исследован и подвергнут соответствующему лечению. Ему необходимо создать особый режим содержания и использования.

Определение густоты и подвижности спермиев

Определение густоты спермы. Густота спермы зависит от количества спермиев в эякуляте и степени разбавления спермы секретами придаточных половых желез. Оценку густоты производят под микроскопом в раздавленной капле.

Устанавливают равномерное освещение поля зрения. Спермии лучше просматривать в неярком свете. Для этого прикрывают диафрагму и опускают конденсор микроскопа. На предметный столик микроскопа помещают термостолик или обогревательный столик Морозова. В обогревательный столик предварительно наливают горячую воду (60 - 65 оС). Через боковое отверстие в обогревательном столике измеряют температуру. К моменту оценки она должна составлять 40-42°С.

Приготовление препарата: на чистое обезжиренное предметное стекло стеклянной палочкой или пипеткой наносят каплю исследуемой спермы и накрывают покровным стеклом, таким образом, чтобы под стеклом не образовались пузырьки воздуха. Свежеполученная сперма очень чувствительна к температурным колебаниям. Чтобы не допустить температурного шока спермиев предметное стекло должно быть тёплым, а температура воздуха в лаборатории не менее 20 оС. В зависимости от насыщенности спермиями неразбавленная сперма может иметь следующие оценки: густая (Г), средняя (С), редкая (Р).

Сперму считают густой, когда все поле зрения микроскопа заполнено спермиями. Между отдельными спермиями почти не видно промежутков. В густой сперме трудно различить движение отдельных спермиев.

Средняя сперма - в поле зрения заметны промежутки между спермиями, хорошо различимо движение отдельных спермиев.

Редкая сперма - спермии размещены в поле зрения микроскопа так, что между отдельными спермиями имеются промежутки, значительно больше размера самих спермиев. Неразбавленная сперма производителей сельскохозяйственных животных в зависимости от густоты содержит в 1 мл следующее количество спермиев (таблица 2):

Таблица 2 - Концентрация спермиев в млрд/мл

Производитель	густая (Г)	средняя (С)	редкая (Р)
Баран	>2	1 - 2	<1
Бык	>1	0,6 - 1	<0,6
Хряк	>0,2	0,1 - 0,2	<0,1
Жеребец	>0,25	0,15 - 0,25	<0,15



Олигоспермия - слишком малое количество спермиев в эякуляте. Аспермия - отсутствие спермиев в сперме.

К использованию допускается: сперма барана - только густая, сперма быка, хряка, жеребца - густая и средняя.

Определение подвижности спермиев. Оценку качества спермы по подвижности спермиев проводят под микроскопом в раздавленной капле, как правило, после определения густоты.

Различают следующие виды движения спермиев: прямолинейно - поступательное (нормальное), манежное и колебательное (не нормальное), кроме того, спермии могут быть неподвижными.

Прямолинейно - поступательное движение (ППД) характеризуется правильным линейным перемещением спермиев в поле зрения. Только спермии, обладающие прямолинейным поступательным движением способны двигаться самостоятельно в половых путях самки и участвовать в процессе оплодотворения.

Манежное (круговое) движение (М) характеризуется вращением спермия вокруг головки или по небольшому кругу. У млекопитающих такой вид движения считается ненормальным. Манежное движение свидетельствует о неполноценности спермия, дефектах отдельных его частей, оболочки или изменения электрического потенциала.

Колебательное движение (К) - характеризуется слабым движением хвоста спермия, не приводящим к перемещению последнего. Колебательное движение признак неполноценности или наступающей гибели спермия.

Неподвижные спермии (Н) - некроспермия свидетельствует о их гибели.

Подвижность спермиев оценивают по 10-ти бальной системе. Каждый балл равен 10% спермиев, обладающих прямолинейно - поступательным движением. Высшую оценку 10 баллов получает сперма, в которой все (100%) спермиев имеют прямолинейно - поступательное движение (ППД). Другие виды движения (колебательное, манежное) не учитывают.

При оценке спермы по густоте и подвижности спермиев применяют комплексное обозначение. Например, Г - 9, это означает, что исследуемая сперма густая и 90% спермиев обладает прямолинейно - поступательным движением и т.д. В отдельных, особенно густых эякулятах, в момент взятия спермы, не все спермии успевают полностью выйти из состояния неподвижности, проявляя при этом слабое движение. Такую сперму необходимо исследовать после добавления к ней подогретого до 38-40 С 2,9%-ного раствора натрия лимоннокислого.

Определение процентного отношения нормальных и патологических форм спермиев

В каждом эякуляте могут содержаться деформированные спермии (патологические). Увеличение их количества выше допустимых пределов свидетельствует о патологических процессах в половых органах самца.

К числу патологических форм спермиев относят: гигантские и карликовые, с деформацией головки, с двумя головками, с надломом шейки, изолированные головки, с искривленным или закругленным хвостом, с двумя хвостами, утолщением хвоста и др.

Свежеполученную сперму с целью уменьшения концентрации спермиев и удобства подсчета в мазке необходимо разбавить раствором натрия хлорида. Сперму барана разбавляют в 20-30 раз, сперму быка в 10-15 раз, сперму хряка и жеребца в 2-3 раза. На предметном стекле делают тонкий мазок спермы методом стекающей капли. Для чего на один конец предметного стекла пипеткой наносят каплю и дают ей стечь, удерживая стекло под углом 40-50о. Приготовленный мазок высушивают на воздухе, а затем фиксируют. Для фиксации предметное стекло кладут горизонтально на специальную подставку и с помощью глазной пипетки на всю поверхность мазка наносят 96о спирт-ректификат. Через 1-2 минуты зафиксированный мазок ополаскивают дистиллированной водой и окрашивают. Окраску проводят 2%-ным раствором эозина. На мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, и глазной пипеткой, обильно наносят раствор эозина. Через 4-5 минут полоску фильтровальной бумаги снимают, а краску смывают дистиллированной водой. Мазок высушивают на воздухе, предварительно удалив фильтровальной бумагой капли воды.

Исследование мазка проводят под увеличением 400-600 раз. Передвигая мазок, подсчитывают в каждом поле зрения все спермии. Учитывают отдельно нормальные и патологические. Общее количество подсчитанных спермиев должно быть не менее 500. Вычисляют процент патологических. Пример: Всего подсчитано 500 спермиев, в том числе 50 патологических.

Х = (50 * 100)/500 = 10%

Чем меньше в эякуляте производителя патологических спермиев, тем выше оплодотворяющая способность спермы. Максимальный допустимый процент спермиев в сперме: барана - 14%, быка - 18%, хряка и жеребца - 20%.

3. Определение концентрации спермиев в сперме производителей

Определение концентрации спермиев в счетной камере.

Концентрация спермиев в сперме -- это степень насыщенности спермы сперматозоидами. Она выражается количеством спермиев в 1 мл в миллиардах.

Определение концентрации спермиев в сперме складывается из: разбавления спермы в смесителе; подготовки счетной камеры; зарядки счетной камеры; подсчета спермиев; вычисления концентрации исследуемой спермы.

Разбавление спермы в меланже. Для определения концентрации спермиев необходимо разбавить сперму в строго определенное количество раз. Для спермы быка и барана применяют эритроцитарный смеситель (с красным шариком), а для спермы хряка и жеребца - лейкоцитарный (с белым шариком).

В меланжер набирают сперму до метки 0,5, а затем 3-ный раствор натрия хлорида до верхней метки. Эту работу необходимо выполнить очень точно. Зажимают большим и указательным пальцами оба конца меланжера и встряхивают его в течение 2-3 минут до полного перемешивания спермы с раствором.

Подготовка счетной камеры. Счетная камера с сеткой Горяева -- это толстое предметное стекло, поверхность которого бороздками разделена на три части. На среднем, окруженном бороздками поле, находится счетная сетка, площадь которой равна 9 мм2. Это поле разделено на 225 больших квадратов, из них 25 в свою очередь разделены на 16 малых квадратиков. Площадь каждого малого квадратика составляет 1/400 мм2.

Счетную камеру и покровное стекло протирают тампоном, смоченным в смеси спирта и эфира (поровну). Вытирают насухо марлевой салфеткой. Покрывают камеру покровным стеклом и притирают стекло к крайним пластинкам до появления радужных колец.

Зарядка счетной камеры. Из капилляра меланжера удаляют на сухой тампон первые 2-3 капли разбавленной спермы, 4-5-ую капли наносят на среднюю часть камеры у самого края притертого покровного стекла.

Подсчет спермиев. Камеру помещают на предметный столик микроскопа. Под малым увеличением находят сетку камеры, а затем переводят увеличение в 200-300 раз. Подсчет спермиев производят в 5-ти больших квадратах, которые разделены на маленькие. Считают в квадратах, расположенных по диагонали или по углам и в центре. Считают головки спермиев, расположенные внутри маленьких квадратов, и на верхней и левой линиях.

Вычисление концентрации спермиев. Концентрацию спермиев определяют по формуле:

С = (400 П.Д)/(N Р.1000000),



где: С - концентрация спермиев;

П -- число подсчитанных спермиев;

Д -- степень разбавления;

N - число сосчитанных малых квадратов (80);

Р - глубина камеры (О, 1 мм); 400 - множитель, введен в формулу для пересчета в 1 мм, так как площадь малого квадрата равна 1/400 мм2.

Для точности определения концентрации спермиев рекомендуется заправлять обе сетки и при подсчете брать средний показатель. Расхождение результатов не должно превышать 10%. Если разница больше 10%, подсчет повторяют третий раз и берут среднее из двух подсчетов, расходящихся не более чем на 10%.

Определение концентрации спермиев на фотоэлектроколориметре ФЭК-М.

Метод определения концентрации спермиев при помощи ФЭК-М основан на способности спермы ослаблять пропускаемый через нее пучок света пропорционально концентрации спермиев, то есть чем выше концентрация спермиев, тем больше ослабляется проходящий пучок света. Величина ослабления светового пучка регистрируется чувствительными фотоэлементами.

Определение концентрации на ФЭК-М начинают спустя 15-20 минут после включения лампы и засветки фотоэлементов. Для повышения точности исследований рукояткой устанавливают красные светофильтры. Левый отсчетный барабан рукояткой выставляют на "О" по красной шкале (шкала оптической плотности).

Во флакон наливают 10 мл 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого вносят в него 0,1 мл спермы быка (сперма разбавляется в соотношении 1:100). Сперму барана разбавляют в соотношении 1: 400, то есть берут 10 мл 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого и 0,025 мл спермы. Сперму хряка разбавляют в соотношении 1: 30, то есть к 12 мл 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого добавляют 0,4 мл спермы, которая предварительно должна быть профильтрована через 2 слоя капроновой ткани для отделения студенистого секрета.

Перед внесением пробы спермы в раствор микропипетку необходимо снаружи вытереть чистой марлевой салфеткой. После внесения спермы в раствор микропипетку надо 2-3 раза прополоскать в этом же растворе путем насасывания и выдувания. Температура 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого должна быть в пределах 18-25 оС.

После разбавления сперму тщательно перемешивают и наливают в кювету с рабочей длиной 10 мл до метки и быстро определяют оптическую плотность. Для этого на путь прохождения пучка света ставят в левый кюветодержатель чистую кювету с рабочей длиной 10 мм, наполненную 3,5%-ч раствором натрия лимоннокислого, а в правый кюветодержатель - 2 такие-к же кюветы: одну с разбавленной спермой, другую с 3,5%-ным раствором натрия лимоннокислого. При этом кювету с разбавленной спермой устанавливают на пути прохождения пучка света (как и в левом кюветодержателе), а кювету с раствором в запасное гнездо этого же кюветодержателя. Кюветы необходимо устанавливать перпендикулярно к пучку света.

Закрывают крышку прибора и включают гальванометр рукояткой сначала на грубую чувствительность в положение "1". Рукояткой нейтральных клиньев подводят стрелку гальванометра к "0", затем включают гальванометр на высокую чувствительность, в положение "2" и точно устанавливают стрелку на "0". Затем гальванометр сразу же переводят на грубую чувствительность в положение "1". Меняют в правом кюветодержателе местами кюветы так, чтобы на пути прохождения света стала кювета с 3,5%-ным раствором натрия лимоннокислого. Это достигается путем поворота кюветодержателя вокруг оси.

Опустив крышку прибора, опять включают гальванометр сначала на грубую чувствительность (не трогая ручку нейтральных клиньев) рукояткой барабана подводят отклонившуюся стрелку гальванометра на "0". Включают гальванометр на высокую чувствительность, точно устанавливают стрелку на "0", Рукоятку гальванометра переводят в положение "0".

Отсчет берут по красной шкале левого барабана и смотрят, какой величине концентрации он соответствует на калибровочной кривой, которую выводят заранее.

Построение калибровочной кривой. Для определения концентрации спермиев на ФЭК-М необходимо предварительно построить калибровочную кривую, изображающую зависимость оптической плотности от концентрации змиев.

Для построения калибровочной кривой из свежевзятых эякулятов выбирают несколько таких, в которых концентрация спермиев наиболее высокая. Тщательно определяют концентрацию спермиев в счетной камере.

Из отобранных эякулятов путем разбавления их 3,5%-ным раствором лимоннокислого натрия 1: 1, 1: 2, 1: 3 и т.д. готовят ряд образцов спермы и определяют концентрацию спермиев в каждом из них в счетной камере.

Определяют величину оптической плотности каждого образца на приборе, как описано в предыдущей методике. Зная фактическую концентрацию спермиев, установленную в счетной камере, строят калибровочную кривую. Для этого на миллиметровой бумаге откладывают: по горизонтальной оси - известные концентрации спермиев каждого образца, по вертикальной оси - соответствующие им величины оптической плотности. В местах пересечения перпендикуляров ставят точки, калибровочную кривую проводят так, чтобы она прошла через большинство указанных точек, а число точек, лежащих выше или ниже калибровочной кривой, было примерно одинаковым.

Кривая не должна быть сильно изогнутой или изломанной.

Имея калибровочную кривую, можно легко определить неизвестную концентрацию спермиев любого эякулята. Для этого нужно лишь установить его оптическую плотность на приборе, как указано выше и посмотреть какой причине концентрации она соответствует на калибровочной кривой. При этом следует строго соблюдать все условия исследования, при которых выведена и калибровочная кривая. Надо применять ту же кратность разбавления спермы, использовать кюветы той же рабочей длины, те же светофильтры и тот же способ отсчета величин оптической плотности.

Калибровочную кривую следует ежемесячно проверять, так как показания прибора могут изменяться.

Точность электрофотометрического метода определения концентрации спермиев и источник ошибок. По точности электрофотометрический метода определения концентрации спермиев почти не уступает методу определения в счетных камерах. Величина ошибки колеблется в пределах 6%.

Эта величина ошибки обусловлена в основном влиянием плазмы спермы и неточностью взятия проб. Влияние пигментации плазмы на точность результатов исследования ослабляется применением красных монохроматических светофильтров.

4. Определение концентрации спермиев хряка при помощи оптического стандарта

В пустую пробирку вносят 1,0 мл 1%-ного раствора натрия хлорида. Микропипеткой набирают 0,1 мл свежеполученной профильтрованной спермы. Конец пипетки вытирают снаружи салфеткой, а затем два раза промывают ее раствором в пробирке. Пробирку слегка встряхивают и держат рядом со стандартом. Стандарт предварительно должен быть хорошо взболтан. К пробиркам сзади вплотную прикладывают лист с печатным текстом.

К исследуемой сперме добавляют пипеткой 1%-ный раствор натрия хлорида в таком количестве, чтобы высота букв шрифта и оптическая плотность были одинаковы со стандартом. Каждый раз при добавлении раствора содержимое пробирки и стандарт встряхивают для получения равномерной взвеси.

После того как оптическая плотность исследуемой спермы и стандарта совпадут, проводят расчет по формуле:

К = 50 (n + 0,1),

где: К - концентрация спермы (млн./мл);

n - объем внесенного 1%-ного раствора натрия хлорида (мл);

50 - коэффициент.

Оптический стандарт соответствует оптической плотности спермы хряков с концентрацией спермиев 5 млн./мл. Пример: Для выравнивания оптической плотности до стандарта к исследуемой сперме добавлено всего 4,5 мл 1%-ного раствора натрия хлорида (с учетом ранее налитого в пустую пробирку).

К = 50 х (4,5 + 0,1) = 50 х 4,6 = 230 (млн./мл)

Следовательно, в 1 мл исследуемой спермы содержится 230 млн. спермиев.

Определение концентрации спермиев жеребца по стандартам

Стандарты представляют собой стеклянные запаянные пробирки одинакового диаметра, с жидкостью имитирующей сперму жеребца разной концентрации: 10 - 20 - 200 - 300 и 500 млн. спермиев в 1 мл.

Сперму наливают в прилагаемую пустую пробирку такого же диаметра, и сравнивают со стандартом. Стандарты, предварительно встряхивают, чтобы осадок равномерно размешался. Пробирки просматривают на свет, при этом подбирают стандарт, наиболее близкий по густоте к определяемой сперме, который и принимают за ее концентрацию. Концентрация спермиев может быть определена и как промежуточная между двумя стандартами.

При концентрации более 500 млн. спермиев в 1 мл сперму можно разбавлять 7%-ным раствором глюкозы в 2 раза (1: 1), затем установить концентрацию по стандартам и сделать соответствующий пересчет на неразбавленную сперму.

Для большей точности определения к сравниваемым пробиркам сзади вплотную прикладывают стеклянную палочку.

Определение интенсивности дыхания спермиев

Метод основывается на том, что в анаэробных условиях спермин используют для дыхания кислород из молекул метиленового синего, в результате чего раствор обесцвечивается. Поскольку дыхание происходит под влиянием дегидрогеназы, то по существу скорость обесцвечивания раствора метиленового синего показывает активность названного энзима.

Для определения на теплое (30-370С) предметное стекло наносят каплю, спермы и каплю метиленового синего (30 0С). Капли быстро перемешивают, и смесь набирают в два теплых стеклянных капилляра длина которых должна быть не менее 5-6 см и диаметр 0,8-1,0 мм. Длина столба в трубке должна быть примерно 2-3 см. В столбе смеси не должно быть пузырьков воздуха. Капилляры кладут горизонтально и помещают в термостат (+ 37 0С) на белую бумагу. Регистрируют время (таблица 3), в течение которого обесцвечивается раствор метиленового синего.

Таблица 3 - Оценка качества спермы по времени обесцвечивания метиленовой сини (в минутах)

Качество спермы	Бык	Баран
Хорошее	5 - 10	3 - 7
Среднее	11 - 30	8 - 12
Плохое (непригодное для использования)	более 30	более 12

Результат является более объективным, если вычисляют и активность дегидрогеназы, поскольку с помощью этого показателя учитывается как подвижность спермиев, так и их концентрация.

Активность дегидрогеназы в условных единицах получают по формуле:



Да = (ПсЧtЧС)/10,

где:

Да - активность дегидрогеназы;

Пс - подвижность спермиев в баллах;

t - время обесцвечивания раствора метиленового синего в минутах;

С - концентрация спермиев (млрд./мл).

Допустимая активность дегидрогеназы должна быть в сперме быка в пределах 16,8 у. е., для барана 9,6 у. е. пределах 16,8 у. е., для барана 9,6 у. е.

Определение абсолютной выживаемости спермиев

Под выживаемостью спермиев подразумевают продолжительность их жизни вне организма в определенных условиях. Это важный показатель качества спермы, поскольку он дает возможность предсказать оплодотворяющую способность спермы. Выживаемость спермиев выражается абсолютной выживаемостью (S).

Для определения абсолютного показателя выживаемости спермиев берут 11 стерильных пробирок емкостью по 2 мл и нумеруют восковым карандашом. Во все пробирки, за исключением первой, наливают по 0,5 мл синтетической среды. В первую и вторую пробирки вносят по 0,5 мл неразбавленной спермы. Первая пробирка в дальнейшем служит контролем.

Сперму во второй пробирке тщательно перемешивают со средой путем пипетирования и из нее переносят 0,5 мл в третью пробирку; в третьей пробирке смесь перемешивают и переносят в четвертую и т.д. Из последней пробирки (11-ой) 0,5 мл смеси выливают. Таким образом, в первой пробирке сперма не разбавленная, а в пробирках со 2 по 11-ую сперма разбавлена в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 раза.

Из каждой пробирки на теплое предметное стекло берут каплю, спермы и оценивают подвижность. Пробирки устанавливают в штатив, закрывают стерильными пробками и ставят на хранение в термос со льдом.

В последующем ежедневно оценивают подвижность спермиев под микроскопом при температуре 40 0С. Оценку подвижности проводят до установления гибели всех спермиев во всех пробирках. Результаты исследований заносят в таблицу. Показатель абсолютной выживаемости (S) определяют по формуле:

S = а 1t 1 + а 2t 2 + a 3t 3+ ... a nt n

где: а 1, а 2, а 3 , аn - подвижность спермиев за интервалы времени, в балах;

t1 , t 2 , t 3 , tn - последовательные интервалы времени, в часах. Интервалы времени в часах определяются по формуле:

t = (Т n+1 - Т n-1)/2

где: Т - часы опыта,

Т n+1 - время в часах от начала опыта до последующего определения подвижности;

Т n-1 - время в часах от начала опыта до предыдущего определения подвижности.

Хорошая сперма быка и барана, разбавленная синтетической средой в 16-32 раза, должна иметь показатель абсолютной выживаемости спермиев не ниже 1 400, хряка - 900, жеребца - 400 и выше.

5. Микробиологическое исследование эякулята

Исследование коли-титра спермы

Коли-титр определяют для санитарной оценки спермы. Санитарно-показательными бактериями считают все разновидности кишечной палочки, способные ферментировать в жидкой среде глюкозу и маннит с выделением кислоты и газа. Бактерии из группы кишечной палочки (БГКП) хорошо растут на МПА, МПБ при температуре 37 оС в течение 24 часов. На МПА образуют круглые, с выпуклым или слегка приподнятым центром, ровными краями, гладкие, прозрачные, с серо-голубым отливом сочные колонии, легко сливающиеся между собой.

Количество кишечной палочки, обнаруженной в сперме, выражают в виде коли-титра или коли-индекса. Таким образом исследованиями на коли-титр определяют степень обсеменённости исследуемого материала БГКП, что является показателем фекального загрязнения.

Коли-титр - наименьший объём или вес исследуемого материала, выраженный в мл или г, в котором обнаружена одна кишечная палочка.

Коли-индекс - число БГКП в 1 мл спермы или в 1 г сухого вещества.

Наиболее приемлем в практических условиях метод бродильных проб. С этой целью убывающие объёмы спермы высевают на специальные среды. При этом допускают, что попадание одной бактерии вызывает видимые изменения в среде. В ветеринарной практике широко апробирована среда Булира. Сперму не используют для искусственного осеменения животных при содержании БГКП, устойчивых к спермосану-3.

Определение микробной и грибковой загрязнённости спермы и препуция

Сперму высевают в чашки Петри на плотные питательные среды. Многие виды грибов растут на 2%-ном МПА с добавлением 1% глюкозы, на кровяном агаре, среде Сабуро и Чапека. Применение этих сред позволяет одновременно определять общее количество микробных тел в 1 мл спермы, стафилококков, трептококков и других м/о. Материал в объёме 0,3 - 1 мл стерильной пипеткой высевают на 3 - 4 чашки и стерильным стеклянным шпателем распределяют по всей среде. Чашки Петри помещают в термостат при температуре 22-37 оС от 10 до 45 суток, через каждые 2-3 суток проводят контроль за развитием колоний высших грибов. Из выросших колоний металлической иглой длиной 5-7 см, загнутой под углом 90о и вставленной в иглодержатель, очень осторожно, не допуская деформации мицелия, переносят часть колоний на поверхность питательной среды. Сперму, содержащую грибы аспергиллы, кандиды и мукоровые, бракуют, не прибегая к определению их патогенных свойств. В соответствии с требованиями в сперме, предназначенной для искусственного осеменения животных, не допускают содержание патогенных и условно-патогенных микроскопических грибов, которые способны вызывать заболевание половых органов и аборты.

Определение общей бактериальной загрязнённости

В стерильную пробирку помещаем 1 г или 0,5 г исследуемого препарата, добавляем 9 мл 0,9% стерильного раствора хлористого натрия, тщательно перемешивает и готовим последовательные разведения. Из каждого разведения берут по 0,5 мл раствора и высевают на 2%-ный МПА в чашки Петри, которые затем помещают в термостат и выдерживают при температуре 37 оС в течение 24-48 часов, а затем подсчитывают выросшие колонии.

Количество микробных тел (С) вычисляют по формуле:

C=(n*D)/(V*S),

где:

n - количество колоний, выросших в чашке;

D - разведение исследуемого вещества;

V - объём суспензии, высеянной в одну чашку, мл;

S - число чашек, учтённых при подсчёте колоний.

По бактериальной загрязнённости сперма делится на 5 степеней:

1 степень - нет микробных тел (стерильная);

2 степень - до 100 микробных тел (незначительно загрязнённая);

3 степень - до 2000 микробных тел (слабо загрязнённая);

4 степень - до 5000 микробных тел (средне загрязнённая);

5 степень - более 5000 микробных тел (сильнозагрязнённая).

Для искусственного осеменения можно использовать только сперму первых четырёх степеней, сперма 5 степени выбраковывается.

Исследование на наличие синегнойной палочки и анаэробной микрофлоры

Для выделения синегнойной палочки сперму или смыв из препуциального мешка высевают на МПБ с добавлением 1-2% сахара и помещают в термостат при температуре 37 оС на 6-7 суток. Рост становится заметным на 2-3 сутки (среда мутнеет, на поверхности образуется опалесцирующая плёнка и иногда зелёное кольцо). При росте синегнойной палочки, выделяемый ею пигмент пиоцианин постепенно окрашивает среду в зеленовато-голубоватый цвет. В окрашенных по Грамму мазках палочки грамотрицательные, располагаются поодиночке, парами и короткими цепочками. Сахара не сбраживают, пептонизируют бромтимоловое модоко, гидролизует мочевину, разжижает желатину и сыворотку крови, выделяет сероводород, образует индол, гемолизирует эритроциты. Такую сперму уничтожают.

Для выявления анаэробных микроорганизмов-контаминантов сперму или смывы из препуция высевают на 4 пробирки со средой Китто-Тароци из расчёта: неразбавленной спермы не менее 0,05 мл; разбавленной - не меньше 0,1 мл в каждую пробирку. Для уничтожения вегетативных форм бактерий 2 пробирки прогревают в водяной бане при температуре 80 оС в течение 20 минут. Затем все пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре 37 оС на 5-10 суток. Рост анаэробов (помутение среды, образование осадка, газообразование - запах прогорклого масла) может обнаруживаться через 5-6 часов (Clostridium perfringens) или через 2-3 суток (большинство анаэробов).

Для идентификации мазки окрашивают по Грамму и микроскопируют. Чаще всего отмечается рост дизентерийной и туберкулёзной палочки.

эякулят микробный бактериальный синегнойный



Заключение

Проведение ветеринарно-санитарного контроля качества спермы даёт нам следующие возможности:

определение репродуктивных способностей производителя;

повышение качества и количества эффективных оплодотворений при искусственном осеменении;

использование для искусственного осеменения только высококачественной спермы;

предупреждение распространения и развития целого ряда опасных инфекционных заболеваний.



Список литературы

1. Ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных, Н.И. Полянцев, В.В. Подберезный. - Феникс: - Ростов-на-Дону, 2001 год.

2. Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных, А.П. Студенцов, В.С. Шипилов, и др. - М.: КолосС, 2005 год.

3. Инструкция по технологии работы организаций по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов с/х животных. - М.: 2000 год.

4. Практикум по акушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных, В.Я. Никитин, М.Г. Миролюбов, В.П. Гончаров и др. - М.: КолосС, 2003 год.

5. Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения: Учебник для вузов по специальности "Ветеринария" и "Зоотехния", А.П. Студенцов, В.С. Шипилов, В.Я. Никитин и др. - М.: КолосС, 2005 год.

6. Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных, В.Г. Турков - Иваново, 1999 год.

7. Воспроизводство в промышленном животноводстве, Н. И. Полянцев - М: Росагропромиздат, 1990 год.

8. Условно-патогенная микрофлора и воспроизводительная функция самок Н. Н. Михайлов, И. Я. Чистяков, Ветеринария №12, 1970 год.

9. Воспроизводство животных, Н.Е. Козло. - М.: КолосС, 1984 год.

10. Ветеринарная микробиология и иммунология Н. А. Радчук, Г. В. Дунаев, Н. М. Колычев - М: Агропромиздат, 1999 год.

11. Ветеринарный контроль при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных Н. Г. Балашов - М: КолосС, 1980 год.

Размещено на Allbest.ru